Name: Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprende el método Z-REX para analizar señalización de moléculas reactivas en larvas de pez cebra. Esta técnica permite estudiar interacciones ligando-proteína con alta precisión espaciotemporal para investigación oncológica.

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Financiación: Novartis FreeNovation, NCCR y EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
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<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Los inhibidores de quinasa de moléculas pequeñas específicas de isoforma, cuyo descubrimiento fue posible gracias a las tecnologías REX, se han presentado para la solicitud de patente

Z-REX descrito en este protocolo demuestra una estrategia robusta para la investigación de pares electrófilos-objetivo y la deconvolución de la vía de señalización en peces vivos. La administración dirigida por proximidad permite la dosificación y el control espacial del tratamiento con compuestos electrofílicos. A diferencia de los métodos convencionales de dosificación en bolo, en los que las concentraciones suprafisiológicas de electrófilos desplegados a menudo conducen a problemas fuera del objetivo, la cantidad relativamente menor de electrófilo liberado al sistema hace que Z-REX sea en gran medida no invasivo. Hemos utilizado 0,1-6 μM Ht-PreHNE(alquino) en embriones de pez cebra, y los resultados mostraron que el tratamiento no es perjudicial para el desarrollo embrionario11.
El procedimiento Z-REX es generalmente más largo que T-REX, una técnica para detectar / estudiar proteínas sensibles a electrófilos en células cultivadas. Supongamos que el propósito del experimento es detectar interacciones electrófilo-objetivo; sugerimos primero realizar un cribado extensivo por T-REX en células cultivadas y usar Z-REX para la validación in vivo y el análisis fenotípico/vísta. En comparación con el cultivo celular, los requisitos para realizar Z-REX son técnicas básicas de cría de peces, además de las habilidades experimentales bioquímicas requeridas por T-REX. Un marco de tiempo típico para Z-REX (desde el cruce de peces hasta la administración de electrófilos inducibles por luz) es de 2-3 días, que no es más de 1 día más que el tiempo típico para un experimento T-REX en células vivas transfectadas. Las imágenes en vivo para el análisis fenotípico se pueden realizar 2-10 h después de la iluminación de la luz; el acoplamiento de clic con biotina-azida para el ensayo pull-down toma 3 días; qRT-PCR para analizar la respuesta transcripcional tarda 3 días; La tinción IF tarda 5 días. Estos pasos son más o menos similares a sus equivalentes de cultivo celular, aunque la interpretación de los datos requiere una comprensión de la fisiología de los peces y las cepas reporteras.
Como procedimiento de variable múltiple12, son necesarios varios grupos de control para que Z-REX excluya incertidumbres en los resultados (Figura 1D). Los grupos de control comunes son: (1) DMSO/tratamiento del vehículo solamente; (2) tratamiento de sonda, pero sin iluminación de luz; (3) iluminación ligera, pero sin tratamiento de sonda; (4) Construcción P2A-split, en la que Halo y el POI se expresan por separado, por lo que la entrega de proximidad se ablabla; y (5) mutantes hipomórficos, cuyos residuos de detección de electrófilos están mutados, como Akt3 (C119S)6 y Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, que hemos utilizado en estudios anteriores.
Si los ensayos aguas abajo implican análisis de Western blot, el desyolking debe realizarse antes de la cosecha. Las proteínas de la yema reducen la fidelidad de las evaluaciones de concentración de lisado y pueden unirse no específicamente a los anticuerpos. Al realizar imágenes de peces vivos o tinción de FI de montaje completo, también hemos observado señales fluorescentes no específicas en el saco vitelino, probablemente como resultado de proteínas autofluorescentes en el saco vitelino o unión no específica de los propios anticuerpos. Si la señal de autofluorescencia interfiere con la señal, sugerimos excluir el saco vitelino de la cuantificación o cuantificar diferentes regiones por separado. La dechorinación es necesaria para obtener imágenes de peces vivos y para el ensayo de tinción de FI de montaje completo. El corion puede interferir con las imágenes y, más tarde, con la cuantificación / recuento celular. Sin embargo, la decorinación solo es aplicable a embriones mayores de 1 dpf; Los embriones más jóvenes en etapas de blastulación/gastrulación/segmentación son demasiado frágiles para ser descorionados.
El protocolo Z-REX descrito aquí se basa en la expresión de POI ectópica impulsada por ARNm. El procedimiento es rápido en comparación con el uso/generación de líneas de peces transgénicas. La expresión impulsada por ARNm es ubicua y transitoria, y dura al menos 2 días para los ARNm utilizados en este protocolo. Sin embargo, es probable que la duración de la expresión varíe en otros casos. Por lo tanto, este enfoque proporciona una ventana de investigación rápida y más global sobre los efectos de un evento específico de etiquetado de electrófilos, compatible con varios ensayos de alto rendimiento / alto contenido. Las líneas transgénicas con expresión estable de Halo-POI en tejidos específicos también son compatibles con Z-REX11. Estas líneas se utilizan mejor cuando es necesario hacer una pregunta más precisa, por ejemplo, cuando se predice un fenotipo en un órgano específico a partir de datos de cultivo celular, o cuando el cribado de experimentos de inyección de ARNm predice que un órgano específico es sensible a un evento de marcado de electrófilos. Se demostró una inducción de respuesta antioxidante específica del corazón a través de Z-REX utilizando peces Tg(gstp1: GFP; DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) en nuestra publicación anterior11. También puede ser posible realizar Z-REX en peces transgénicos mayores de 2 dpf.

Una miríada de eventos de señalización celular implican reacciones entre pequeñas moléculas reactivas (producidas endógenamente en la célula o xenobióticos / xenometabolitos, como los medicamentos) y su proteína diana. En muchos casos, un nivel subestequiométrico de tales eventos de unión covalente puede desencadenar respuestas celulares, lo que lleva a cambios en, por ejemplo, el desarrollo, el metabolismo, la apoptosis y / o la respuesta inmune1. Sin embargo, deconstruir el modo de acción (MOA) vinculando eventos de unión específicos a sus consecuencias fenotípicas ha demostrado ser un desafío. Los métodos tradicionales de dosificación en bolo que implican la introducción de altas concentraciones de las especies reactivas a menudo resultan en una multitud de proteínas modificadas, así como una toxicidad excesiva para el organismo modelo2. Tales condiciones están lejos de ser ideales. Se desarrolló un método para resolver estos problemas en cultivo celular utilizando la administración de electrófilos localizados de precisión en un contexto celular nativo, llamado T-REX (electrófilos y oxidantes reactivos dirigibles)3. En los años intermedios, la atención se ha centrado en experimentos en organismos completos, que permiten la oportunidad de estudiar proteínas en contextos celulares específicos en células no transformadas. Así, hemos ampliado la técnica para que sea compatible con varios modelos, incluidos los modelos de embriones de Danio rerio . Aquí, presentamos Z-REX (pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos) (Figura 1).
Para comprender Z-REX, este artículo primero presenta las tecnologías REX y sus conceptos subyacentes. En esencia, estas técnicas modelan la señalización de especies electrofílicas reactivas fisiológicas endógenas (RES) imitando cómo los electrófilos naturales se producen localmente in vivo con precisión espaciotemporal. La proteína de interés (POI) se expresa como una construcción de fusión a Halo; este último ancla la sonda inerte y permeable al tejido que soporta la RES fotoenjaulada en una estequiometría 1:1. Una de estas RES endógenas es 4-hidroxinonenal (HNE en adelante), que está fotoenjaulada en la sonda Ht-PreHNE. En muchos casos, utilizamos una versión funcionalizada de alquino de HNE [es decir, HNE (alquino)], que tiene propiedades biológicas esencialmente idénticas a HNE, pero puede ser etiquetada por química de clic. La sonda, que también está funcionalizada con un cloroalcano para la reactividad con Halo, se conoce como Ht-PreHNE (alquino). El complejo de la fusión Halo-POI y la sonda así formada permite la entrega proximal de RES a la POI fusionada tras la irradiación con luz UV. Si el POI reacciona rápidamente con el RES liberado, el etiquetado covalente resultante del POI con RES nos permite identificar cisteínas cinéticamente privilegiadas.
Z-REX toma las ventajas antes mencionadas de las tecnologías REX y las aplica ampliamente para estudiar vías de señalización específicas en peces vivos. Este protocolo ha sido optimizado para el pez cebra (D. rerio), ya que son organismos vertebrados genéticamente tratables que son transparentes durante el desarrollo y, por lo tanto, ideales para técnicas optoquímicas / genéticas como las tecnologías REX. Sin embargo, es probable que una estrategia similar también funcione bien en otras especies de peces genéticamente tratables, ya que la amplia aplicabilidad del método se debe al mecanismo pseudo-intramolecular de la administración de electrófilos derivados de lípidos (LDE). De hecho, el procedimiento es altamente biocompatible, ya que los peces pueden ser tratados con el electrófilo fotoenjaulado Z-REX [por ejemplo, Ht-PreHNE (alquino)] durante al menos 48 h sin ningún impacto notable en el desarrollo. Un protocolo similar funciona en C. elegans 4,5.
El protocolo describe primero el uso de la inyección de ARNm para producir una expresión transitoria de una construcción de fusión Halo-POI no nativa en modelos embrionarios de pez cebra, 1-1.5 días después de la fertilización (dpf). Esto da como resultado la expresión de la proteína ectópica en la mayoría de las células dentro del pez (en lo sucesivo denominadas "ubicuas"), en lugar de en tejidos o lugares específicos; Sin embargo, los datos muestran que se pueden observar efectos específicos de las células en ciertos casos. Después de la inyección, los embriones se incuban con una baja concentración [0.3-5 μM Ht-PreHNE (alquino)] de la sonda hasta 30.5 h después de la fertilización (hpf). Luego, en un momento prescrito por el usuario, la entrega del RES al POI dentro de los peces se logra mediante fotounjaula durante 2-5 min. Después del fotouncado de la RES, se pueden realizar una variedad de ensayos fenotípicos aguas abajo durante las próximas 2-10 h: 1) imágenes en vivo de las líneas del reportero (Figura 2A); 2) evaluación del etiquetado de objetivos mediante análisis de Western blot (Figura 3); 3) análisis transcriptómico (Figura 4); o 4) inmunofluorescencia de montaje completo (Figura 5).
Como ejemplo de imágenes en vivo de líneas reporteras, Z-REX se demuestra en conjunto con imágenes en vivo de líneas de peces, Tg (lyz: TagRFP) y Tg (mpeg1: eGFP), para medir cómo la modificación RES de un POI específico del sensor electrófilo (a saber, Keap1) disminuye los niveles de neutrófilos y macrófagos, respectivamente, sin efectos observables en otras células de los peces. Sin embargo, hemos demostrado previamente que el marcado de POI y la consiguiente señalización de la vía de los estudios T-REX se pueden reproducir utilizando Z-REX para varias proteínas: Akt3 6, Keap17 y Ube2v26. En general, con Z-REX, los científicos pueden estudiar las consecuencias de la modificación covalente de los POI por RES en el contexto de varias vías redox complejas. Esta técnica está preparada para identificar objetivos y sus residuos funcionales para el diseño de fármacos covalentes y nuevos mecanismos farmacológicos en un modelo animal completo más relevante contextualmente.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 10 cm</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrilamida y solución de bis-acrilamida</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Prestained Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-dPEG11-azida</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-ratón-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107 1</td><td>:800 (IF)</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Burro anti-rata-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Sustrato ECL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato ECL-Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de extremo a extremo</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher E</td><td>/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Instrumento Sutter Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas (romas)</td><td>hechas por nosotros mismos</td><td></td><td>mediante pinzas afiladas desafiladoras (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Pinzas (afiladas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Punta de carga de gel</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes de gel/mancha</td><td>Vilber</td><td>Generador de imágenes</td><td></td>Fusion FX</tr><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa de vidrio</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>Termoactivado FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico calefactado</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina agarosa de alta capacidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE sonda de alquino</td><td>de fabricación propia</td><td>-</td><td>Parvez, S. y cols. Segmentación redox bajo demanda de T-REX en células vivas. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Placa de imagen (10% de tampón HBSS, para embriones vivos)</td><td></td><td></td><td>Hecho con placa de Petri y 2% de agarosa en tampón HBSS al 10%</td></tr><tr><td>Placa de imagen (PBS, para embriones fijados con formaldehído)</td><td></td><td></td><td>Hecho con placa de Petri, y 2% de agarosa en PBS</td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de inyección <td>Hecho con molde de microinyección, placa de Petri y 2% de agarosa en tampón de HBSS al 10%</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinyección</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio para microinyección</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de microscopio</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti- &beta;-actina-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Ratón anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Lector multimodo</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel de agarosa de ácido nucleico</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Tecnologías de ADN</td><td>integradas personalizadas: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Naranja</td><td>G Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>autoclonado-Disponible</td><td></td> <td>en el grupo del Prof. Yimon AYE en la EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>autoclonado-Disponible</td><td></td> <td>en el grupo del Prof. Yimon AYE en la EPFL</td></tr><tr><td>PicoPump neumática</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Equipos y suministros de electroforesis de proteínas</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Electroforesis</td><td></td>vertical</tr><tr><td>Rabbit anti-active Caspasa-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Rata anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF y WB)</td></tr><tr><td>Rata anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT inhibidor de la ribonucleasa recombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descontaminación</td> <td>de ARN RnaseZapThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Agitador mecedora</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III transcriptasa inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV proteasa (S219V)</td><td>-self-made-Parvez</td><td></td><td>, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>Centro Internacional de Recursos del Pez Cebra (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>Centro Internacional de Recursos del Pez Cebra (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de Glycine max (soja)</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara UV con luz de 365 nm</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de rayos UV&nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Industrias Científicas, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Equipos de transferencia y suministros</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot o Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Equipo <td></td><td></td><td>de cría y cría de pez cebra</td><td>en casa</td></tr><tr><td>Cuentas de circonio</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - z-rex desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Los metabolitos reactivos y los fármacos electrofílicos relacionados se encuentran entre las moléculas pequeñas más difíciles de estudiar. Los enfoques convencionales para deconstruir el modo de acción (MOA) de tales moléculas aprovechan el tratamiento a granel de especímenes experimentales con un exceso de una especie reactiva específica. En este enfoque, la alta reactividad de los electrófilos hace que el etiquetado no discriminatorio del proteoma dependa del tiempo y el contexto; Las proteínas y procesos sensibles a redox también pueden verse afectados indirectamente y, a menudo, irreversiblemente. En este contexto de innumerables objetivos potenciales y efectos secundarios indirectos, vincular el fenotipo con el compromiso objetivo específico sigue siendo una tarea compleja. El pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos (Z-REX), una plataforma de administración de electrófilos reactivos a pedido adaptada para su uso en larvas de pez cebra, está diseñada para administrar electrófilos a una proteína específica de interés (POI) en embriones de peces vivos imperturbables. Las características clave de esta técnica incluyen un bajo nivel de invasividad, junto con la administración de electrófilos de precisión controlada por dosificación, quimiotipo y espaciotemporalmente. Por lo tanto, junto con un conjunto único de controles, esta técnica evita los efectos fuera del objetivo y la toxicidad sistémica, observada de otro modo después de la exposición masiva incontrolada de animales a electrófilos reactivos y fármacos electrofílicos pleiotrópicos. Aprovechando Z-REX, los investigadores pueden establecer un punto de apoyo en la comprensión de cómo las respuestas individuales al estrés y las salidas de señalización se alteran como resultado del compromiso específico del ligando reactivo con un POI específico, en condiciones casi fisiológicas en animales vivos intactos.

Imágenes en vivo de peces reporteros transgénicos de neutrófilos/macrófagos tratados con Z-REX, Tg(lyz:TagRFP) y Tg(mpeg1:EGFP). Inducción de la apoptosis de neutrófilos/macrófagos mediante HNEilación de Keap1. (Ver también Figura 2). El efecto del marcaje electrofilo de Keap1 sobre los niveles de neutrófilos y macrófagos se evaluó inyectando embriones transgénicos heterocigotos derivados de Tg(lyz:TagRFP) o Tg(mpeg1:EGFP) con ARNm que codifica Halo-Keap1, y luego tratando con Ht-PreHNE(alquino). Siguiendo los procedimientos para el paso 6.1-ensayo aguas abajo, se liberó la opción 1-HNE(alquino) y se etiquetó Keap1. Los niveles de neutrófilos y macrófagos se evaluaron mediante imágenes en vivo de líneas reporteras, Tg(lyz:TagRFP) y Tg(mpeg1:eGFP), respectivamente. El nivel de ambos tipos de células disminuyó en un 30% -40% después del tratamiento con Z-REX, en el que HNE se administró a Keap1. Por el contrario, no se observó pérdida de neutrófilos o macrófagos en los grupos de control técnico Z-REX [sin luz y Ht-PreHNE(alquino), luz sola, o Ht-PreHNE(alquino) solo] (Figura 1D y Figura 2A-D).
La inducción de la apoptosis de neutrófilos/macrófagos indicó una entrega exitosa de HNE a Keap1 a través de Z-REX. Se han publicado detalles para el análisis de la vía y el mecanismo de apoptosis5. Para tener en cuenta los efectos fuera del objetivo de HNE (alquino), se utilizaron varios controles. (1) En las mismas condiciones experimentales, en lugar de ARNm de Halo-TeV-Keap1, se inyectaron embriones con ARNm de Halo-P2A-Keap1. El enlazador P2A permitió que las proteínas Halo y Keap1 se expresaran de forma independiente. En este escenario, HNE(alquino) liberado de Halo no pudo etiquetar a Keap1, ya que ya no era proximal a Halo (Figura 1D); Por lo tanto, la vía de señalización de la apoptosis no se activó. No se observaron cambios en los niveles de macrófagos o neutrófilos en este grupo (Figura 2A, B). (2) Las mismas condiciones experimentales se realizaron utilizando ARNm que codifica Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E), un mutante de Keap1 que no responde al HNE(alquino) (Figura 1D). No se observaron cambios en los niveles de macrófagos o neutrófilos (Figura 2G, H).
Acoplamiento azida-clic de biotina y ensayo pull-down de biotina. Evaluación del etiquetado de objetivos. (Ver también Figura 3). La evaluación del etiquetado objetivo se llevó a cabo utilizando embriones WT, inyectados con ARNm que codifica Halo-TeV-Keap1-2xHA (construcción de fusión Halo-POI) o Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (construcción dividida P2A, en la que Halo y Keap1 no están fusionados; Figura 1D). La proteína Keap1 marcada solo se redujo en el grupo que expresaba proteína de fusión y se trató con Z-REX (segundo carril en el blot anti-HA superior), pero no en otros grupos de control (sin inyección de ARNm, construcción de fusión sin Z-REX o construcción dividida en P2A). Los resultados indican que el HNE (alquino) se entregó con éxito a Keap1, y el Keap1 modificado se conjugó posteriormente con biotina a través de la reacción de clic, y el Keap1 marcado con biotina fue bajado por resina de estreptavidina.
Análisis transcripcional. RNA-seq y qRT-PCR. (Ver también Figura 4). El cambio transcripcional después del tratamiento con Z-REX se evaluó mediante RNA-seq y qRT-PCR. En RNA-seq, varios genes relacionados con el sistema inmune fueron regulados a la baja después de Z-REX. En contraste, muchos genes relacionados con la respuesta antioxidante (AR) fueron regulados al alza después de Z-REX, que resultó de la inducción de la vía Keap1-Nrf2-AR sobre HNEylation en Keap110 (Figura 4A). En el análisis qRT-PCR, se encontraron resultados similares al analizar tres genes relacionados con el sistema inmunitario (lyz, mpeg1.1 y coro1a) (Figura 4B). La regulación ascendente y descendente de los genes respectivos mostró la inducción exitosa de vías mediadas por la HNEilación de Keap1.
Ensayo de tinción de (co)inmunofluorescencia de montaje completo y análisis de colocalización. (Ver también Figura 5). La expresión exógena de Halo-TeV-Keap1-2xHA y Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia (IF) de montaje completo (Figura 5A, B). La construcción dividida P2A tenía dos veces el número de etiquetas HA que la construcción de fusión TeV, lo que corresponde a una señal anti-HA dos veces mayor en el grupo P2A-split-construct-mRNA-inyectado que la otra, lo que indica que el nivel de expresión de las dos construcciones fue similar (Figura 5C). Los niveles de expresión de Halo-TeV-Keap1 (wt) y Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) también se encontraron similares al sondear con anti-Halo (Figura 5D,E). La colocalización de neutrófilos y caspasa activa 3 en Tg tratada con Z-REX (lyz: TagRFP) se observó mediante co-inmunotinción con anti-RFP y anti-active-Caspasa 3 (Figura 5F). La Caspasa 3 activa es un indicador de eventos de apoptosis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo de Z-REX. (A,B) Un embrión de pez cebra en estadio de 1-4 células se inyecta con (morfolino y) ARNm que codifica Halo-POI (por ejemplo, Halo-Keap1). Los embriones inyectados se tratan con una sonda compuesta por un ligando HaloTag y un electrófilo fotoenjaulado anexado con un grupo funcional alquino, como Ht-PreHNE (alquino) en B. Después de eliminar la cantidad excesiva de sonda, el embrión se expone a la luz para liberar al electrófilo de interés [por ejemplo, HNE o su análogo, HNE (alquino)]. El análisis posterior se realiza en un punto de tiempo determinado/definido por el usuario. (C) Diseño y mecanismo de la sonda Ht-PreLDE, que es aplicable a diferentes electrófilos derivados de lípidos (LDE). (D) Grupos de control negativos/técnicos para Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes en vivo de peces reporteros transgénicos de neutrófilos/macrófagos sometidos a Z-REX. La HNEilación de Keap1 mediada por Z-REX induce la apoptosis de neutrófilos/macrófagos. (A) Imágenes representativas de peces Tg(lyz:TagRFP ) que expresan Halo-TeV-Keap1 (construcción de fusión) o Halo-P2A-Keap1 (construcción dividida), y se someten a condiciones de control negativo [sin tratamiento, luz sola, o Ht-PreHNE (alquino) solo o Z-REX]. Edad embrionaria: 36 hpf. (B) Cuantificación de los niveles de neutrófilos en A. (C) Imágenes representativas de peces Tg(mpeg1:eGFP) que expresan Halo-TeV-Keap1 con o sin tratamiento Z-REX. Edad embrionaria: 34 hpf. (D) Cuantificación de los niveles de macrófagos en C. (E,F) Medición del curso temporal de (E) neutrófilos y (F) macrófagos después del tratamiento con Z-REX. (G) Experimento similar al de A en peces que expresan Halo-TeV-Keap1 (WT) o Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), un mutante que no tiene capacidad de detección de HNE. (H) Cuantificación de los niveles de neutrófilos en G. Barras de escala: 500 μm. Todos los gráficos se presentan con media ± SEM. Los valores de p se calcularon con ANOVA unidireccional (azul) y prueba t de Student de dos colas (negro). Esta cifra ha sido modificada de Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Figura 3: Ensayo de extracción de biotina. Los embriones WT que expresan Halo-TeV-Keap1-2XHA o Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA fueron tratados con Z-REX o condiciones de control negativo respectivas (sin tratamiento de sonda en este caso). Después de la cosecha, los embriones fueron lisados y tratados con proteasa TeV antes del ensayo de extracción de biotina. Los resultados fueron analizados por Western blotting. Esta cifra ha sido modificada de Huang et al. Z-REX: guiar a los electrófilos reactivos a proteínas específicas expresadas específicamente en el tejido o en la ubicua, y registrar las respuestas redox inducidas por electrófilos funcionales resultantes en peces larvarios. Esta cifra ha sido modificada de Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Figura 4: Análisis transcripcional. (A) Resultados RNA-seq de embriones tratados con Z-REX versus embriones no tratados. Se destacan los genes estadísticamente significativos expresados diferencialmente (SDE). Los genes SDE relacionados con la inmunidad son de color rojo. Los genes relacionados con la respuesta antioxidante (AR) son de color verde. Otros genes SDE son de color azul. Todos los valores de p se calcularon con CuffDiff. (B-D) Tres genes SDE relacionados con la inmunidad de A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 y (D) coro1a se analizaron más a fondo con qRT-PCR, y solo los embriones tratados con Z-REX mostraron la supresión de estas transcripciones. Todos los gráficos se presentan con media ± SEM. Los valores de p se calcularon con ANOVA unidireccional (azul) y prueba t de Student de dos colas (negro). Esta cifra ha sido modificada de Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Figura 5: Ensayo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo . (A,B) Imágenes representativas de embriones que expresan (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA o (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA inmunoteñidos con anti-HA y anticuerpo secundario conjugado con AlexaFluor568. Los peces inyectados con ARNm se compararon con peces no inyectados de la misma edad. (C) Cuantificación de la señal anti-HA en (A,B). (D) Imágenes representativas de embriones que expresan Halo-TeV-Keap1 (WT) o Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) inmunoteñidos con anti-Halo y anticuerpos secundarios conjugados con AlexaFluor647. Los peces inyectados con ARNm se compararon con peces no inyectados de la misma edad. (E) Cuantificación de la señal anti-Halo en D. Los valores de p se calcularon con la prueba t de Student de dos colas. (F) Los embriones Tg(lyz:TagRFP) sometidos a Z-REX fueron co-inmunoteñidos con anti-RFP y anti-activa Caspasa 3, y los respectivos anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. El cuadro blanco marca el área ampliada. Las flechas blancas indican colocalizaciones de neutrófilos y Caspasa 3 activa. Barras de escala: 500 μm. Todos los gráficos se presentan con media ± SEM. Esta cifra ha sido modificada de Poganik et al.7. y Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria 1: Lista de tampones utilizados en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos (Z-REX) es un método basado en la biología química para la investigación de la señalización reactiva de moléculas pequeñas. Esta técnica se puede aplicar a peces vivos de diferentes etapas de desarrollo. Aquí, combinamos ensayos estándar en pez cebra con Z-REX para el análisis de la vía de señalización.

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Y así, aprovechando Z-REX, los investigadores pueden interrogar cómo se alteran las respuestas de señalización individuales en respuesta a un ligando reactivo específico que se involucra con una proteína específica de interés en condiciones casi fisiológicas en larvas de pez cebra. Los métodos convencionales como la dosis masiva de moléculas pequeñas reactivas causan objetivos y toxicidad y no dan control sobre la especificidad del ligando objetivo. Z-REX puede vincular un compromiso objetivo de ligando específico con un fenotipo específico con alta precisión espaciotemporal.Recientemente hemos demostrado cómo un metabolito reactivo HNE, un objetivo asociado y una vía descubierta por Z-REX, permite el desarrollo de inhibidores de quinasa específicos de isoformas de precisión contra cánceres de mama triple negativos. Comience alineando los embriones en las ranuras de una placa de inyección llena con solución salina balanceada de Hank al 10% o HBSS. Sumerja la punta de la aguja en el medio y, si es necesario, aplique pulsos de inyección para eliminar las burbujas de aire en la punta Para inyectar el embrión, penetre el corion y el saco vitelino en un solo movimiento y aplique un pulso de inyección.Después de inyectar los otros embriones, enjuáguelos en una nueva placa de Petri que contenga medios HBSS frescos con una botella de chorro. Agrupe los embriones no inyectados en otra placa. Para realizar el análisis del tratamiento Z-REX, comience distribuyendo los embriones inyectados en platos de 10 centímetros.En una habitación oscura con luz roja, reemplace el mediano con 30 mililitros de HBSS al 10% con o sin un micromolar de la sonda REX. Incubar los embriones a 28,5 grados centígrados en la oscuridad. A las 30 horas después de la fertilización, reemplace el medio en la oscuridad.Después de repetir la incubación y el reemplazo de medios dos veces, exponga los embriones a la luz de una lámpara UV precalentada que gira cada 30 segundos. Para realizar un ensayo fenotípico, retire los embriones no fertilizados o muertos de la placa que contiene los embriones anestesiados. Usando fórceps afilados, retire el corion de los embriones.Monte los embriones en una placa de agarosa al 2% preparada con medio HBSS al 10% y observe bajo un microscopio estereoscópico. Utilice ImageJ para contar el número de neutrófilos y macrófagos de cada pez. Seleccione la selección a mano alzada y encierre en un círculo el pez entero, luego elija la opción Buscar máximos para contar las células fluorescentes En el presente estudio, los embriones tratados con Z-REX demostraron una pérdida de neutrófilos y macrófagos.Este efecto estuvo ausente en los grupos no tratados. La vía de señalización de la apoptosis no se activó en el grupo Halo-P2A-Keap1, lo que resultó en niveles inalterados de macrófagos y neutrófilos. También se observaron resultados similares en el mutante Halo-TEV-Keap1 que no respondió al HNE.Los análisis de PCR transcripcionales y cuantitativos en tiempo real mostraron una regulación negativa de los genes relacionados con el sistema inmunitario y una regulación positiva de los genes antioxidantes después de Z-REX. La tinción por inmunofluorescencia mostró que la construcción dividida P2A tenía dos veces más etiquetas HA que la construcción de fusión TeV, lo que indica niveles de expresión similares. Los niveles de expresión del tipo salvaje y el tipo mutante Halo-TeV-Keap1 también fueron similares.En la línea reportera de neutrófilos transgénicos tratados con Z-REX, también se observó colocalización de neutrófilos y caspasa 3 activa. Lo más importante es tener sus documentos configurados correctamente. Limitar realmente mejorará sus resultados.Hemos adoptado Z-REX, una idea para una plataforma de detección de drogas conocida como Localis-REX. Ninguna otra técnica hasta ahora ha sido capaz de lograr un mapeo de ligando u objetivo tan específico y reactivo local. Nos ha ayudado a desarrollar candidatos a fármacos electrofílicos para el tratamiento del cáncer de mama.Dada la creciente importancia de la señalización localizada en muchos campos, cáncer, inmunología, envejecimiento, etc., Z-Rex, la única herramienta capaz de mapear los eventos dirigidos al ligando reactivo localizado, promete ayudar a numerosos campos.

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Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

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