Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

DMS-MaP es un método basado en secuenciación que nos permite obtener una instantánea de la estructura del ARN y aprender cómo cambia en diferentes condiciones. A diferencia de los métodos convencionales de determinación de estructuras, como la cristalografía y la microscopía electrónica, DMS-MaP se puede utilizar en células y conjuntos de estructuras de ARN deconvolutas. Como la estructura del ARN tiene implicaciones en una multitud de fenómenos biológicos, nuestro método podría proporcionar información mecanicista en casi cualquier campo de la investigación biológica.

Comience transfiriendo 89 microlitros del tampón de repliegue en un tubo designado de 1.5 mililitros para cada reacción que tenga un volumen final de 100 microlitros. Precaliente el tubo a 37 grados centígrados en un termoagitador colocado debajo de una campana química. Agregue 10 microlitros de agua libre de nucleasa en un tubo de PCR y transfiera de uno a 10 picomoles de ARN en él.

Incubarlo en un termociclador a 95 grados centígrados durante un minuto para desnaturalizar el ARN. Y luego coloque inmediatamente el tubo en un bloque de hielo para evitar el plegamiento incorrecto del ARN. Ahora, para renovar el ARN, agregue la muestra al tubo designado que contiene el tampón de repliegue a 37 grados centígrados y mezcle bien antes de incubarlo durante 10 a 20 minutos.

A continuación, agregue un microlitro de sulfato de dimetilo al 100%, o DMS, que tenga una concentración de 10.5 molar en el tubo que contiene la muestra de ARN, e incube la mezcla de reacción durante cinco minutos mientras la agita a 800 a 1, 400 rotaciones por minuto. Después de la reacción de cinco minutos, apagarlo con 60 microlitros de 100% beta-mercaptoetanol, y mezclar bien antes de vortexing e inmediatamente colocar el ARN en hielo. Luego limpie el ARN y eluya en 10 microlitros de agua libre de nucleasa.

Cuantificar el ARN usando un espectrofotómetro. Finalmente, almacene el ARN modificado a menos 80 grados centígrados. Después de agregar la mezcla de reacción en el tubo de PCR, transfiera al menos 100 nanogramos del ARN modificado eluyido en 10 microlitros de agua libre de nucleasas al tubo de PCR.

Incubar la mezcla a 57 grados centígrados durante 30 minutos a 1,5 horas en un termociclador. 30 minutos es suficiente para hacer un producto que contiene 500 nucleótidos. A continuación, agregue un microlitro de hidróxido de sodio de cuatro molares, mezcle bien con pipeta e incube a 95 grados centígrados durante tres minutos para degradar el ARN y libere TGIRT del ADN complementario.

Usando un enfoque basado en columnas para eliminar los cebadores, limpie el ADN complementario. Y realizar PCR para amplificarlo. Verifique el éxito de la PCR ejecutando dos microlitros del producto de PCR en un gel de agarosa antes de proceder a la preparación de la biblioteca.

Luego cuantifique los fragmentos extraídos usando un espectrofotómetro antes de indexar los fragmentos para su secuenciación. Transfiera las células infectadas por virus cultivadas hasta la etapa deseada de infección a una campana extractora dedicada y apropiada que tenga el nivel de bioseguridad requerido. Agregue un 2,5% de volumen de DMS al medio de cultivo que contiene las células y selle el recipiente con parafilm.

Incubar inmediatamente el recipiente a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, pipetear cuidadosamente y desechar el medio que contiene DMS en los residuos químicos apropiados. Luego agregue suavemente 10 mililitros de amortiguador de parada en las células, raspe las células y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros.

Granular las células centrifugando el tubo durante tres minutos a 3, 000 g. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular dos veces con 10 mililitros de PBS. Retire cuidadosamente el PBS residual tanto como sea posible después del lavado.

Disuelva el pellet en una cantidad adecuada de reactivo de aislamiento de ARN para realizar la extracción de ARN. A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo a un mililitro de células homogeneizadas en el reactivo de aislamiento de ARN, y vórtice durante 15 a 20 segundos hasta que la solución celular se vuelva de color rosa brillante. Espere hasta que se haya producido la separación de fases, lo que está indicado por la fase lipídica rosa que se asienta en la parte inferior.

Gire el tubo a una velocidad de alrededor de 20, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados antes de transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Limpie el ARN y eluya en un volumen suficiente de agua libre de nucleasas. Luego, después de realizar el agotamiento del ARN ribosómico utilizando el enfoque preferido, eluya el ARN en un volumen adecuado de agua libre de nucleasas y cuantifíquelo usando un espectrofotómetro.

El ARN purificado se puede utilizar de nuevo en RT-PCR. Utilizando el servidor web mencionado, los datos DMS-MaP se pueden analizar convenientemente. Las lecturas se asignan a una referencia y se cuentan las mutaciones por base.

Los archivos de promedio de población resultantes se pueden usar como restricciones en el conocido software de predicción de la estructura de ARN. Las estructuras mínimas de energía libre resultantes se pueden visualizar utilizando software como VARNA. A partir de ahora, solo la versión estable de DREAM puede desconvolucionar conjuntos de estructuras de ARN.

Sin embargo, se está trabajando para hacer que esta característica sea más accesible para toda la comunidad. La transcripción in vitro del fragmento gBlock alargado por la unión de un promotor de polimerasa T7 generó el ARN de interés, apareciendo como una sola banda a 300 nucleótidos en un gel de agarosa al 1%. El éxito de la RT-PCR específica del gen realizada en el ARN modificado con DMS se indicó mediante una sola banda a 300 pares de bases en un gel de agarosa al 2%.

El fragmento indexado apareció aproximadamente 150 pares de bases más alto como se esperaba. El tratamiento con DMS se realizó en células HCT-8 que mostraron efecto citopático cuatro días después de la infección con el virus. El ARN total extraído apareció en el gel de agarosa como dos bandas brillantes, lo que representa las subunidades 40S y 60S.

Después del agotamiento del ARN ribosómico, las dos bandas brillantes desaparecieron, dejando una mancha en el carril correspondiente. Después de la preparación de la biblioteca, las muestras tenían distribuciones de tamaño variables y aparecían como un frotis. La banda se extirpó entre 200 y 500 nucleótidos, y los dímeros adaptadores se separaron.

El modelo de estructura del genoma del SARS-CoV-2 mostró que las bases con conformación abierta tienen una mayor reactividad en comparación con las que participan en el emparejamiento de bases. El perfil de reactividad de las bases indicó que el uracilo y la guanina tenían valores bajos de reactividad y no fueron modificados por DMS. Con nuestro método, podemos predecir estructuras en células de una manera de alto rendimiento sin restricciones de tamaño.

Las métricas de control son muy importantes, ya que proporcionan información sobre la precisión de las predicciones de la estructura. Para verificar aún más la precisión de la predicción, se deben realizar más experimentos que perturben o alteren la estructura.