Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto como técnica rápida para la observación morfológica y el análisis del daño celular bacteriano
30 de junio de 2023
Aquí, presentamos la aplicación de la microscopía de fuerza atómica (AFM) como un método simple y rápido para la caracterización bacteriana y analizamos detalles como el tamaño y la forma bacteriana, las biopelículas de cultivo bacteriano y la actividad de las nanopartículas como bactericidas.
Este protocolo muestra el uso de la microscopía de fuerza atómica en modo de contacto para observar cambios en la morfología celular debido a una enfermedad o tratamiento específico. Es muy recomendable utilizar recipientes sellados para este procedimiento para evitar la contaminación y analizar la muestra fija lo antes posible para evitar el envejecimiento. Comience fijando las muestras en el portaobjetos pasando suavemente el portaobjetos sobre una llama varias veces hasta que la muestra esté seca.
Coloque las muestras fijas en una placa de Petri y transpórtelas al equipo de microscopio de fuerza atómica para su observación. A continuación, encienda la computadora y el microscopio de fuerza atómica. A continuación, seleccione el modo de contacto, las sondas ContAI-G y las opciones de pendiente automática en el software.
Establezca los valores predeterminados para el controlador Z estableciendo el punto de ajuste en 20 nanómetros, la ganancia P en 10, 000, la ganancia I en 1, 000, la ganancia D en cero y el voltaje de punta en cero milivoltios. Utilizando el cabezal de rango de escaneo de 70 micrómetros, coloque las muestras en el modo de contacto AFM. Obtenga una vista rápida de la superficie del área debajo de la sonda utilizando una cámara montada en dos lentes integradas en el cabezal de escaneo.
Ahora, elija el área deseada desplazándola manualmente en el plano XY. Permita que la sonda se acerque electrónicamente a la superficie de la muestra hasta que se alcance el contacto. Ajuste electrónicamente el plano de medición XY del escáner y la superficie de la muestra reduciendo la dirección de la pendiente XY.
Establezca los parámetros estándar del software en una línea por segundo y 256 puntos por línea. Luego realice un rango de escaneo completo de un área de 70 por 70 micrómetros. Seleccione el área más pequeña con la herramienta de zoom.
Seleccione una nueva área de la muestra retrayendo el voladizo electrónicamente y moviendo la muestra a lo largo del plano XY. A continuación, realice un nuevo análisis como se demostró anteriormente. A continuación, utilice la nivelación línea por línea en el menú de herramientas de la imagen en la selección de filtros para realizar el procesamiento de datos.
Optimice la altura máxima y mínima en la barra de color para obtener la mejor resolución de imagen. Finalmente, realice el análisis de la imagen utilizando el menú de análisis. Seleccione los puntos inicial y final con la herramienta deseada para determinar la longitud y la distancia.
El análisis microscópico de fuerza atómica de los cultivos bacterianos mostró que los cultivos de Staphylococcus aureus estaban distribuidos por zonas con agregados de cocos. El aumento de las escalas mostró que había una mayor apreciación de la distribución de la población y la morfología de los cocos. Las imágenes del modo de contacto AFM permitieron determinar el tamaño de los cocos que mostraron un ancho promedio de 1,25 micrómetros.
Pseudomonas hunanensis mostró una distribución homogénea en toda la superficie de soporte del vidrio formando una monocapa adherente. Los cultivos tenían forma de varilla con una longitud de 1,9 micrómetros y una anchura de 0,9 micrómetros. La exposición a microdilución de nanopartículas de óxido de magnesio de Staphylococcus aureus resultó en la pérdida de una superficie lisa y contornos homogéneos debido al deterioro severo de la estructura celular.
La formación de vesículas y la liberación de material citosólico se observaron en cultivos a concentraciones más altas que la CMI. Se obtuvieron resultados similares en cultivos de E. coli con los controles mostrando superficies lisas destacando su forma homogénea en forma de varilla. La estructura desapareció por completo a 1.000 PPM de exposición de nanopartículas con solo siluetas distinguibles.
Es importante realizar la fijación de la muestra correctamente, ya que es esencial para un análisis posterior. El filtro de imagen ayuda a proporcionar una buena resolución de imagen y detalles de muestra. Utilizando el método de fijación, se pueden aplicar modos AFM sin contacto, lo que puede ser útil en el estudio de las propiedades mecánicas.
Esta metodología podría ser una herramienta económica y útil para la investigación médica y microbiológica centrada en el análisis del daño celular bacteriano.
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Visión general
Este estudio utiliza microscopía de fuerza atómica (AFM) para la caracterización detallada de bacterias, enfocándose en el tamaño bacteriano, la forma, los biofilmes de cultivo y los efectos bactericidas de las nanopartículas. El protocolo enfatiza una cuidadosa preparación de muestras y técnicas de imagen específicas para observar cambios morfológicos en células bacterianas.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Microbiología
- Caracterización bacteriana
- Investigación de nanopartículas
Contexto
- La microscopía de fuerza atómica es una herramienta importante para observar la morfología bacteriana.
- Entender la formación de biofilmes bacterianos y la respuesta a bactericidas ayuda en la investigación médica.
- La preparación de muestras es crítica para obtener imágenes y análisis precisos.
Métodos utilizados
- Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto
- Cultivos de Staphylococcus aureus y Pseudomonas hunanensis
- Ensayos de exposición a nanopartículas
Resultados principales
- El análisis AFM reveló el tamaño y la distribución de células bacterianas, con Staphylococcus aureus mostrando un ancho promedio de 1.25 micrometros.
- Concentraciones aumentadas de nanopartículas de óxido de magnesio llevaron a cambios morfológicos significativos en células bacterianas.
- El estudio demuestra la efectividad de AFM para analizar la integridad estructural bacteriana.
Conclusiones
- Esta metodología resalta la utilidad de AFM en microbiología, particularmente en la evaluación del daño bacteriano.
- Los hallazgos contribuyen a una comprensión más amplia de las respuestas bacterianas a los tratamientos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
