Name: Un modelo de organoide cerebral humano de trasplante de células neurales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a evaluar el injerto de células neurales en organoides cerebrales humanos mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo permite el seguimiento a largo plazo de la integración celular in vitro.

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Los fondos para este trabajo fueron proporcionados a través de los fondos filantrópicos del IRIC de la fundación Marcelle y Jean Coutu y del Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. cuenta con el apoyo salarial de FRQS en forma de una beca Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). El M.I.I.R. contó con el apoyo de un Premio de Doctorado IRIC del Instituto de Investigación en Inmunología y Cáncer, una Bolsa de Pasaje Accélère de la maitrise au doctorat de la Universidad de Montreal y la Bolsa de Mérito de los Ciclos Superiores.

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<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
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<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
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<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Dado el gran interés en los enfoques terapéuticos celulares para el tratamiento de las lesiones del SNC/trastornos neurodegenerativos 1,2,3,4,5,6,7,8, los modelos de función celular en un entorno de trasplante están ganando importancia. En este artículo se presenta un método para el trasplante de NPCs humanas marcadas en organoides cerebrales humanos, junto con su seguimiento de células vivas y la evaluación del punto final mediante histología y tinción inmunofluorescente. Es importante destacar que demostramos que las células trasplantadas eran capaces de migrar, diferenciarse y persistir a largo plazo (4 meses) en el entorno de los organoides. Esta persistencia a largo plazo es un marcado aumento con respecto a la capacidad de mantenimiento de los cultivos de cortes de cerebro17. Este sistema es, por lo tanto, apropiado para examinar muchos de los comportamientos que uno necesitaría evaluar en un entorno terapéutico potencial, como la supervivencia, la proliferación y la diferenciación. De hecho, un estudio ortogonal demostró recientemente que las NPC trasplantadas se comportaron de manera similar en organoides cerebrales en comparación con las NPC trasplantadas en cerebros de ratón NSG20, confirmando así la utilidad de los organoides como receptores de trasplantes. Al tratarse de un sistema in vitro, también es sencillo añadir citoquinas o fármacos de interés. Esto podría utilizarse para comprender mejor los efectos de entornos específicos, como la inflamación y los inmunosupresores, en las células trasplantadas para imitar aún más lo que podrían encontrar en un entorno terapéutico. El protocolo de inmunofluorescencia cíclica que demostramos (basado en investigaciones previas21) amplía aún más el poder de este enfoque, permitiendo que una amplia gama de marcadores específicos de linaje y, potencialmente, de enfermedades se evalúen simultáneamente en una sola sección y, por lo tanto, permitiendo un seguimiento preciso de las células trasplantadas y su impacto en el tejido. Por supuesto, se podrían utilizar otros métodos de evaluación de puntos finales en su lugar, dependiendo de los objetivos del análisis. Por ejemplo, se podría utilizar el aclaramiento de tejidos con reconstrucción 3D si la morfología celular es de interés principal, o se podría utilizar la disociación seguida de citometría de flujo si el objetivo final es la cuantificación de tipos celulares específicos. Esperamos que este método sea fácilmente extensible a otros tipos de células, como los tumores del SNC, lo que podría permitir su estudio en un contexto microambientalmente relevante. De manera similar, los organoides utilizados como receptores podrían intercambiarse por organoides modelo de enfermedad 25,26,27, lo que podría permitir el modelado de enfoques de trasplante para estas condiciones.
Como ocurre con todos los modelos, el que aquí se presenta también tiene sus propias limitaciones. Por un lado, los organoides derivados de iPSC son inmaduros desde el punto de vista del desarrollo19 y, por lo tanto, tienen diferencias importantes en comparación con el cerebro envejecido, en el que se manifiestan muchas enfermedades neurodegenerativas. Los organoides cerebrales tampoco son uniformes en el desarrollo19, lo que impide la inyección consistente en el mismo nicho fisiológico exacto. Además, si bien contienen los tipos celulares de las regiones cerebrales relevantes18,19, carecen de los componentes endoteliales, microgliales e inmunológicos, que también son importantes en el entorno in vivo 14. Esto limita el estudio de cómo reaccionará el huésped al trasplante de células. Actualmente se están poniendo en marcha técnicas para añadir células vasculares28 y microgliales29, así como para aumentar la consistencia y regionalización de los organoides18, mejorando así el poder de modelado del sistema de trasplante de organoides. Sin embargo, requerirían más pruebas y optimización más allá de lo que se presenta aquí. Si bien este protocolo es económico y no requiere equipo especializado, sigue habiendo una serie de consideraciones técnicas importantes, por ejemplo, la profundidad de inyección. Esto se debe al hecho de que los organoides no se perfunden y, por lo tanto, a menudo tienen un centro necrótico si crecen demasiado19 y esa luz no puede penetrar a través del núcleo del organoide para el seguimiento de las células vivas. Por lo tanto, las células que se han inyectado demasiado profundo y las colonias que han migrado al interior pueden pasarse por alto. Si bien esto puede mejorarse mediante el uso de fluoróforos de longitud de onda más larga con una mejor penetrancia tisular30, dependiendo del tamaño del organoide y del aparato de detección, es probable que esto siga siendo una consideración. Finalmente, como los organoides cerebrales se encuentran en un estado de desarrollo, el momento del trasplante es otra consideración clave, ya que el entorno probablemente diferirá según la etapa de desarrollo del organoide en el que se inyecta. Si bien esto se puede controlar hasta cierto punto asegurando una edad constante del organoide en el momento de la inyección, es, sin duda, un factor que debe tenerse en cuenta.
Este protocolo es económico, simple, libre de animales y no requiere equipo especializado, lo que hace que el modelado de trasplante sea accesible para una variedad más amplia de laboratorios. Con el rápido ritmo de avance tanto en la terapéutica de células neurales como en los sistemas modelo de organoides, anticipamos que el protocolo de trasplante de organoides presentado aquí será un modelo útil para una variedad de enfermedades y enfoques terapéuticos.

El cerebro humano es un órgano complejo compuesto por múltiples tipos de células de los linajes neural y glial. Juntos, forman una red sofisticada que da lugar a la cognición. Existe un interés significativo en el trasplante de células en este sistema como tratamiento para una amplia variedad de trastornos neurológicos, incluyendo la lesión cerebral traumática (TCE)1,2, los trastornos neurodegenerativos 3,4,5,6,7 y el accidente cerebrovascular8. Sin embargo, una limitación importante en el avance de estas estrategias es la relativa escasez de modelos preclínicos disponibles para determinar los resultados esperados del trasplante. Los modelos más utilizados en la actualidad son los métodos de cultivo in vitro para determinar el potencial celular y el xenotrasplante en ratones. Si bien los métodos de cultivo celular pueden evaluar la diferenciación y el potencial de autorrenovación9, estos se realizan en condiciones óptimas de crecimiento que no imitan el microambiente que las células encontrarían en un contexto de trasplante. Además, la forma en que se cultivan las células puede influir en su comportamiento10.
Los cerebros de ratón contienen todas las células del microambiente y, por lo tanto, son sistemas modelo extremadamente poderosos para el trasplante11. Sin embargo, existen diferencias importantes entre la corteza del ratón y la del ser humano12,13, y no todos los factores de crecimiento reaccionan de forma cruzada entre especies. Los modelos de primates son una alternativa más cercana que imita mejor el sistema humano y también han arrojado importantes resultados preclínicos14. Sin embargo, incluso estos parientes más estrechamente relacionados conservan diferencias importantes en su composición celular15. Si bien estos dos sistemas modelo proporcionan información valiosa sobre el comportamiento celular durante el trasplante e incorporan los elementos quirúrgicos de una eventual terapia, siguen siendo imperfectos. También son costosos y técnicamente desafiantes (es decir, se debe realizar una cirugía cerebral en los animales), lo que limita el rendimiento posible. Además, hay una gran cantidad de cuestiones éticas asociadas con el trasplante de células cerebrales humanas en animales16. Los cultivos de cortes de cerebro permiten cortar un cerebro y utilizarlo para múltiples tratamientos, eliminando así algunas de las limitaciones de los trasplantes de animales; Sin embargo, estos tienen una vida útil limitada (semanas), todavía son de origen animal y (al ser una rebanada delgada) no tienen suficiente integridad de volumen/superficie para imitar la inyección de células17. Por lo tanto, sigue existiendo una brecha importante entre los modelos estrictamente de cultivo celular/potencial y el trasplante in vivo.
Los organoides cerebrales son un modelo in vitro que contiene los principales tipos de células neurales presentes en el cerebro y pueden generarse en grandes cantidades a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs)18,19. De este modo, estos organoides proporcionan un contexto celular que podría permitir la evaluación de la capacidad funcional de una célula de prueba de interés en el entorno del trasplante. De hecho, un estudio reciente demostró que las células progenitoras neurales (NPC) trasplantadas a organoides cerebrales humanos sobreviven, proliferan y se diferencian de manera similar a las NPC trasplantadas en el cerebro de un ratóndiabético obeso que nuncaha combinado inmunodeficiente gamma (NSG)20. Por lo tanto, los organoides cerebrales representan un sistema rentable, libre de crueldad animal y de larga duración (>6 meses) que captura los tipos de células del cerebro humano. Como tales, podrían representar un receptor de trasplante ideal para las pruebas en etapa temprana de la capacidad regenerativa de las células neuronales.
En este trabajo se presenta un protocolo para el trasplante y posterior seguimiento de NPCs humanas marcadas en organoides cerebrales humanos (Figura 1). Esto comienza con la inyección de NPCs marcadas con GFP en organoides cerebrales maduros (2-4 meses de edad)18. A continuación, las células trasplantadas se someten a una microscopía de fluorescencia de células vivas durante un período de 4 meses. Durante este tiempo, mostramos tanto la persistencia de las células en el lugar de la inyección como la migración a las regiones distales del organoide. En el punto final, demostramos la recuperación de antígenos, la tinción y la obtención de imágenes de secciones histológicas derivadas de estos organoides, incluido un protocolo para el enfriamiento de los colorantes existentes basados en AlexaFluor para permitir rondas adicionales de tinción e imágenes, basado en trabajos anteriores21. Por lo tanto, este protocolo podría ser útil en la medición de la capacidad de diferenciación de las células en un entorno de trasplante, la durabilidad del injerto, la expansión celular in situ y la migración celular desde el sitio del trasplante. Anticipamos que esto será útil tanto para aplicaciones de medicina regenerativa / terapia celular, como para el modelado de tumores mediante el injerto de células tumorales en organoides específicos de regiones relevantes.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td> mezcla <td>de enzimas proteolíticas-colagenolíticas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clon SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anticuerpo anti-GFAP (clon SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clon 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-Tubulina y beta; 3 (TUBB3) (clon TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidrato</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek-Alcohol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>etílico desnaturalizado (anhidro)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo 10565018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxide (DMSO), estéril</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-Solución de</td><td></td></tr> <tr><td>formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H Leica</td><td>Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Factor de crecimiento reducido (GFR)</td><td>Corning 356231 Phenol</td><td></td> Hoja de micrótomo MX35 <td>sin rojo, sin LDEV</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina Dihidrocloruro</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>inhibidor de ROCK Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Moldes a base de acero inoxidable</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE Procesamiento/Inclusión de Biopsia Cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Kit de Diferenciación de Neuronas del Prosencéfalo Secundario StemCell</td><td>Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Medio Progenitor Neural</td><td>Tecnologías StemCell</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Kit de Inducción Neuronal Tecnologías</td><td>StemCell</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtomo</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Tissue</td><td></td></tr> <tr><td>Prep</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; Procesador de tejidos AI</td><td>Sakura Finetek-tolueno</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(histológico)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blue; 0.4% (wt/vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de organoide cerebral humano de trasplante de células neurales

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

El avance de los enfoques de trasplante celular requiere sistemas modelo que permitan una evaluación precisa de la potencia funcional de las células trasplantadas. Para el sistema nervioso central, aunque el xenotrasplante sigue siendo el estado del arte, estos modelos son técnicamente desafiantes, de rendimiento limitado y costosos. Además, las señales ambientales presentes no reaccionan perfectamente con las células humanas. Este artículo presenta un modelo económico, accesible y compatible con el alto rendimiento para el trasplante y seguimiento de células neuronales humanas en organoides cerebrales humanos. Estos organoides se pueden generar fácilmente a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando kits comerciales y contienen los tipos celulares clave del cerebro. 
En primer lugar, demostramos este protocolo de trasplante con la inyección de células progenitoras neurales (NPC) derivadas de iPSC humanas marcadas con EGFP en estos organoides. A continuación, discutimos las consideraciones para rastrear el crecimiento de estas células en el organoide mediante microscopía de fluorescencia de células vivas y demostramos el seguimiento de NPC trasplantadas marcadas con EGFP en un organoide durante un período de 4 meses. Finalmente, presentamos un protocolo para el seccionamiento, tinción inmunofluorescente cíclica e imagen de las células trasplantadas en su contexto local. El modelo de trasplante de organoides que se presenta aquí permite el seguimiento a largo plazo (al menos 4 meses) de las células humanas trasplantadas directamente en un microambiente humano con un protocolo económico y fácil de realizar. Por lo tanto, representa un modelo útil tanto para las terapias de células neurales (trasplantes) como, probablemente, para modelar tumores del sistema nervioso central (SNC) de una manera más precisa desde el punto de vista microambiental.

Como validación de la identidad del organoide cerebral, se tiñeron secciones histológicas de un organoide cerebral maduro (de 2 meses de edad) para PAX6 (un marcador de NPC dorsales23) y SATB2 (un marcador de neuronas maduras, postmitóticas y de capa superior24). Como era de esperar, las células PAX6+ estaban presentes en el interior del organoide, y las células SATB2+ estaban presentes en las capas superiores (Figura 2). Estos resultados apoyan que los organoides cerebrales utilizados eran, de hecho, prosencéfalos dorsales, como se especifica en el kit de diferenciación. Para establecer la dependencia de la dosis del sistema de trasplante de organoides cerebrales, se inyectaron organoides cerebrales de 2 meses de edad con un número creciente de NPC derivadas de iPSC de EGFP+ . Se observó una clara dependencia de la dosis de la fluorescencia de GFP en el número de células de entrada, con una detección consistente de parches celulares EGFP+ a partir de 10.000 células (Figura 3). A continuación, se evaluó la persistencia y la migración de las NPC trasplantadas mediante el seguimiento de los organoides trasplantados a lo largo del tiempo. Para ello, se trasplantaron 50.000 NPC EGFP+ derivadas de iPSC a organoides cerebrales de 2-3 meses de edad generados a partir de la misma línea de iPSC. Se tomaron imágenes de los organoides inyectados y de los controles para determinar la positividad de EGFP en los puntos de tiempo indicados durante los siguientes 3-4 meses. En esta serie de trasplantes, observamos persistencia del sitio inyectado a lo largo del período de seguimiento de 4 meses (Figura 4A). Aparecieron parches celulares adicionales de EGFP+ a los 9 días después del trasplante y persistieron hasta el punto final del estudio (3-4 meses dependiendo del organoide), lo que indica la migración de las células y la integración en sus nuevos sitios (Figura 4A). A mayor aumento, se observó una clara morfología neuronal con proyecciones largas en el organoide (Figura 4B), lo que confirma la integración de las células inyectadas.
Para determinar el estado de diferenciación de las células inyectadas después de la inyección, el organoide rastreado de 4 meses y su control se fijaron, se incluyeron en parafina, se cortaron en rodajas de 15 μm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. A continuación, los cortes se procesaron y se tiñeron en una sola ronda de tinción fluorescente (EGFP, TUJ1, NESTIN) o durante dos ciclos de tinción consecutivos para añadir marcadores adicionales (MAP2, GFAP). La tinción inicial de una sola ronda confirmó la presencia de células EGFP+ en el lugar de la inyección, incluida una mezcla de células que conservaban el estado de NPC (NESTIN+TUJ1−) y aquellas que se habían diferenciado hacia un destino neural (NESTIN−TUJ1+) (Figura 5). Tanto para el organoide de control como para el inyectado, se observaron muy pocas NPC NESTIN+ (la mayoría, aunque no todas, eran NPC trasplantadas con EGFP+ en el lugar de la inyección), con una mayoría de neuronas inmaduras-maduras TUJ1+ (Figura 5). La tinción de dos rondas dio más detalles, revelando neuronas maduras (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) alrededor de la mayor parte de la región externa del organoide, con áreas de neuronas inmaduras (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) hacia el centro (Figura 6A,B). Los astrocitos (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) estaban presentes tanto en los organoides inyectados como en los de control y estaban intercalados alrededor de los bordes externos (Figura 6A,B). El corte para el que se realizó la tinción de dos rondas en el organoide inyectado mostró una pequeña colonia satélite de células EGFP+ lejos del lugar de la inyección que había adoptado el fenotipo de neuronas maduras (Figura 6B, C). Algunos de ellos parecían estar muy cerca de los astrocitos; sin embargo, no había células EGFP+ con superposición completa a la tinción GFAP, lo que sugiere que eran adyacentes en lugar de generar los astrocitos en sí mismos (Figura 6B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Figura 1: Modelo de trasplante de células marcadas en organoides cerebrales. Visión general esquemática de la generación de células marcadas por transducción lentiviral, su trasplante a organoides cerebrales y el seguimiento mediante imágenes de células vivas e inmunofluorescencia. Abreviatura: GFP = proteína verde fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Figura 2: Inmunofluorescencia de cortes histológicos que muestran la arquitectura de organoides tempranos y tardíos. Un organoide cerebral de 2 meses de edad fue fijado, incluido en parafina, cortado en rodajas y teñido con PAX6, SATB2 y DAPI. Se utilizó una sección sin teñir para establecer la exposición y el tiempo de integración para evitar una señal falsa positiva de la autofluorescencia. Las células PAX6+ estaban presentes en el interior del organoide, mientras que las células SATB2+ estaban presentes en las capas superiores. Se tomaron imágenes de la pila Z cada 4,2 μm a través de toda la sección de tejido de 15 μm. Las secciones ópticas se combinaron utilizando la opción de apilamiento de enfoque en el software Gen5 con opciones predeterminadas. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: PAX6 = proteína de la caja 6 pareada; SATB2 = proteína especial de unión a secuencia 2 rica en AT; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Figura 3: Injerto dependiente de la dosis de NPCs en organoides cerebrales. Los organoides se trasplantaron con 0 (control negativo), 1.000, 5.000, 10.000 o 50.000 NPC derivadas de GFP+ iPSC. A la semana siguiente al trasplante, los organoides se visualizaron en un Cytation 5 con un cubo de filtro GFP. El control negativo se utilizó para establecer el tiempo de exposición e integración para minimizar la autofluorescencia. Los colores más oscuros indican más fluorescencia de EGFP en relación con el control negativo. Barras de escala = 100 μm. Estas son imágenes 4x de los organoides completos. Después de la obtención de imágenes, se realizó una sustracción de fondo de bola rodante con un radio de píxeles de 50 antes de la visualización para corregir la intensidad variable del fondo en los organoides. Los sitios de inyección identificados como las regiones de mayor injerto se indican con una flecha roja donde hubo injerto. Abreviaturas: NPCs = células progenitoras neurales; GFP = proteína verde fluorescente; EGFP = GFP aumentada; iPSC = célula madre pluripotente inducida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Figura 4: Seguimiento del crecimiento, la migración y la persistencia de las células trasplantadas con imágenes de células vivas de fluorescencia. (A) Los organoides de control y trasplantados (50.000 NPC derivadas de GFP+ iPSC) fueron seguidos por imágenes de células vivas de fluorescencia en el transcurso de 2 a 4 meses a partir de dos conjuntos de trasplante independientes. Se utilizaron organoides de control negativo para establecer el tiempo de exposición e integración para minimizar la autofluorescencia en cada punto de tiempo. Las imágenes de EGFP se capturaron utilizando un cubo de filtro GFP en el Cytation 5 en los momentos indicados después del trasplante. Los colores más oscuros indican más fluorescencia de EGFP en relación con el control negativo para ese punto de tiempo. Se realizó una sustracción de fondo de bola rodante con un radio de píxel de 50 antes de la visualización para corregir la intensidad variable del fondo en los organoides. Los organoides se colocaron aproximadamente en la misma orientación en cada punto de tiempo, y las imágenes se rotaron para mantener la consistencia de la visualización y para mostrar claramente el crecimiento de las células trasplantadas. Los sitios de inyección identificados como las regiones de mayor injerto en el punto de tiempo más temprano se indican con una flecha roja. En la parte inferior de la figura se muestra un ejemplo de organoide de control negativo. (B) Se muestran imágenes de ejemplo 20x de organoides injertados en la semana 1 y la semana 15 después del trasplante. El contraste local se mejoró antes de la visualización utilizando FIJI para garantizar la visibilidad de las neuritas. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: NPCs = células progenitoras neurales; GFP = proteína verde fluorescente; EGFP = GFP aumentada; iPSC = célula madre pluripotente inducida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Figura 5: Inmunofluorescencia de los cortes histológicos que revelan la persistencia de las NPC trasplantadas en el lugar de la inyección junto con la migración y la diferenciación neuronal. Imágenes de fluorescencia de un solo canal de organoides (A) no inyectados y (B) trasplantados. La imagen superpuesta de la derecha muestra los tres canales de interés (NESTIN, TUJ1 y EGFP), pero no incluye DAPI. Los mínimos de visualización se establecieron para excluir la señal de las celdas negativas (determinadas para EGFP del control no inyectado y para otros canales basados en combinaciones de marcadores conocidas). Los máximos de visualización se basaron en la señal más alta observada para ese anticuerpo en cualquier célula. Los rangos de visualización se mantuvieron constantes entre los organoides no inyectados y trasplantados para permitir una comparación directa. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: NPCs = células progenitoras neurales; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteína fluorescente verde aumentada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Figura 6: Evaluación del estado de diferenciación celular injertado y localización mediante inmunofluorescencia cíclica de los cortes histológicos. Se muestran imágenes de fluorescencia de un solo canal de los organoides no inyectados, (A) de la misma edad y (B) trasplantados para la primera y segunda ronda de tinción, según se indica. Los mínimos de visualización se establecieron para excluir la señal de las celdas negativas (determinadas para EGFP del control no inyectado y para otros canales basados en combinaciones de marcadores conocidas). Los máximos de visualización se basaron en la señal más alta observada para ese anticuerpo en cualquier célula. Los rangos de visualización (y, por supuesto, los parámetros de imagen) se mantuvieron constantes entre los organoides de control e inyectados para permitir la comparación directa. Barras de escala = 100 μm. A la derecha se muestra una imagen superpuesta (excluyendo DAPI) para cada ronda de tinción para cada organoide. (B) Para el organoide inyectado en el que se realizó el registro de imágenes, todas las imágenes se recortan a la región observada en ambas rondas de tinción. (B,C) Para el organoide inyectado, las regiones celulares de EGFP+ se delinean en azul. En (C) se muestra un diagrama de cómo se utiliza DAPI para hacer coincidir las entidades durante el registro de imágenes, seguido de una combinación general de la imagen registrada. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteína verde fluorescente mejorada; MAP2 = proteína 2 asociada a microtúbulos; GFAP = proteína ácida fibrilar glial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Clon</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Concentración</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTIN</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 en 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 en 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 en 200</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 en 500</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 de cada 1.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 de cada 100</td>
		</tr><tr><td>Anti-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 en 500</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Concentraciones de anticuerpos para la tinción. Abreviaturas: TUBB3 = beta-tubulina III; GFP = proteína verde fluorescente; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; MAP2 = proteína 2 asociada a microtúbulos; PAX6 = proteína de la caja 6 pareada; SATB2 = proteína especial de unión a secuencias 2 rica en AT.

Aquí, describimos un protocolo para el trasplante y seguimiento de células neuronales marcadas en organoides cerebrales humanos.

Un modelo de organoide cerebral humano de trasplante de células neurales

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Con el creciente interés en las terapias celulares, se necesitan nuevos métodos para evaluar la funcionalidad de estas células. Este protocolo permite la evaluación in vitro a largo plazo de estos injertos celulares en un contexto neuronal. Las principales ventajas de esta técnica es que todos los componentes provienen de origen humano.Además, el injerto se puede rastrear fácilmente y el entorno del organoide se puede cambiar fácilmente, lo que permite probar diferentes medicamentos o tipos de tratamientos. La demostración de esta técnica estará a cargo de Iliana Ibáñez, una talentosa estudiante de doctorado en mi laboratorio. Comience por eliminar la suspensión unicelular de las células madre pluripotentes inducidas o las células progenitoras neurales derivadas de iPSC, o NPC, del hielo y centrifugarlas a 300 g durante cinco minutos a 4 grados centígrados.Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3 miligramos por mililitro de matriz de membrana basal solubilizada para obtener un volumen final de dos microlitros por inyección. Vuelva a colocar inmediatamente la suspensión sobre el hielo hasta su uso. Transfiera la jeringa preenfriada del congelador a 20 grados centígrados a una cubeta de hielo para su uso posterior.A continuación, retire la placa del organoide cerebral de la incubadora y transfiera el organoide a una placa de 35 milímetros con una punta de diámetro ancho. Para estabilizar los organoides y facilitar la inyección, retire el medio tanto como sea posible sin dañar el organoide. Coloque el plato de 35 milímetros que contiene el organoide bajo un microscopio de disección para facilitar la inyección.Una vez que los organoides estén listos para inyectar, vuelva a suspender suavemente las células NPC marcadas con EGFP con una punta de pipeta P20 refrigerada y mueva dos microlitros de estas células a un portaobjetos de vidrio estéril previamente enfriado. Tome una jeringa de insulina precargada del hielo y extraiga lentamente los 2 microlitros de suspensión celular con el bisel de la aguja hacia abajo. Abra la tapa del plato que contiene el organoide antes de enfocar el microscopio sobre él.Sostenga el plato con una mano, coloque el bisel de la aguja hacia arriba. Y con la otra mano, inyectar la célula lentamente en la superficie del organoide. Después de inyectar las células, vuelva a colocar la tapa en el plato e incube el organoide inyectado durante uno o dos minutos.Luego, agregue suavemente 500 microlitros del medio organoide a la placa antes de transferir el organoide a una placa de 24 pocillos con una punta de orificio ancho. Incubar el organoide a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con un cambio completo del medio cada dos días. Cargue un organoide no inyectado o de control negativo en un microscopio de fluorescencia.Y ajuste la intensidad de iluminación entre 1 y 2 y el tiempo de exposición entre 80 y 100 milisegundos para una autofluorescencia mínima. A continuación, cargue el organoide de control positivo y aumente el tiempo de exposición para asegurarse de que las células marcadas sean visibles. Vuelva a colocar el organoide con una punta de pipeta de diámetro ancho para encontrar la proteína fluorescente verde mejorada o la región EGFP plus para la inyección.Retire el medio completamente del organoide antes de cargar el organoide. E imagínalo con la configuración seleccionada. Una vez que se complete la imagen, agregue inmediatamente un medio nuevo para evitar que el organoide se seque.Después de repetir la eliminación del medio y la obtención de imágenes para todos los organoides, regrese los organoides a la incubación normal y a los cambios de medio. Repita la toma de imágenes a los intervalos deseados. Coloque el portaobjetos en un frasco de tinción de portaobjetos Coplin lleno de tolueno durante dos minutos y repita este paso.Luego, transfiera el portaobjetos de vidrio a un frasco de tinción de vidrio para portaobjetos Coplin lleno de alcohol etílico al 100 % durante dos minutos. Y repita este paso antes de transferir el portaobjetos a un frasco Coplin lleno de agua durante dos minutos. Repita el lavado con agua.Luego, coloque un recipiente de plástico en el baño de agua, asegurándose de que el plástico no toque el fondo del baño. Vierta el tampón de citrato dentro del recipiente de plástico y deje que alcance de 95 a 100 grados centígrados. Una vez que el tampón alcance la temperatura deseada, coloque los portaobjetos dentro del tampón y cubra sin apretar el recipiente con una tapa, dejando los portaobjetos dentro del baño de agua durante 30 a 40 minutos.Después de la incubación, retire el recipiente de plástico del baño de agua y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Lave los portaobjetos tres veces durante dos minutos cada uno con PBS. Retire el PBS con un pañuelo de papel sin tocar la muestra.Prepare el tampón de permeabilización y llene con él un frasco de tinción de portaobjetos de vidrio. Sumerja los portaobjetos en el tampón de permeabilización e incube durante 10 minutos. Repita tres lavados de PBS durante dos minutos cada uno.Luego, prepare la mezcla de tinción para cubrir cada muestra y agregue 25 microlitros al portaobjetos de organoide antes de incubar el portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, repita tres lavados de PBS durante dos minutos cada uno y elimine las sales enjuagando el portaobjetos con agua destilada dentro de un frasco de vidrio para teñir el portaobjetos. A continuación, agregue 10 microlitros de monturas líquidas y DAPI a cada muestra antes de obtener imágenes del portaobjetos con el microscopio de fluorescencia.Al frasco de tinción Coplin de vidrio lleno hasta la mitad con tampón de enfriamiento 2X, agregue 45 mililitros de PBS y coloque los portaobjetos dentro de este frasco. Incubar el frasco durante la noche a 4 grados centígrados. Utilice la microscopía de fluorescencia para comprobar si los fluoróforos se apagaron eficazmente antes de repetir la tinción y la obtención de imágenes.Se observó una clara dependencia de la dosis de la fluorescencia de GFP en el número de células de entrada, con una detección consistente de EGFP más parche celular a 10.000 células y más. Los organoides inyectados y los controles de los que se tomaron imágenes para la positividad de EGFP mostraron la persistencia del sitio inyectado durante el período de seguimiento de cuatro meses. Aparecieron parches celulares positivos para EGFP adicionales nueve días después del trasplante y persistieron hasta el punto final del estudio, lo que indica la migración de las células y la integración en sus nuevos sitios.A mayor aumento, se observó una morfología neural clara con proyecciones largas en el organoide, lo que confirma la integración de las células inyectadas. La tinción inicial de una sola ronda confirmó la presencia de células EGFP plus en el lugar de la inyección, incluida una mezcla de células que conservaban el estado de NPC y aquellas que se habían diferenciado hacia un destino neuronal. Para el control y los organoides inyectados, se observaron muy pocos Nestin más NPCs, con una mayoría de TUJ1 más neuronas maduras inmaduras.Las dos tinciones redondas dieron más detalles, revelando neuronas maduras alrededor de la mayor parte de la región externa del organoide, con áreas de neuronas inmaduras hacia el centro. Los astrocitos estaban presentes en los organoides inyectados y de control, y estaban intercalados alrededor de los bordes externos. El corte para el que se realizó la tinción de dos rondas en el organoide inyectado mostró una pequeña colonia satélite de EGFP más células alejadas del lugar de la inyección que habían adoptado el fenotipo de las neuronas maduras.Algunas de estas colonias parecen estar cerca de los astrocitos. Sin embargo, ninguna célula EGFP más con superposición completa a la tinción de GFP sugirió que fueran adyacentes en lugar de generar los astrocitos por sí mismos. Cuando se está inyectando el organoide es que hay que evitar aplicar demasiada fuerza o hacerlo demasiado rápido, ya que se puede destruir el organoide por completo.Por lo tanto, después del seguimiento de la vida útil, los organoides se pueden asociar y utilizar para el análisis de citometría de flujo o enfoques de secuenciación de células individuales. Esto nos permitirá conocer el estado molecular de las células. Esta técnica podría ser de gran utilidad para avanzar en la terapia celular de enfermedades neurodegenerativas, así como para modelar tumores cerebrales o metástasis.

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