Name: Análisis de expresión génica en folículos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a aislar folículos ováricos humanos para análisis de expresión génica mediante técnicas enzimáticas y mecánicas controladas. Este método preserva la integridad celular y permite estudiar enfermedades ováricas.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de Excelencia de la Ciencia (EOS) (ID: 30443682). I.D. es investigador asociado en Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Erasme (Bruselas, Bélgica). La paciente incluida en este protocolo se sometió a criopreservación de tejido ovárico (OTC) para la preservación de la fertilidad antes de la exposición a la quimioterapia en 2000. La paciente firmó un consentimiento informado por escrito para donar su tejido congelado residual a la investigación al final del período de almacenamiento.
1. Descongelación del tejido ovárico criopreservado
<ol><li>Prepare una placa de 6 pocillos que contenga cinco soluciones de descongelación. El primer pocillo contiene 5 ml de solución crioprotectora compuesta de Leibovitz-15 medio, 0,1 mol/L de sacarosa, 1,5 mol/L de dimetilsulfóxido (DMSO) y 1% de albúmina sérica humana (HSA). Los siguientes pocillos contienen 5 ml de medio Leibovitz-15 con concentraciones decrecientes de crioprotector: 1 mol/L, 0,5 mol/L y 2 x 0 mol/L DMSO. NOTA: La solución crioprotectora puede diferir según el protocolo utilizado en la clínica de fertilidad.</li>
	<li>Extraiga un vial que contenga un fragmento cortical ovárico de nitrógeno líquido de acuerdo con las normas de seguridad (guantes criogénicos, gafas protectoras y zapatos cerrados) y mantenga el tubo a temperatura ambiente (RT) durante 30 s.</li>
	<li>Remoje el vial en agua doble destilada durante 2 minutos en RT con agitación suave antes de abrir el vial bajo una campana vertical y transferirlo directamente al primer pocillo de la placa de 6 pocillos (en hielo).</li>
	<li>Transfiera el fragmento sucesivamente a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, cada uno de los cuales contiene concentraciones decrecientes de crioprotector en 5 ml de medio de Leibovitz-15. Agite suavemente el tejido en cada medio durante 5 minutos (sobre hielo).</li>
</ol>2. Aislamiento del folículo
NOTA: Todos los experimentos se llevan a cabo utilizando materiales libres de RNasa y bajo una capucha vertical.
<ol><li>Transfiera el tejido descongelado a una placa de Petri cuadriculada de 2 mm llena con 10 ml de medio de disección (medio Leibovitz-15, piruvato de sodio [2 mmol / L], L-glutamina [2 mmol / L], HSA [0.3%], penicilina G [30 μg / ml] y estreptomicina [50 μg / ml]). Ajuste el tamaño del tejido con un bisturí si es necesario. NOTA: Dependiendo del protocolo clínico, el tamaño del tejido congelado puede variar de 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Para este protocolo, se utilizaron dos tiras de 4 mm x 2 mm x 1 mm.</li>
	<li>Apilar las tres piezas de la cortadora de tejido, colocar el fragmento entre los dos bloques y cortar el fragmento por la mitad con una cuchilla, deslizándose a través de los bloques para obtener dos fragmentos de 0,5 mm de espesor.</li>
	<li>Utilice el picador de tejido para cortar el fragmento y obtener trozos más pequeños. Si es necesario, corte las piezas restantes manualmente con un bisturí hasta que el tejido esté totalmente destrozado.</li>
	<li>Transfiera el tejido fragmentado a una placa de Petri cuadriculada llena de 7 ml de medio de digestión (medio de cultivo [medio 5A de McCoy, 3 mmol / L de glutamina, 0.1% HSA, 30 μg / ml de penicilina G, 50 μg / ml de estreptomicina, 2.5 μg / ml de transferrina, 4 ng / ml de selenio y 50 μg / ml de ácido ascórbico] suplementado con 0.2% de colagenasa y 0.02% de DNasa).</li>
	<li>Poner el plato en la incubadora al 5% deCO2 y 37 °C. Cada 10 minutos, saque la placa de Petri de la incubadora y enjuague el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Después de 45 minutos de incubación en el medio de digestión, coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico con un rango de aumento de 5x-6.3x y recupere los folículos con una pipeta microcapilar. Seleccione los folículos de interés y aíslelos succionándolos con una pipeta bucal. NOTA: El pipeteo de boca debe realizarse con cuidado para evitar la pérdida de material en la tubería y la contaminación.</li>
	<li>Si los folículos permanecen atrapados en un pedazo de corteza, aíslelos mecánicamente con dos jeringas de 27 G arrancando la corteza con la punta de las jeringas para liberar los folículos del estroma. NOTA: No toque los folículos con las jeringas para evitar dañarlos.</li>
	<li>Transfiera los folículos con el microcapilar en una placa de 4 pocillos que contenga gotas de 15 μL del medio de cultivo calibrado cubierto por 500 μL de cultivo oleoso (1 a 10 folículos por gota). Este paso mantiene la viabilidad del folículo durante el proceso de recolección. Al final del procedimiento, enjuague los folículos dos veces durante 5 s cada vez en dos gotas de 15 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) cubierta por 500 μL de cultivo de aceite (en hielo).</li>
	<li>Recoja 20 folículos con una cantidad mínima de PBS usando la pipeta bucal (máximo 10 μL) en un tubo vacío y mantenga el tubo en hielo. NOTA: Para la estabilidad del ARN, es crucial realizar los pasos 2.8 y 2.9 en hielo. Se necesitan alrededor de 20 folículos (<75 μm) para tener suficiente ARN para la RT-qPCR estándar (SYBR Green).</li>
	<li>Después de un máximo de 90 minutos de incubación en el medio de digestión, detener la reacción enzimática añadiendo a la placa de Petri un exceso de solución bloqueante fría (4 °C) (7,5 ml) compuesta de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%. NOTA: La solución de bloqueo se puede agregar tan pronto como el experimentador observe folículos pegados a la placa o folículos dañados (forma asimétrica o folículos de color más oscuro). Se aconseja realizar el aislamiento del folículo en un plazo máximo de 2,5 h para evitar el daño folicular y realizar la extracción de ARN inmediatamente después del aislamiento.</li>
</ol>3. Extracción de ARN
NOTA: La extracción de ARN se realiza siguiendo las instrucciones proporcionadas con un kit de extracción de ARN adaptando los volúmenes de elución.
<ol><li>Suspender los folículos aislados añadiendo 100 μL de la solución de lisis proporcionada con el kit de extracción de ARN al tubo que contiene los folículos bajo una campana química, y vórtice a alta velocidad (2.500 rpm/min) para romper la estructura de los folículos. Agregue 50 μL de etanol (100%) al tubo y haga un vórtice brevemente a alta velocidad. NOTA: Como el tampón de lisis contiene 2-mercaptoetanol y ácido tiociánico, este paso debe realizarse con precaución bajo una campana química.</li>
	<li>Transfiera el volumen total del tubo (aproximadamente 160 μL) a un conjunto de cartucho de microfiltro que comprenda una columna y un tubo colector, y centrifugarlo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Lavar la columna con 180 μL de solución de lavado 1, suministrada con el kit, y centrifugar el tubo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 180 μL de solución de lavado 2/3, suministrada con el kit, a la columna y centrifugar durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Realice este paso dos veces. Centrifugar el tubo por última vez durante 1 minuto para secar el filtro y colocar un nuevo tubo de recolección debajo del cartucho.</li>
	<li>Realizar la elución de los ácidos nucleicos en dos pasos:<ol><li>Primero, agregue 8 μL de solución de elución caliente (75 °C) al filtro, espere 1 min a RT y centrifugar durante 30 s a 16,363 x g a 4 °C.</li>
		<li>Repita este paso con 7 μL de solución de elución. NOTA: El tubo que contiene los ácidos nucleicos eluidos debe mantenerse en hielo. Para evitar la contaminación del ADN, se recomienda encarecidamente un paso suplementario de degradación del ADN: paso 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar el tubo con 2 UI de DNasa y 1x tampón DNasa durante 20 min a 37 °C. Bloquear la actividad enzimática con 1/10 de reactivo de inactivación de DNasa durante 2 min en RT.</li>
	<li>Centrifugar el tubo durante 1,5 min a 16.363 x g a 4 °C. Finalmente, recoge la suspensión que contiene el ARN y transfiérela a un nuevo tubo.</li>
	<li>Evaluar la cantidad de ARN presente en la muestra utilizando un espectrofotómetro (software NanoDrop 2000 > Ácido Nucleico > ARN). Use 1 μL de solución de elución como blanco y mida la cantidad de ARN extraída de folículos aislados con 1 μL de solución.</li>
	<li>Verifique la relación 260/280 para la pureza del ARN (alrededor de 2.0). Conservar la muestra a −80 °C, o retrotranscribirla directamente para realizar RT-qPCR. NOTA: Para evaluar la integridad del ARN, la muestra se puede procesar con un sistema de electroforesis automatizado de alta resolución antes o después de la congelación a -80 °C. En este trabajo, después de la retrotranscripción, se realizó RT-qPCR con el siguiente ciclo: Mantenga el escenario con 20 s a 50 °C y 10 min a 95 °C 40 ciclos de PCR con 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C Etapa de curva de fusión con 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C y 15 s a 60 °C</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
<li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li>
<li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li>
<li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li>
<li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417(2011).</li>
<li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li>
<li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li>
<li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation%2C+homogenization%2C+and+serial+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).</li>
<li>Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+%28IVG%29+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li>
<li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure%3A+Alternatives%2C+perspectives+and+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li>
<li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation%3A+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li>
<li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li>
<li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients%3A+A+cost-effectiveness+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li>
<li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue%3A+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility%22%5BJournal%5D)">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li>
<li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li>
<li>Dong, F. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li>
<li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li>
<li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li>
<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

La criopreservación del tejido ovárico es un enfoque prometedor para preservar la fertilidad de los pacientes con cáncer. En la clínica, el tejido cortical descongelado es injertado de nuevo en la paciente después de la remisión, permitiendo la reanudación de la función ovárica y la fertilidad19,20. Además del uso clínico, los fragmentos ováricos residuales también pueden ser donados para la investigación al final del período de almacenamiento para estudiar los m...

El ovario es un órgano complejo compuesto de unidades funcionales y estructurales, incluidos los folículos dentro de la corteza y el estroma. La foliculogénesis, el proceso de activación, crecimiento y maduración del folículo desde un estado quiescente primordial hasta un folículo maduro capaz de ser fertilizado y apoyar el desarrollo embrionario temprano, se estudia ampliamente en la investigación1. Desentrañar los mecanismos que impulsan este fenómeno podría mejorar la atención de la fertilidad para las mujeres2. Los análisis en tejido humano fijo permiten evaluar la expresión proteica y la localización génica dentro de las unidades funcionales del ovario 3,4. Sin embargo, se necesitan técnicas específicas para disociar los folículos de la corteza circundante para evaluar con precisión los niveles de expresión génica dentro de los folículos ováricos. Así, en un estudio previo, se desarrolló una técnica de aislamiento de folículos para permitir análisis de expresión génica directamente desde la unidad funcional del ovario5. Se han desarrollado diferentes enfoques, como la digestión enzimática y/o el aislamiento mecánico, así como la microdisección por captura láser, que permiten el aislamiento del folículo dentro de un pedazo de tejido 6,7,8,9. El aislamiento folicular es ampliamente utilizado, ya sea con tejido ovárico humano o animal, para evaluar los perfiles de expresión génica de los folículos en todas las etapas de desarrollo10,11,12. Sin embargo, un procedimiento de aislamiento óptimo debe tener en cuenta la frágil estructura del folículo dentro de la corteza densa y, por lo tanto, debe realizarse con cuidado para evitar cualquier daño7. Este manuscrito describe un procedimiento, adaptado de un protocolo descrito por el laboratorio de Woodruff, para aislar folículos humanos de la corteza ovárica congelada-descongelada con el fin de realizar análisis de expresión génica13.
El primer paso del aislamiento del folículo ovárico del tejido humano congelado es el procedimiento de descongelación. Este proceso se realiza con base en el protocolo clínico utilizado para el injerto de tejido ovárico criopreservado, como se describió anteriormente14,15. El proceso tiene como objetivo eliminar los agentes crioprotectores enjuagando la corteza ovárica en concentraciones decrecientes del medio. Luego, el tejido se fragmenta antes del aislamiento enzimático y mecánico para recuperar los folículos. Los folículos en diferentes etapas se pueden distinguir utilizando un microscopio estereoscópico con alto aumento y óptica de buena calidad para aislar los de interés. Cada folículo aislado se mide utilizando una regla integrada en el microscopio, y los folículos se pueden agrupar de acuerdo con su etapa de desarrollo: folículos primordiales (30 μm), folículos primarios (60 μm), folículos secundarios (120-200 μm) y folículos antrales (>200 μm)16. Se puede realizar una clasificación adicional de acuerdo con la morfología de los folículos: los folículos primordiales tienen una capa de células de la granulosa aplanada (GC), los folículos primarios tienen una capa de GC cuboidales, los folículos secundarios tienen al menos dos capas de GC cuboidales, y la presencia de una cavidad entre los GC caracteriza la etapa antral. Cuando se seleccionan folículos de interés, se realiza la extracción de ARN. La cantidad y la calidad del ARN se evalúan antes de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri cuadriculada de 2 mm</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumento bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>2100 Software experto</td><td>Agilent</td><td>versión B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 4 pocillos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent ARN total 6000 pico kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV LifeTechnologies</td><td></td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript transcriptasa inversa</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A + bicarbonato + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>Picadora de tejidos McIlwain</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Microcapilar RI EZ-Tips 200 &micro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Microcapilar RI EZ-Tips 75 &micro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c software operativo</td><td>ThermoFisher</td><td>versión 1.6</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR mezcla maestra verde</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Cartillas: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Imprimaciones: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>Real-Time qPCR Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN micro total acuoso</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Selenio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II&nbsp; CO2&nbsp; incubadoras</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Stadie-Riggs cortadora de tejidos</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

análisis de expresión génica en folículos humanos

Gene Expression Analyses in Human Follicles

El ovario es un órgano heterogéneo compuesto por diferentes tipos de células. Para estudiar los mecanismos moleculares que ocurren durante la foliculogénesis, la localización de proteínas y la expresión génica se pueden realizar en tejido fijo. Sin embargo, para evaluar adecuadamente los niveles de expresión génica en un folículo humano, esta estructura compleja y delicada debe aislarse. Por lo tanto, se ha desarrollado un protocolo adaptado previamente descrito por el laboratorio de Woodruff para separar los folículos (el ovocito y las células de la granulosa) de su entorno circundante. El tejido cortical ovárico se procesa primero manualmente para obtener pequeños fragmentos utilizando dos herramientas: una cortadora de tejidos y una cortadora de tejidos. Luego, el tejido se digiere enzimáticamente con 0,2% de colagenasa y 0,02% de DNasa durante al menos 40 minutos. Esta etapa de digestión se realiza a 37 °C y 5% deCO2 y se acompaña de pipeteo mecánico del medio cada 10 min. Después de la incubación, los folículos aislados se recogen manualmente utilizando una pipeta microcapilar calibrada bajo aumento al microscopio. Si los folículos todavía están presentes en las piezas de tejido, el procedimiento se completa con microdisección manual. Los folículos se recogen en hielo en un medio de cultivo y se enjuagan dos veces en gotitas de solución salina tamponada con fosfato. Este procedimiento de digestión debe controlarse cuidadosamente para evitar el deterioro del folículo. Tan pronto como la estructura de los folículos parece estar comprometida o después de un máximo de 90 minutos, la reacción se detiene con una solución bloqueadora de 4 °C que contiene un 10% de suero bovino fetal. Se debe recolectar un mínimo de 20 folículos aislados (con un tamaño inferior a 75 μm) para obtener una cantidad adecuada de ARN total después de la extracción de ARN para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Después de la extracción, la cuantificación del ARN total de 20 folículos alcanza un valor medio de 5 ng / μL. El ARN total se transcribe en ADNc, y los genes de interés se analizan más a fondo utilizando RT-qPCR.

Usando este procedimiento de aislamiento, el experimentador puede recuperar folículos del entorno estromal para realizar análisis específicos de expresión génica. Según el tamaño y la morfología de los folículos, es posible diferenciar las diferentes etapas de la foliculogénesis. El experimentador puede seleccionar folículos de interés según su tamaño utilizando una pipeta microcapilar adaptada. Mediante el uso de un microcapilar de máximo 75 μm, es posible discriminar folículos primordiales y primarios de folículos secu...

Aquí, describimos un protocolo que describe cómo aislar los folículos ováricos humanos del tejido cortical congelado-descongelado para realizar análisis de expresión génica.

Análisis de expresión génica en folículos humanos

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Este protocolo describe un método eficiente para aislar los folículos ováricos de las células del estroma circundantes para evaluar los análisis de expresión génica en estas células germinales. Esta técnica, que utiliza aislamientos enzimáticos y mecánicos controlados, permite la recuperación de folículos manteniendo su integridad. Siguiendo este protocolo, el investigador puede evaluar expresiones génicas específicas de estas células.La técnica podría utilizarse para comprender mejor el déficit de expresión génica en los folículos relacionado con enfermedades que afectan la función ovárica o después de la exposición a agentes tóxicos. Comience a preparar una placa de seis pocillos agregando cinco mililitros de solución crioprotectora al primer pocillo y cinco mililitros de medio Leibovitz 15 con concentraciones decrecientes de crioprotector a los siguientes cuatro pocillos. Extraiga un vial que contenga un fragmento cortical ovárico de nitrógeno líquido de conformidad con las normas de seguridad.Después de 30 segundos a temperatura ambiente, o RT, remoje el vial en agua destilada doble durante dos minutos. Dentro de una campana vertical, agite suavemente y abra el vial del fragmento cortical ovárico antes de transferir el contenido al primer pocillo de la placa de seis pocillos colocada en hielo. Luego, transfiera el fragmento cortical ovárico en el primer pocillo sucesivamente a cada pocillo de la placa de seis pocillos que contiene concentraciones decrecientes de crioprotector en cinco mililitros de Leibovitz 15 medio.Agite suavemente el tejido en cada medio durante cinco minutos. Para el aislamiento del folículo, transfiera el tejido ovárico descongelado a una placa de Petri cuadriculada de dos milímetros llena con 10 mililitros de medio de disección, 30 microgramos por mililitro de penicilina G y 50 microgramos por mililitro de estreptomicina. Ajuste el tamaño del tejido con el bisturí, si es necesario.Apile las tres piezas de la cortadora de tejido y coloque el fragmento ovárico entre los dos bloques. Cortar el fragmento por la mitad con una cuchilla, deslizando a través de los bloques para obtener dos fragmentos de 0,5 milímetros de espesor. Corte el tejido con el picador de tejido para obtener las piezas más pequeñas.Si es necesario, corte las piezas restantes manualmente con el bisturí hasta que el tejido se rompa. Una vez que el tejido se rompe, transfiera el tejido fragmentado a una placa de Petri cuadriculada llena de siete mililitros de medio de digestión antes de colocar el plato en la incubadora al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Tome la placa de Petri de la incubadora cada 10 minutos.Enjuague el tejido pipeteando el medio de digestión hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de un mililitro. Después de 45 minutos de incubación en el medio de digestión, coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico con un rango de aumento de cinco a 6.3 veces y recupere los folículos con una pipeta microcapilar. Seleccione los folículos de interés y aíslelos succionándolos con una pipeta bucal.Si los folículos permanecen atrapados en un pedazo de corteza, aíslelos mecánicamente con dos jeringas de calibre 27 arrancando la corteza con la punta de las jeringas y liberando folículos del estroma. Usando el microcapilar, transfiera los folículos aislados a una placa de cuatro pocillos que contenga 15 microlitros del medio de cultivo calibrado cubierto por 500 microlitros de cultivo de aceite. Después de transferir de uno a 10 folículos, enjuáguelos dos veces en dos gotas de 15 microlitros de PBS cubiertos con 500 microlitros de cultivo de aceite durante cinco segundos cada uno.Usando la pipeta bucal, recoja 20 folículos con PBS mínimo en un tubo vacío y mantenga el tubo en hielo. Después de 90 minutos de incubación en el medio de digestión, detenga la reacción enzimática agregando una solución de bloqueo en frío. Bajo la campana química, suspenda los folículos aislados en 100 microlitros de la solución de lisis provista con el kit de extracción de ARN.Vortex los folículos aislados a 2500 RPM por minuto para romper su estructura, luego agregue 50 microlitros de 100% etanol al tubo. Y brevemente vortex el tubo a alta velocidad. Después del vórtice, transfiera el volumen total del tubo a un conjunto de cartucho de microfiltro, que comprende una columna y un tubo de recolección.Y centrifugar el conjunto durante 10 segundos a 16, 363g a cuatro grados centígrados. Lave la columna con 180 microlitros de Wash Solution 1 provisto con el kit antes de centrifugar el tubo durante 10 segundos. Después de dar dos lavados de 180 microlitros de Wash Solution 2, 3 a la columna, seque el filtro centrifugando el tubo por última vez y coloque un nuevo tubo de recolección debajo del cartucho.Para realizar la elución de los ácidos nucleicos, primero agregue ocho microlitros de solución de elución de 75 grados centígrados al conjunto del filtro. Después de un minuto, centrifugar el conjunto durante 30 segundos. Repita este paso con siete microlitros de Elution Solution.Una vez hecho esto, agregue dos unidades internacionales DNasa y DNasa tampón al tubo e incube el tubo durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Bloquear la actividad enzimática con un reactivo de inactivación de DNasa de uno por 10 durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar el tubo durante 1,5 minutos a 16, 363 g a cuatro grados centígrados y transferir la suspensión que contiene el ARN a un nuevo tubo.Usando un espectrofotómetro, evalúe la cantidad de ARN en la muestra. Use una solución de elución de microlitros como una solución en blanco y una solución de microlitro de ARN extraído de folículos aislados. Compruebe si la relación 260/280 es de alrededor de 2.0 para la pureza del ARN.Y almacene la muestra a menos 80 grados centígrados o retrotranscriba directamente para realizar RT-qPCR. Utilizando este protocolo, se procesaron los dos fragmentos ováricos homogeneizados de 4x2x1 milímetros de la misma paciente para aislar los folículos. La cuantificación del ARN reveló que se extrajeron 4,8 nanogramos por microlitro de ARN total de folículos de menos de 75 micrómetros de tamaño con una relación de pureza de 1,89.De los folículos de menos de 200 micrómetros, se extrajeron 10,5 nanogramos por microlitro de ARN total con una relación de pureza de 1,74. Los valores del número de integridad del ARN, o RIN, fueron 7.1 y 7.9 en los tubos uno y dos, respectivamente, validando la calidad del ARN de nuestras muestras. Después de ejecutar un ciclo estándar en un sistema de PCR en tiempo real, los umbrales de ciclo, o TC, obtenidos fueron 30,87 y 29,56 para HPRT, 33,5 y 31,77 para el ligando del kit, y 30,71 y 30,57 para GDF9.La digestión enzimática del tejido es un punto crítico. El experimentador tiene que evaluar continuamente y asegurar la integridad del folículo durante la reacción deteniéndola cuando sea necesario. Además de los análisis de expresión génica, los folículos aislados se utilizan para desarrollar sistemas experimentales para preservar la fertilidad de los pacientes con cáncer, como el cultivo de folículos in vitro o el ovario artificial.La técnica de aislamiento requirió una curva de aprendizaje para recuperar un alto número de folículos intactos. Se aconseja a los investigadores que se aseguren de que el tejido esté bien destrozado antes de la digestión.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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