Name: Cuantificación en tiempo real de los efectos de la TnpB asociada a la familia IS200/IS605 sobre la actividad de transposones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Aprende a cuantificar en tiempo real los efectos de TnpB sobre la actividad de transposones en células individuales de Escherichia coli mediante microscopía de fluorescencia. Este método revela que las células TnpB-positivas presentan cuatro a cinco veces mayor actividad transposónica.

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El apoyo financiero para esta investigación fue proporcionado por fondos iniciales de la Universidad de California.

1. Preparación de cultivos bacterianos
<ol><li>Cultivar la cepa MG1655 de E. coli con construcciones de transposones plásmidos (descritas previamente en Kim et al.8) durante la noche en LB con los antibióticos apropiados (25 μg/ml de kanamicina, ver Tabla de materiales) a 37 °C. NOTA: Las secuencias de los constructos utilizados y las secuencias relacionadas están disponibles como GenBank20 números de acceso OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 y OP717085.</li>
	<li>Para lograr un crecimiento exponencial en estado estacionario, los cultivos diluidos ≥100 veces en el medio M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2 SO 4, 0.5 μg / ml tiamina [vitamina B1]) suplementados con una fuente de carbono (0.5% p/v glucosa aquí) y antibióticos apropiados (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Cultivar cultivos a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) alcance ~0.2. Las culturas están listas para su uso.</li>
</ol>2. Preparación de la diapositiva
<ol><li>Prepare un portaobjetos hirviendo M63 con 0,5% p/v de glucosa y 1,5% p/v de agarosa en el microondas para derretir la agarosa y asegurarse de que esté completamente fundida y bien mezclada.</li>
	<li>Deje que la mezcla se enfríe a ~55 °C antes de agregar antibióticos e inductores (25 μg/ml de kanamicina y 10 ng/μl de anhidrotetraciclina [aTc], ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque un portaobjetos de microscopio en el banco de trabajo. Apila dos diapositivas más perpendiculares a la primera y coloca otra en la parte superior, paralela a la diapositiva inferior. Asegúrese de que haya un espacio igual a un grosor de diapositiva entre las diapositivas inferior y superior. Pipetea ~1 ml de la mezcla de agarosa M63 en este espacio entre las diapositivas lentamente para crear un pequeño cuadrado de gel.</li>
	<li>Una vez que el gel se haya solidificado (~10-15 min), deslice el portaobjetos superior para retirarlo. Recorte la almohadilla de agarosa con una hoja de afeitar o un cuchillo. A continuación, pipetear 2,5 μL del cultivo (paso 1.3) y colocar el cubreobjetos encima.</li>
	<li>Selle el espacio entre la diapositiva y el cubreobjetos con epoxi (consulte la Tabla de materiales). Dejar secar el epoxi y que las células se depositen en la almohadilla de agarosa durante al menos 1 h a 37 °C.</li>
</ol>3. Microscopía de fluorescencia timelapse
<ol><li>Colocar la muestra preparada (paso 1.3) en un microscopio de fluorescencia (véase la Tabla de materiales) en un ambiente calentado y mantenido a 37 °C.<ol><li>Establezca los tiempos de exposición apropiados para la cámara utilizada para la adquisición de imágenes. Ajuste la intensidad de la iluminación para minimizar el fotoblanqueo. NOTA: Para el presente estudio se utilizó un tiempo de exposición de 2 s para cada longitud de onda.</li>
		<li>Para cada longitud de onda, encuentre un campo de visión (FOV) que contenga una fluorescencia mínima. Adquiera imágenes para usar durante el análisis para la sustracción de fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure un protocolo para adquirir imágenes en una cuadrícula en diferentes longitudes de onda y en intervalos de tiempo regulares.<ol><li>Codifica la fotografía timelapse en el protocolo. Establezca la frecuencia de adquisición en el intervalo de tiempo deseado (20 minutos aquí) y la duración total del lapso de tiempo en la duración deseada (24 h).</li>
		<li>Codifique las longitudes de onda apropiadas en el protocolo (dependiendo de la construcción utilizada). NOTA: El pico de excitación mCherry está en 587 nm y el pico de emisión en 610 nm21; mVenus está en 515 nm y 527 nm12, mientras que mCerulean3 está en 433 nm y 475 nm11.</li>
		<li>Establezca el tamaño de la cuadrícula para capturar entre el número deseado de FOV. NOTA: Los datos representativos que se muestran aquí utilizaron 8 x 8 FOV.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de imágenes
<ol><li>Realice la sustracción de fondo en cada canal de color utilizando las imágenes de fondo respectivas adquiridas en el paso 3.1.2. Para todos los pasos de análisis, utilizamos módulos estándar en la plataforma de código abierto Fiji22 (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Aproximar la población total en cada punto en el tiempo mediante el umbral del canal mCerulean y dividiendo el área umbral por el área celular promedio.</li>
	<li>Para contar los eventos de escisión únicos, tome la derivada de tiempo del canal mCerulean3. Realice esto restando imágenes sucesivas en el canal mCerulean3. Los eventos de escisión se detectarán en la derivada temporal como un destello brillante de fluorescencia.<ol><li>Umbralice la pila de eventos de escisión para eliminar la fluorescencia no deseada. Tenga en cuenta que este proceso eliminará partes de las escisiones en sí. Para solucionar esto, dilate las imágenes para restaurar las escisiones a sus tamaños originales. NOTA: También se pueden realizar análisis que utilizan técnicas similares de umbralización y análisis de imágenes en los otros canales de fluorescencia (por ejemplo, correlacionar los eventos de escisión con los niveles de transposasa TnpA [fluorescencia amarilla de Venus] y TnpB [fluorescencia mCherry roja].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El método único presentado aquí para obtener imágenes en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células vivas es un ensayo sensible que puede detectar directamente la transposición en células vivas y en tiempo real y correlacionar esta actividad con la expresión de proteínas accesorias. Si bien el rendimiento es menor que el que se puede lograr con métodos a granel, este método logra mediciones detalladas de la actividad de TE y la expresión de proteínas en células vivas individuales.
<p class="jov...

Los elementos transponibles (ET) son elementos genéticos que se movilizan dentro de sus genomas del huésped por escisión o copia catalizada seguida de reintegración genómica. Los TE existen en todos los dominios de la vida, y la transposición reestructura el genoma del huésped, mutando las regiones codificantes y de control1. Esto genera mutaciones y diversidad que juegan un papel importante en la evolución2,3, el desarrollo4,5 y varias enfermedades humanas6, incluyendo el cáncer7.
Utilizando nuevas construcciones genéticas que acoplan aspectos de la actividad transposicional a reporteros fluorescentes, nuestro trabajo anterior describió el desarrollo de un sistema experimental basado en el TE IS608 bacteriano, un representante de la familia generalizada de TE IS200 / IS605, que permite la visualización en tiempo real de la transposición en células vivas individuales8 (Figura 1). El sistema TE se muestra en la Figura 1A. El TE comprende la secuencia codificante de transposasa, tnpA, flanqueada por repeticiones palindrómicas imperfectas (IPs) del extremo izquierdo (LE) y del extremo derecho (RE), que son los sitios de reconocimiento y escisión para TnpA. La tnpA se expresa utilizando el promotor PLTetO1, que es reprimido por el represor tet y es inducible con anhidrotetraciclina (aTc)9. El TE divide las secuencias -10 y -35 de un promotor constitutivo PlacIQ1 10 para el reportero azul mCerulean311. Como se muestra en la Figura 1C, cuando se induce la producción de tnpA, el TE puede ser extirpado, lo que lleva a la reconstitución del promotor. La célula producida expresa mCerulean3 y fluoresce azul. El extremo N de TnpA está fusionado con el reportero amarillo Venus12, lo que permite la medición de los niveles de TnpA por fluorescencia amarilla.
IS608 y otros miembros de la familia de transposones IS200/IS605 también codifican típicamente un segundo gen de la función hasta ahora desconocida, tnpB13. Las proteínas TnpB son una familia de nucleasas tremendamente abundantes pero imperfectamente caracterizadas codificadas por varias ETs bacterianas y arqueales 14,15, que a menudo consisten solo en tnpB16. Además, estudios recientes han renovado el interés en TnpB al encontrar que TnpB funciona como una endonucleasa guiada por ARN programable similar a CRISPR / Cas que producirá roturas de dsDNA o ssDNA en diversas condiciones17,18. Sin embargo, no está claro qué papel puede desempeñar TnpB en la regulación de la transposición. Para realizar la visualización en tiempo real de los efectos de TnpB en la transposición de IS608, se creó una versión del transposón, incluida la región codificante de TnpB con una fusión N-terminal a la proteína fluorescente roja mCherry.
Complementando estudios más detallados a nivel de masa realizados por el laboratorio de Kuhlman19, se muestra aquí cómo las imágenes en tiempo real de la actividad de transposones pueden revelar cuantitativamente el impacto de TnpB o cualquier otra proteína accesoria en la dinámica transposicional. Al fusionar TnpB con mCherry, los eventos transposicionales individuales se identifican por fluorescencia azul y se correlacionan con los niveles de expresión de TnpA (fluorescencia amarilla) y TnpB (fluorescencia roja).

<table><tbody><tr><td>Epoxi transparente de 2 toneladas</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de anhidrotetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Argon Laser</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro azul</td><td>Chroma</td><td>Ej: Z457/10X, EM: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Microscopio</td><td>Nikon</td><td></td><td>Descatalogado</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Cajas y bandejas de recarga, volumen: 0,1 a 10 &micro; L, Longitud: 3,4 cm, 1,33 pulg., PP (Polipropileno)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Cajas y bandejas de recambio Eppendorf epTIPS, Volumen: 50 a 1000 &micro; L, Longitud: 7,1 cm, 2,79 pulg., PP (Polipropileno)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato ferroso Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Fiji (imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;Caldo LB, Miller (Granulado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de cubierta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de microscopio</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Etapa</td><td>anterior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro rojo</td><td>Chroma</td><td>Ex: ET560/40X, EM: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Zafiro 561 LP Portaobjetos de</td><td>1170412</td><td></td>Láser <td>Coherente</td></tr><tr><td>, Microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Lanzamiento láser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro amarillo</td><td>croma</td><td>Ej: Z514/10X, EM: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación en tiempo real de los efectos de la tnpb asociada a la familia is200/is605 sobre la actividad de transposones

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Aquí, se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo y en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células bacterianas vivas utilizando un conjunto de reporteros fluorescentes acoplados a la transposición. En particular, demuestra cómo se pueden utilizar las imágenes en tiempo real para evaluar los efectos de la proteína accesoria TnpB sobre la actividad del elemento transponible IS608, un miembro de la familia de elementos transponibles IS200/IS605. La familia de elementos transponibles IS200/IS605 son elementos móviles abundantes conectados con uno de los genes más innumerables que se encuentran en la naturaleza, tnpB. Las homologías de secuencia proponen que la proteína TnpB puede ser un precursor evolutivo de los sistemas CRISPR/Cas9. Además, TnpB ha recibido un renovado interés, habiéndose demostrado que actúa como una endonucleasa de ADN guiada por ARN similar a Cas. Se cuantifican los efectos de TnpB en las tasas de transposición de IS608, y se demuestra que la expresión de TnpB de IS608 da como resultado ~ 5 veces mayor actividad de transposones en comparación con las células que carecen de expresión de TnpB.

Este método de visualización de la actividad del transposón en células vivas mediante microscopía de fluorescencia, aunque tiene un rendimiento más bajo que las mediciones de fluorescencia a granel, permite la visualización directa de la actividad del transposón en células vivas individuales. Los eventos de escisión de transposones resultan en la reconstitución del promotor para mCerulean3 (Figura 1), permitiendo la identificación de células sometidas a actividad transposónica por fluorescencia azul brillante (<strong cl...

Se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo en tiempo real para cuantificar cómo la proteína accesoria TnpB afecta la dinámica de transposición en células vivas individuales de Escherichia coli .

Cuantificación en tiempo real de los efectos de la TnpB asociada a la familia IS200/IS605 sobre la actividad de transposones

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Este protocolo nos permite cuantificar las estadísticas de escisión sobre una sola célula, en lugar de observar el comportamiento masivo. En este nivel, podemos rastrear el comportamiento de las células individuales a lo largo del tiempo, incluidos sus niveles de TnpA y TnpB para las células que se extirpan frente a las células que no lo hacen, lo que puede permitirnos, por ejemplo, medir los efectos de los eventos mutacionales identificados en la tasa de crecimiento. Este método es una forma simple y de bajo costo de medir la dinámica mutacional de células vivas.El enfoque general es aplicable a cualquier sistema que requiera imágenes fluorescentes de células vivas. Prepara un portaobjetos hirviendo M63 con 0,5% de glucosa y 1,5% de agarosa en el microondas para derretir la agarosa. Asegúrese de que el medio esté completamente fundido y bien mezclado.Deje que la mezcla se enfríe a 55 grados centígrados antes de agregar antibióticos e inductores. Coloque un portaobjetos de microscopio en el banco de trabajo. Apile una diapositiva perpendicular a la primera.Asegúrese de que haya un espacio igual a un grosor de diapositiva entre la diapositiva inferior y superior. Pipetea un mililitro de la mezcla de agarosa M63 en el espacio entre la diapositiva lentamente para crear un pequeño cuadrado de gel. Una vez que el gel se haya solidificado, deslice el portaobjetos superior para retirarlo.Recorte la almohadilla de agarosa con una hoja de afeitar o un cuchillo. Luego, pipetea 2.5 microlitros del cultivo bacteriano y coloca el cubrebocas en la parte superior. Selle el espacio entre la corredera y el cubreobjetos con epoxi.Deje que el epoxi se seque y las células se depositen en la almohadilla de agarosa durante una hora a 37 grados centígrados. Coloque la muestra preparada en un microscopio de fluorescencia en un ambiente calentado y mantenido a 37 grados centígrados. Para cada longitud de onda, encuentre el campo de visión que contiene fluorescencia mínima.Configure un protocolo para adquirir imágenes en una cuadrícula en diferentes longitudes de onda y en intervalos de tiempo regulares. Los eventos de escisión de transposones resultan en la reconstitución del promotor para mCerulean3, permitiendo la identificación de células sometidas a actividad de transposón por fluorescencia azul brillante. TnpB mejora la tasa de escisión de transposones.Las células que expresan la proteína accesoria TnpB experimentan niveles de cuatro a cinco veces más altos de actividad de transposones en comparación con las células TnpB negativas. En las células TnpB positivas, las células sometidas a eventos de escisión de transposones tienen niveles de expresión más altos de mCherry TnpB que la población general. Además, para las células sometidas a eventos de escisión, las células TnpB positivas expresan solo niveles marginalmente más altos de TnpA-transposasa venosa que las células TnpB negativas, que es más alta que la fluorescencia amarilla de la población general.El lugar más probable para luchar es en la preparación del cultivo celular para el experimento. Debe asegurarse de que las células crezcan hasta la fase exponencial y que el portaobjetos se inocule con un número adecuado de células. Recuerde tener cuidado con las burbujas al sellar el portaobjetos para que el gel de agarosa no se seque.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Kazi, M. I., et. al., Generación de bibliotecas de inserción de transposones en bacterias gramnegativas para secuenciación de alto rendimiento. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la selección, cuantificación y preservación de bacterias receptoras Gram-negativas portadoras de inserciones de transposones basadas en la resistencia a la kanamicina.

Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Aquí describimos el flujo de trabajo para usar el sistema TetON para lograr la expresión génica específica del tejido en la aleta de la cola del pez cebra adulto en regeneración.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Aquí describimos una técnica que combina la mutagénesis de transposon con secuenciación de alto rendimiento para identificar y cuantificar a mutantes de transposon leptoespiral en tejidos después de un desafío de hámsters. Este protocolo puede utilizarse para mutantes de pantalla para la supervivencia y difusión en los animales y también se puede aplicar a estudios en vitro .

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Este protocolo describe un método para lograr la integración estable del gen de interés en el genoma humano por el sistema transcripcionalmente regulado de La bella durmiente . Preparación de la integración de vectores lentivirales defectuosos, la transducción en vitro de las células humanas y el análisis molecular de células transduced se divulgan.

Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Este es un método adaptado para identificar factores candidatos de colonización de insectos en un simbionte beneficioso de Burkholderia. El huésped escarabajo está infectado con una biblioteca mutante aleatoria generada a través de la mutagénesis del transposón, y la complejidad de la biblioteca después de la colonización se compara con un control cultivado in vitro.

Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

Aprende a cuantificar en tiempo real los efectos de TnpB sobre la actividad de transposones en células individuales de Escherichia coli mediante microscopía de fluorescencia. Este método revela que las células TnpB-positivas presentan cuatro a cinco veces mayor actividad transposónica.

Cuantificación en tiempo real de los efectos de la TnpB asociada a la familia IS200/IS605 sobre la actividad de transposones

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