Name: In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en conjuntos neuronales de ganglios de la raíz dorsal intactos usando ratones Pirt-GCaMP3. Este método permite monitorizar hasta 1.800 neuronas sensoriales primarias simultáneamente para estudiar respuestas al dolor y alodinia.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01DE026677 y R01DE031477 de los Institutos Nacionales de Salud (a Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) y un premio Rising STAR del sistema de la Universidad de Texas (YSK).

<ol><li>Rivero-Melián, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li>
<li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology+and+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li>
<li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li>
<li>Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li>
<li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li>
<li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).</li>
<li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).</li>
<li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li>
<li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+phosphoinositide-binding+protein%2C+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons%3A+modulation+by+capsaicin%2C+menthol+and+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li>
<li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca%282%2B%29+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li>
<li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+sensing+by+Na%28V%291.8-positive+and+Na%28V%291.8-negative+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa%3A+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).</li>
<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
<li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca%282%2B%29+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li>
<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

El dolor persistente está presente en una amplia gama de trastornos, debilitando y/o reduciendo la calidad de vida de aproximadamente 8% de las personas29. Las neuronas sensoriales primarias detectan estímulos nocivos en la piel, y su plasticidad contribuye al dolor persistente8. Si bien las neuronas se pueden estudiar en cultivo celular y explantes, al hacerlo las elimina de su contexto fisiológico normal. La exposición quirúrgica del DRG, seguida de imágenes Pirt-GCaMP3 C...

Las neuronas sensoriales primarias inervan directamente la piel y llevan la información somatosensorial de vuelta al sistema nervioso central 1,2. Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son grupos de células corporales de 10.000-15.000 neuronas sensoriales primarias 3,4. Las neuronas DRG presentan diversos tamaños, niveles de mielinización y patrones de expresión de genes y receptores. Las neuronas de diámetro más pequeño incluyen neuronas sensibles al dolor y las neuronas de mayor diámetro típicamente responden a estímulos mecánicos no dolorosos 5,6. Los trastornos en las neuronas sensoriales primarias, como lesiones, inflamación crónica y neuropatías periféricas, pueden sensibilizar estas neuronas a diversos estímulos y contribuir al dolor crónico, alodinia e hipersensibilidad al dolor 7,8. Por lo tanto, el estudio de las neuronas DRG es importante para comprender tanto la somatosensación en general como muchos trastornos de dolor y picazón.
Las neuronas que disparan in vivo son esenciales para la somatosensación, pero hasta hace poco, las herramientas para estudiar los ganglios intactos in vivo se han limitado a un número relativamente pequeño de células 9. Aquí, describimos un método poderoso para estudiar los potenciales de acción o actividades de las neuronas a nivel de población in vivo como un conjunto. El método emplea imágenes basadas en la dinámica citoplasmática de Ca2+. Los indicadores fluorescentes sensibles al Ca 2+ son buenos indicadores para medir la actividad celular debido a la concentración normalmente baja de Ca2+ citoplasmático. Estos indicadores han permitido el monitoreo simultáneo de cientos a varios miles de neuronas sensoriales primarias en ratones 9,10,11,12,13,14,15,16 y ratas 17. El método de imágenes de Ca2+ in vivo descrito en este estudio se puede utilizar para observar directamente las respuestas a nivel poblacional a estímulos mecánicos, fríos, térmicos y químicos.
La proteína de membrana de unión a fosfoinositida, Pirt se expresa en altos niveles en casi todas (>95%) neuronas sensoriales primarias18,19 y se puede utilizar para impulsar la expresión del sensor Ca 2+, GCaMP3, para monitorear la actividad neuronal in vivo20. En este protocolo, se describen técnicas para realizar cirugía DRG in vivo, imágenes de Ca2+ y análisis en el lado derecho lumbar 5 (L5) DRG de ratones Pirt-GCaMP314 utilizando microscopía de barrido láser confocal (LSM).

<table><tbody><tr><td>Inyección anasada (xilacina)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>DC Controlador de temperatura</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica del controlador de temperatura de CC</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas con recubrimiento cerámico Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>FHC Controlador de temperatura de CC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (isoflurano)</td><td>MWI Salud animal, Grupo Piramal</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamina)</td><td>Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de escenario verde luminiscente</td><td>JSITON/ Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 Vaporizador de isoflurano</td><td>Midmark 91305430</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Micro resorte de disección tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mini Sonda de termistor rectal</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de operación</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J ratones</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N/A</td><td>Cualquiera de los dos sexos puede ser visualizado igual de bien. Los ratones deben tener al menos 8 semanas de edad debido a la expresión débil o intermitente del promotor Pirt en los ratones más jóvenes.</td></tr><tr><td>Algómetro para animales pequeños SMALGO</td><td>Bioseb Instrumentos de investigación in vivo</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico</td><td>Kopf Modelo 923-B</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>td-Tomato C57BL/6J</td><td>ratones Jackson Laboratory</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>Placa superior, 6 in x 10 in</td><td>Newport</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-Cre C57BL/6J ratones</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Zeiss LSM 800</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Las imágenes de Ca 2+ se pueden utilizar como un proxy de la actividad celular, incluidos los potenciales de acción y varios mecanismos de señalización que implican la entrada de Ca 2+ en el citoplasma o la liberación de reservas intracelulares de Ca2+. Las imágenes de Ca2+ basadas en Pirt-GCaMP3 de neuronas sensoriales primarias del ganglio de la raíz dorsal (DRG) en ratones ofrecen la ventaja de la medición simultánea de un gran número de células. Se pueden monitorizar hasta 1.800 neuronas, lo que permite estudiar redes neuronales y procesos somatosensoriales como un conjunto en su contexto fisiológico normal a nivel poblacional in vivo. El gran número de neuronas monitoreadas permite la detección de patrones de actividad que serían difíciles de detectar utilizando otros métodos. Los estímulos se pueden aplicar a la pata trasera del ratón, lo que permite estudiar los efectos directos de los estímulos en el conjunto de neuronas DRG. El número de neuronas que producen transitorios de Ca 2+, así como la amplitud de los transitorios de Ca2+ indica sensibilidad a modalidades sensoriales específicas. El diámetro de las neuronas proporciona evidencia de tipos de fibras activadas (mecanos no nocivos vs. fibras nocivas del dolor, fibras Aβ, Aδ y C). Las neuronas que expresan receptores específicos pueden ser marcadas genéticamente con td-Tomato y Cre específicas recombinasas junto con Pirt-GCaMP. Por lo tanto, las imágenes Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG proporcionan una poderosa herramienta y modelo para el análisis de modalidades sensoriales específicas y subtipos de neuronas que actúan como un conjunto a nivel poblacional para estudiar el dolor, la picazón, el tacto y otras señales somatosensoriales.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes representativas de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (A,D) Se muestran escaneos de alta resolución de fotograma único de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proyecciones de intensidad media de 15 fotogramas de ganglios Pirt-GCa...

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

El número de neuronas monitoreadas usando este método permite la recopilación de datos de la red neuronal que sería imposible usando métodos más antiguos u otros. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de monitorear casi 2, 000 neuronas sensoriales primarias a la vez, respondiendo directamente a los estímulos aplicados a la pata trasera. Este procedimiento es especialmente adecuado para estudiar intervenciones terapéuticas para la alodinia periférica y la hipersensibilidad al dolor.Este método puede adaptarse para estudiar los ganglios trigéminos o geniculados o usarse con sensores codificados genéticamente para moléculas de voltaje o señalización celular, como el AMP cíclico. Se necesita práctica para realizar esta cirugía. Puedes practicar en hasta seis ganglios de la raíz dorsal en un solo animal.Demostraré el procedimiento seré yo, con la asistencia de John Shannonhouse y el Sr. Rubén Gómez. Para comenzar, coloque el mouse en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 grados centígrados. Localiza el agrandamiento lumbar palpando el hueso pélvico del ratón.Luego, afeite la parte posterior del mouse por encima del área de agrandamiento lumbar

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Shannonhouse, J., et al. Imágenes de calcio in vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios de raíz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). El video muestra una técnica de imagen de calcio in vivo para monitorear la actividad neuronal en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de un ratón transgénico. Las neuronas DRG expresan un indicador de calcio que aumenta la intensidad de la fluorescencia al unirse al calcio. Los estímulos...

Imágenes de calcio in vivo de conjuntos neuronales en los ganglios de la raíz dorsal intacta de un ratón

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y...

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Se describe un procedimiento experimental para medir la actividad neuronal a través de dos ventanas ópticas arriba bilateral corticies somatosensorial primaria (S1) en Thy1-GCaMP6s de ratones transgénicos usando fotones 2 (2P) microscopia en vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

El presente protocolo describe imágenes de calcio in vivo para medir las respuestas de conjuntos de neuronas lumbar-6 DRG a estímulos somáticos y viscerales. Se pueden hacer comparaciones exhaustivas entre las neuronas que responden a diferentes estímulos. Este protocolo es valioso para investigar los mecanismos del dolor visceral y la estimulación somática, como la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Este estudio presenta una manipulación quirúrgica para exponer el T-DRG en ratones anestesiados para la obtención de imágenes de calcio in vivo , junto con registros sincrónicos de ECG. Este método representa una herramienta de vanguardia para estudiar la estimulación de los nervios eléctricos periféricos y las entradas de los órganos viscerales torácicos, así como sus interacciones a nivel sensorial primario.

Imágenes de calcio y registro de ECG de los ganglios de la raíz dorsal torácica (DRG) in vivo para el estudio de la estimulación de los nervios periféricos

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

La actividad espontánea de la creación de redes neuronales se puede medir con AM-éster formas de tintes indicadores sensibles de calcio. Cambios en el calcio intracelular, lo que indica la activación neuronal, se detectan los cambios transitorios de la fluorescencia con un indicador o imagen de dos fotones. Este protocolo puede ser adaptado para una serie de redes neuronales del desarrollo que dependen...

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

La implantación de arreglos organizados de microhilos para su uso en una sola unidad los registros electrofisiológicos se presenta una serie de desafíos técnicos. Se describen los métodos para llevar a cabo esta técnica y el equipo necesario. Además, se discute el uso beneficioso de arrays microhilo organizados para grabar desde subregiones neuronales distintas con alta selectividad espacial.

Un procedimiento para la implantación de matrices Organizados de Microhilos para grabaciones de una sola unidad en Awake, Comportarse Animales

Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en conjuntos neuronales de ganglios de la raíz dorsal intactos usando ratones Pirt-GCaMP3. Este método permite monitorizar hasta 1.800 neuronas sensoriales primarias simultáneamente para estudiar respuestas al dolor y alodinia.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal (Video) | JoVE Journal

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

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