Name: Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende a visualizar los sitios de infección temprana de Magnaporthe oryzae en cebada usando equipo básico de laboratorio. Este método accesible permite estudiar mutantes fúngicos sin microscopía avanzada.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores reconocen la financiación del premio USDA-NIFA 2016-67013-24816.

1. Preparación de materiales experimentales
<ol><li>Prepare agar de avena (OMA) mezclando harina de avena hasta que sea un polvo fino. Añadir 25 g de avena en polvo y 15 g de agar a 500 ml deddH2O, y el autoclave en el ciclo del medio (alternativamente llevar a ebullición durante 20 min). Vierta el medio en placas de Petri estériles de 60 mm. NOTA: Otros tipos de medios que inducen esporulación, como el agar V8, son aceptables para este protocolo.</li>
	<li>La placa M. oryzae filtra las existencias directamente sobre las placas OMA utilizando pinzas estériles y les permite cubrir toda la placa (9-12 días). Colocar las placas en una incubadora de crecimiento a 25 °C con ciclos día:noche de 12:12 h para ayudar a inducir la esporulación. NOTA: Algunos mutantes crecen más lentamente y requieren cuidados adicionales (por ejemplo, medios completos primero, luego una transferencia al OMA), y podrían tomar una semana adicional para producir suficientes conidios.</li>
	<li>Plante directamente semillas de cebada (Hordeum vulgare Lacey) en un medio de crecimiento húmedo (por ejemplo, medios para macetas sin suelo) con 10-15 semillas por maceta de 6 pulgadas. Coloque las macetas en bandejas con 1-2 pulgadas de agua.</li>
	<li>Ajuste las condiciones de la cámara de cultivo de cebada como 22 °C durante 12 h (luz del día) y 19 °C durante 12 h (oscura) al 60% de humedad relativa. Continúe regando desde el fondo para no molestar las semillas.</li>
	<li>Cultivar la cebada hasta la segunda etapa de hoja, aproximadamente durante 14 días. Usando tijeras estériles, corte la planta de cebada justo por encima de la línea del suelo. Usando fórceps y una navaja de afeitar / bisturí, corte cuidadosamente la vaina de la hoja de la primera hoja que está abierta longitudinalmente, y usando las pinzas, retírela de la base de la segunda hoja. NOTA: Limpie las herramientas (fórceps, bisturí, etc.) antes de usarlas con etanol al 75% -80%. La vaina es la capa delgada de la epidermis que proporciona la unión de la primera a la segunda hoja (segunda a tercera hoja, etc.; ver Figura 1).</li>
	<li>Coloque la primera hoja plana en una placa de Petri estéril de 60 mm, que contenga una toalla de papel húmeda para mantener la humedad dentro de la placa. Usando el bisturí, corte la mayor parte de la primera hoja lejos de la vaina, dejando solo 0.5 pulgadas del tejido de la hoja para el montaje.</li>
	<li>Pegue el tejido de la hoja en la parte inferior de la placa de Petri. NOTA: La vaina se riza, pero esto es aceptable ya que una vaina rizada sostiene la gota conidial más fácilmente.</li>
	<li>Recoja las placas de M. oryzae de 9 a 12 días de edad y agregue 0.5-2 ml de agua estéril a las placas. Usando un bucle de inoculación estéril, raspe suavemente el micelio para liberar los conidios adjuntos. Pipetear cuidadosamente la suspensión conidial en un tubo de microcentrífuga que contenga un pequeño trozo de gasa para filtrar cualquier trozo grande de micelio de la suspensión conidial. NOTA: Las esporas se pueden recolectar tan pronto como 7 días, si el crecimiento y la esporulación son suficientes para alcanzar la concentración de esporas deseada. La recolección puede retrasarse no más de 14 días si se trabaja con un mutante genético de crecimiento lento</li>
	<li>La concentración de esporas deseada es de 5 x 10 4 esporas por ml, pero un rango (1 x 10 4-1 x 10 5) es aceptable. Una concentración demasiado alta hace que las imágenes de los sitios de infección individuales sean un desafío; Diluir la concentración de esporas con agua estéril si es necesario.</li>
	<li>Pipetear cuidadosamente la suspensión conidial dentro de la vaina de la hoja enrollada. Comience con 25 μL (el tamaño de la gota se puede aumentar dependiendo del tamaño de la vaina, hasta 50 μL). NOTA: Se recomienda realizar de tres a cinco réplicas de cada cepa mutante o línea de cebada. Es común que se produzcan daños durante el proceso de tinción, por lo tanto, se recomiendan réplicas adicionales de la funda.</li>
	<li>Llene cuatro o cinco vasos de precipitados de 500 ml conddH2O, y caliente hasta que cocine al vapor (usando un microondas o placa eléctrica). Tenga cuidado al mover los vasos de agua caliente. Sostenga la tapa de la placa de Petri sobre uno de los vasos humeantes para atrapar la humedad dentro del plato.</li>
	<li>Apile las placas de la vaina de la hoja infectada y rodéelas con los vasos calientes restantes. Esto crea un ambiente húmedo y húmedo, necesario para que las esporas germinen. NOTA: Tenga cuidado al cocer al vapor las tapas para asegurarse de que no haya agua caliente o vapor que toque las fundas.</li>
	<li>Proteja las vainas de las hojas de la luz, cúbralas con una caja de goma o plástico de color sólido (preferiblemente negro) y déjelas reposar durante 48 h o el punto de tiempo deseado para la obtención de imágenes. NOTA: Una caja de cartón no es adecuada porque no bloquea la humedad y absorbe el vapor de los vasos de agua caliente. Una tina de plástico con cerradura funciona bien para contener la humedad, y se puede cubrir con tela negra o un recipiente oscuro más grande para bloquear la luz.</li>
</ol>2. Proceso de tinción
<ol><li>Prepare la mancha de la siguiente manera: prepare una dilución fresca de ácido acético al 45% y agregue azul de tripano al 0,1% v / v. Alícuota 1 ml de la solución colorante en tubos de microcentrífuga. Ajuste un bloque de calor o baño de agua a 40 °C.</li>
	<li>Con cuidado, con una navaja de afeitar o bisturí, corte la vaina de la hoja lejos de la cinta. Con fórceps, coloque la vaina en el tubo de microcentrífuga y asegúrese de que esté completamente sumergida en la solución de tinte. Deje 2 h para que el tinte penetre en la hoja. Calentar las muestras a 40 °C durante el tiempo del proceso de tinción en un bloque de calor o baño de agua para aumentar la penetración del tinte. NOTA: Las vainas intentan flotar en el tubo de microcentrífuga; Para evitar bolsas de tejido foliar sin teñir, llene los tubos, sumerja las vainas y cierre el tubo. No coloque varias fundas en el mismo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Enjuague las vainas de las hojas cuidadosamente con glicerol al 60% para eliminar el tinte adicional. Tres enjuagues (cada uno en glicerol fresco) son generalmente suficientes. Mantenga la vaina en glicerol hasta que esté lista para montarla en portaobjetos.</li>
</ol>3. Proceso de montaje e imagen
<ol><li>Coloque la funda en un portaobjetos de vidrio limpio y agregue unas gotas de glicerol al 60%. Usando un microscopio de disección y dos pares de fórceps, desenrolle cuidadosamente la vaina, dejando el centro inoculado hacia arriba. Mantenga la vaina abierta con los fórceps y coloque el cubreobjetos en la parte superior para evitar que la vaina se enrosque y bloquee el sitio de infección. NOTA: La vaina de la hoja es muy frágil, y estos pasos deben hacerse con cuidado para evitar daños a la vaina.</li>
	<li>Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas para el almacenamiento a largo plazo, o cinta adhesiva para el almacenamiento a corto plazo. Observe las diapositivas bajo un microscopio de luz compuesta.</li>
	<li>Tome imágenes básicas usando un microscopio y un teléfono celular. Aquí, las imágenes fueron tomadas con un soporte adaptador de teléfono celular y un teléfono inteligente. Para dispositivos Android, ajuste la aplicación de la cámara a los siguientes ajustes: flashear, desactivar Top Shot, desactivar el ajuste automático de brillo y sombras, y establecer la resolución de la foto en completa. NOTA: El uso de la aplicación de la cámara en el teléfono disminuye la duración de la batería más rápido de lo habitual, por lo que se recomienda tener alimentación externa.</li>
	<li>Una vez que el teléfono celular esté montado en el microscopio, tome una imagen de un micrómetro a escala con el objetivo que se utilizará para adquirir los datos. Los datos en este estudio se adquirieron en un objetivo de aire de 40x 0.65 NA, y el adaptador de teléfono se montó en un ocular 10x. Ajuste el zoom del teléfono a 2.5x y manténgalo consistente para mantener un tamaño de píxel constante.</li>
	<li>El centro de la vaina alberga la mayor concentración de esporas y appressoria infectante; Por lo tanto, apunte a 9-12 imágenes de cada vaina para obtener números significativos para el análisis estadístico. El número de esporas y appressorias varía según la concentración de esporas aplicadas.</li>
</ol>4. Evaluación y conteo de imágenes usando ImageJ (FIJI)
<ol><li>Transfiera las imágenes a un equipo que ejecute ImageJ (FIJI). Para abrir las imágenes, arrastre y suelte los archivos en la barra ImageJ.</li>
	<li>Establezca la escala de las imágenes cargando la imagen micrométrica del escenario y dibujando una línea recta entre dos marcas para la escala. Abra Establecer escala, escriba la Distancia conocida para la línea medida y escriba la unidad para la escala. En el micrómetro, en este ejemplo, la línea más pequeña era de 10 μm. Marque la casilla Establecer global y presione OK. Todas las imágenes posteriores cargadas tendrán la misma escala.</li>
	<li>Para contar appressoria, esporas u otros objetos, seleccione la herramienta Punto . A continuación, abra el Administrador de ROI. Haga clic en la tecla T del teclado para agregar puntos a la lista. Estas regiones de interés se pueden guardar si es necesario y volver a cargar en la misma imagen.</li>
	<li>Dependiendo de los objetivos experimentales, realice mediciones adicionales, como la longitud de la espora, el tamaño de la appressoria y la longitud del tubo germinal.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+%28MoT%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+pressure%3A+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li>
<li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996(2013).</li>
<li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84(2016).</li>
<li>Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangridge%2C+P+%22The+Barley+Genome.+Compendium+of+Plant+Genomes%22">The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes</a>. , Springer. Cham. 1-10 (2018).</li>
<li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice%2C+goosegrass%2C+and+weeping+lovegrass%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li>
<li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li>
<li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Direct%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).</li>
<li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+no+feeding+frenzy%3F+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li>
<li>Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Delaware%22">University of Delaware</a>. , Doctoral dissertation (2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.The+plant+infection+test%3A+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li>
<li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li>
<li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay muchos ensayos comúnmente utilizados disponibles para probar cepas de M. oryzae que proporcionan una visión a nivel macroscópico de una respuesta de infección compatible o incompatible, como las inoculaciones en aerosol o gotitas, y el uso de sistemas de clasificación para cuantificar el tamaño de las lesiones13,14. Otro ensayo común para M. oryzae es probar la capacidad del patógeno para formar su estructura de penetración especializada, el...

Magnaporthe oryzae, el hongo de la explosión del arroz, infecta una variedad de cultivos de granos, incluyendo cebada, trigo y arroz1. Este patógeno causa enfermedades devastadoras y representa una amenaza mundial para estos valiosos cultivos, causando la pérdida completa de cultivos si no se controla. Muchos laboratorios de todo el mundo se centran en la enfermedad por la explosión del arroz debido a su amenaza global y sus atributos como un excelente modelo para las interacciones planta-hongos2. Ha sido completamente secuenciado, y la genética de su ciclo infeccioso, particularmente los eventos tempranos, se han establecido 3,4. El ciclo de vida comienza con una espora que germina en la superficie de una hoja, formando la estructura de penetración especializada llamada appressorium. El appressorium penetra en el tejido foliar y la infección continúa con el desarrollo de lesiones que inician el proceso de esporulación y diseminan la enfermedad4. La prevención de cualquiera de estos eventos tempranos inhibiría drásticamente esta enfermedad devastadora. En consecuencia, la mayoría de las investigaciones actuales sobre la enfermedad blástica se han centrado en los pasos tempranos de la infección, desde los conidios germinados que forman un appressorium hasta el desarrollo de las hifas invasivas y el complejo interfacial biotrófico (BIC)5.
La gran cantidad de investigación sobre la enfermedad blástica se ha llevado a cabo en el arroz, a pesar de que M. oryzae es un patógeno importante para una variedad de cultivos, y las cepas recién evolucionadas están emergiendo como una amenaza global para el trigo6. Si bien el arroz es uno de los tres principales cultivos básicos utilizados para alimentar a la población, junto con el trigo y el maíz, la cebada es el cuarto grano de cereal en términos de alimentación para el ganado y producción de cerveza7. A medida que la industria de la cerveza artesanal crece, también lo hace el valor económico de la cebada. Existen claras ventajas de utilizar M. oryzae y cebada como patosistema para estudiar la enfermedad blástica. Primero, hay cepas de M. oryzae que infectan solo cebada, así como cepas que pueden infectar múltiples especies de pasto. Por ejemplo, 4091-5-8 infecta principalmente solo cebada, mientras que Guy11 y 70-15 pueden infectar tanto a la cebada como al arroz8. Estas cepas son genéticamente similares, y el proceso de infección es comparable9. En segundo lugar, en condiciones estándar de laboratorio e invernadero, la cebada es más fácil de cultivar, ya que no tiene los complicados requisitos del arroz (control conciso de la temperatura, alta humedad, espectros de luz específicos). También hay desafíos de imagen con el arroz debido a la hidrofobicidad de la superficie de la hoja, que la cebada no exhibe10.
Este protocolo presenta un método simple para aislar y utilizar eficazmente las vainas de hojas de cebada para el análisis microscópico de múltiples etapas de infección, utilizando suministros de laboratorio comunes y un teléfono inteligente para la recopilación de datos. Este método para el ensayo de vaina de hoja de cebada es adaptable para laboratorios de todo el mundo, ya que requiere suministros mínimos y, sin embargo, proporciona una imagen clara de la interacción microscópica entre el patógeno y las primeras células que infecta. Mientras que los ensayos de patogenicidad, como un aerosol o la inoculación de gotitas, pueden proporcionar una visión macro de la capacidad del patógeno para formar lesiones, este ensayo permite al investigador visualizar pasos específicos de infección temprana, desde eventos previos a la penetración hasta la colonización de células epidérmicas. Además, los investigadores pueden comparar fácilmente la infección con el hongo de tipo salvaje con la infección con un mutante reducido en virulencia.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Teléfono celular&nbsp;</td><td>Google&nbsp;</td><td>Pixel 4A</td><td>Cualquier teléfono inteligente con una cámara trasera que se pueda montar en un soporte será suficiente.</td></tr><tr><td>Adaptador de microscopio para teléfono móvil</td><td>Vankey B01788LT3S</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc = 1 y spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>AmScope</td><td>FM690TC</td><td>40x&ndash; 2500x Microscopio de epifluorescencia vertical trinocular</td></tr><tr><td>Avena copos de avena a la antigua Quaker</td><td></td><td>N/A</td><td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =pla-568492637928& psc=1</td></tr><tr><td>ProMix BX</td><td>ProMix</td><td>1038500RG</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos rectangulares</td><td>Corning</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos, microscopio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa&nbsp;</td><td>OMAX</td><td>A36CALM7</td><td>0,1 mm y 0,01 mm Portaobjetos de calibración para microscopio</td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (magnaporthe oryzae) en cebada (hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Comprender cómo interactúan las plantas y los patógenos, y si esa interacción culmina en defensa o enfermedad, es necesario para desarrollar estrategias más sólidas y sostenibles para la salud de las plantas. Los avances en los métodos que obtienen imágenes más efectivas de muestras de patógenos de plantas durante la infección y la colonización han producido herramientas como el ensayo de la vaina de la hoja de arroz, que ha sido útil para monitorear la infección y los eventos de colonización temprana entre el arroz y el patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemi-biotrófico causa una pérdida grave de enfermedades en el arroz y las monocotiledóneas relacionadas, incluyendo el mijo, el centeno, la cebada y, más recientemente, el trigo. El ensayo de la vaina de la hoja, cuando se realiza correctamente, produce una sección de planta ópticamente clara, de varias capas de espesor, que permite a los investigadores realizar imágenes de células vivas durante el ataque de patógenos o generar muestras fijas teñidas para características específicas. Las investigaciones celulares detalladas sobre la interacción cebada-M. oryzae se han quedado atrás de las del huésped del arroz, a pesar de la creciente importancia de este grano como fuente de alimento para animales y humanos y como bebidas fermentadas. Aquí se informa el desarrollo de un ensayo de vaina de hoja de cebada para estudios intrincados de las interacciones de M. oryzae durante las primeras 48 h después de la inoculación. El ensayo de la vaina de la hoja, independientemente de la especie que se esté estudiando, es delicado; Se proporciona un protocolo que cubre todo, desde las condiciones de crecimiento de la cebada y la obtención de una vaina foliar, hasta la inoculación, incubación e imágenes del patógeno en las hojas de las plantas. Este protocolo se puede optimizar para la detección de alto rendimiento utilizando algo tan simple como un teléfono inteligente para fines de imagen.

En la figura 1 se muestra una representación del flujo de trabajo inicial para esta técnica. Las vainas se cosecharon de plantas de cebada susceptibles "Lacey" de 14 días de edad (H. vulgare). Los conidios se cosecharon de placas esporuladas de M. oryzae OMA de 10 días de edad, con una suspensión conidial preparada utilizando ddH2O estéril para una concentración final de 5 x 104 esporas por mL. La suspensión del inóculo se aplicó directamente a las vai...

Este es un protocolo sencillo de un ensayo de vaina de hoja de cebada que utiliza reactivos mínimos y equipo de laboratorio común (incluido un teléfono inteligente básico). El propósito es visualizar el proceso de infección temprana de la enfermedad blástica en laboratorios sin acceso a equipos avanzados de microscopía.

Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Nuestro protocolo es un método simplificado que permite a los investigadores visualizar los pasos tempranos de infección de tipo salvaje y mutantes fúngicos genéticos sin el uso de equipos costosos. La principal ventaja de esta técnica es el uso de suministros básicos de laboratorio para responder preguntas biológicas complejas y para la detección rápida de mutantes fúngicos para su posterior análisis. Una parte difícil de esta técnica es el tratamiento de la vaina.La vaina es una capa delgada de células que pueden dañarse fácilmente, por lo que un manejo cuidadoso es esencial para un experimento exitoso. Para comenzar, seleccione la cebada cultivada hasta la segunda etapa de hoja. Y usando tijeras estériles, corte la planta de cebada justo por encima de la línea del suelo.Usando fórceps y un bisturí, corte cuidadosamente la vaina de la primera hoja que está abierta longitudinalmente. Y usando los fórceps, retírelo de la base de la segunda hoja. Usando un bisturí, corte la mayor parte de la primera hoja de la vaina, dejando solo 0.5 pulgadas del tejido de la hoja para montar.Coloque la primera hoja plana en una placa de Petri estéril de 60 milímetros que contenga una toalla de papel húmeda para mantener la humedad dentro de la placa. Pegue el tejido de la hoja en el fondo de la placa de Petri. Seleccione una placa de cultivo de oryzae Magnaporthe de nueve a 12 días de edad y agréguele de 0.5 a dos mililitros de agua estéril.Usando un bucle de inoculación estéril, raspe suavemente el micelio para liberar los conidios adjuntos. Pipetea cuidadosamente la suspensión conidial en un tubo de microcentrífuga que contenga un pequeño trozo de tela de queso para filtrar cualquier trozo grande de micelio de la suspensión conidial. Si es necesario, diluya la concentración de esporas con agua estéril a cinco veces 10 a la cuarta esporas por mililitro, ya que una concentración demasiado alta hace que las imágenes de los sitios de infección individuales sean un desafío.Dependiendo del tamaño de la vaina, pipetear cuidadosamente de 25 a 50 microlitros de la suspensión conidial dentro de la vaina de la hoja enrollada. A continuación, llene cuatro o cinco vasos de precipitados de 500 mililitros con agua destilada doble y caliente hasta que cocine al vapor. Sostenga la tapa de la placa de Petri sobre uno de los vasos humeantes para atrapar la humedad dentro del plato.Apile las placas de la vaina de las hojas infectadas y rodéelas con los vasos calientes restantes, ya que crea un ambiente húmedo y húmedo para que las esporas germinen. Proteja esta configuración de la luz cubriéndola con una caja de goma o plástico de color sólido y dejándola sin interrupciones durante 48 horas o el punto de tiempo deseado para la obtención de imágenes. Prepare la mancha mezclando ácido acético al 45% recién diluido y azul de tripano al 0,1%.Alícuota un mililitro de la solución de colorante en tubos de microcentrífuga. Con un bisturí, corte cuidadosamente la vaina de la hoja lejos de la cinta. Con fórceps, coloque la vaina en el tubo de microcentrífuga y asegúrese de que esté completamente sumergida en la solución de colorante.Deje reposar los tubos durante dos horas en un bloque de calor de 40 grados centígrados o baño de agua para que el tinte penetre en la hoja. A continuación, enjuague cuidadosamente las vainas de las hojas tres veces con glicerol fresco al 60% para eliminar el tinte adicional. Mantenga la vaina en glicerol hasta que esté lista para montarla en portaobjetos.Coloque la funda en un portaobjetos de vidrio limpio y agregue unas gotas de 60% de glicerol. Usando un microscopio de disección y dos pares de fórceps, desenrolle cuidadosamente la vaina, dejando el centro inoculado hacia arriba. Sosteniendo la vaina abierta con los fórceps, coloque el cubreobjetos en la parte superior para evitar que la vaina se enrosque y bloquee el sitio de infección.Selle el papel de la cubierta con esmalte de uñas para el almacenamiento a largo plazo o cinta adhesiva para el almacenamiento a corto plazo. Observe las diapositivas bajo un microscopio de luz compuesta. Tome imágenes básicas con un teléfono inteligente montando un adaptador de teléfono celular en el microscopio.Para dispositivos Android, ajuste la configuración de la aplicación de la cámara para que se desactive, desactive la toma superior, deshabilite el ajuste automático de brillo y sombras y establezca la resolución de la foto en completa. Después de montar el teléfono celular, tome una imagen de un micrómetro a escala con un objetivo deseado para adquirir los datos. Ajusta el zoom del teléfono a 2,5x y mantenlo uniforme para mantener un tamaño de píxel constante.El centro de la vaina alberga la mayor concentración de esporas y appressoria infectante. Por lo tanto, apunte a nueve a 12 imágenes de cada vaina para obtener números significativos para el análisis estadístico. Los sitios de infección de la vaina se visualizaron utilizando un adaptador de microscopio para teléfonos inteligentes y teléfonos inteligentes después de la tinción con azul de tripano.El calor y el ácido acético en el procedimiento de tinción suavizan suavemente el tejido de la hoja. Los enjuagues posteriores a la tinción en glicerol al 60% no solo eliminan el exceso de mancha, sino que ayudan a reducir la dispersión de la luz causada por la hoja y mejoran la calidad de la imagen. Las desviaciones del protocolo de tinción pueden dar lugar a resultados subóptimos, como se muestra aquí.La cebada infectada con 4091 tipo salvaje produjo células infectadas con éxito identificadas por la presencia de hifas infectadas dentro del tejido de la vaina de la hoja. En el caso de la infección mutante J99A, se observó un desarrollo exitoso de appressoria y clavijas de penetración, pero no produjo hifas invasivas. El tiempo es importante para los ensayos basados en infecciones.Las plantas envejecidas adecuadamente y las esporas de hongos son esenciales para el éxito. En este estudio, observamos la presencia o ausencia de las estructuras de infección. Experimentos adicionales podrían responder preguntas sobre el fenotipo de la estructura de la infección y la de las hifas invasoras.Nuestra metodología no es nueva, sino una versión simplificada y accesible de un experimento más complejo y costoso.

visualizing-early-infection-sites-rice-blast-disease-magnaporthe

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Fuente: Wen, J., Pasman, et. al., Visualización de germinosomas y la membrana interna en esporas de Bacillus subtilis . (2019)Este video demuestra el uso de microscopía de iluminación estructurada para adquirir imágenes de fluorescencia tridimensionales que revelan la organización de las proteínas de germinación dentro de la espora bacteriana.

Visualización de proteínas de germinación en la membrana interna de esporas bacterianas

Este video muestra una técnica para establecer la infección por el hongo patógeno Magnaporthe grisea en las hojas de la planta de arroz. La suspensión de conidios fúngicos se rocía en secciones de hoja de arroz y la progresión de la enfermedad se evalúa mediante la puntuación de la formación de lesiones necróticas.

Una técnica de inoculación por aspersión para establecer una infección fúngica en las hojas de la planta de arroz

Este video demuestra el establecimiento de la infección de la hoja de la planta de arroz a través de la inoculación hiriente con micelio de Magnaporthe grisea. El tubo germinativo derivado de las esporas de hongos penetra en la capa epidérmica, lo que provoca una infección del tejido y lesiones en las hojas. Este método ayuda a la detección de patotipos y mejora la comprensión de la resistencia de las plantas para el mejoramiento molecular.

Establecimiento de la infección de la hoja de la planta de arroz a través de la inoculación de hongos a través de heridas

Aquí, presentamos un protocolo para prueba de virulencia de la planta con el patógeno de la planta grisea de Magnaporthe. Este informe contribuirá a la proyección a gran escala de los patotipos de aislamientos de hongos y servir como un excelente punto de partida para la comprensión de los mecanismos resistentes de las plantas durante la reproducción molecular.

La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Este protocolo permite la preparación de secciones transversales de semillas de cereales (por ejemplo, arroz) para el análisis de la morfología del endospermo y los gránulos de almidón mediante microscopía electrónica de barrido.

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

El presente protocolo describe una técnica de limpieza para los brotes de arroz, que son difíciles de preparar para las observaciones estructurales internas debido a la naturaleza dura, gruesa o en capas de los tejidos. Este método facilita las observaciones de fluorescencia continua y profunda, incluso en plantas de arroz adultas.

Observación de fluorescencia profunda en brotes de arroz mediante tecnología de limpieza

El presente protocolo describe un método optimizado para la observación histológica de agallas inducidas por Plasmodiophora brassicae. Las secciones de vibratomo de los hipocótilos se eliminan antes de las imágenes de fluorescencia para estudiar la participación de factores de transcripción y fitohormonas durante la progresión de la enfermedad. Este protocolo supera las limitaciones de incrustación de resina, permitiendo la visualización en planta de proteínas fluorescentes.

Combinación de microscopía de limpieza y fluorescencia para visualizar cambios en la expresión génica y respuestas fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Aquí, describimos un método para la detección en tiempo real de la producción de especies reactivas de oxígeno apoplásico (ROS) en tejidos de arroz en la respuesta inmune desencadenada por patrones moleculares asociados a patógenos. Este método es simple, estandarizado y genera resultados altamente reproducibles en condiciones controladas.

Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

Este artículo describe un protocolo para generar inóculo de hongos micorrízicos arbusculares (AM) para investigar la tolerancia al estrés salino mejorado por AM en arroz.

Producción de inóculo fúngico micorrízico arbuscular (AM) y evaluación fenotípica de la simbiosis entre arroz y MA en condiciones salinas

Aprende a visualizar los sitios de infección temprana de Magnaporthe oryzae en cebada usando equipo básico de laboratorio. Este método accesible permite estudiar mutantes fúngicos sin microscopía avanzada.

Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente (Video) | JoVE Journal

Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente

Explorar más videos