Name: Investigación de la biología y el metabolismo de la grasa beige utilizando el sistema de activación CRISPR SunTag-p65-HSF1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende a investigar la biología de la grasa beige utilizando el sistema de activación CRISPR SunTag-p65-HSF1 en adipocitos de Mus musculus. Este método permite la sobreexpresión de genes endógenos mediante AAV.

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Los autores agradecen el apoyo recibido del Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, para la generación de ratones AdipoSPH, el Laboratorio de Inmmunometabolismo y Señalización Celular, y el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología sobre Fotónica Aplicada a la Biología Celular (INFABIC) por todo el apoyo experimental. Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Campinas (protocolo CEUA #5810-1/2021).
1. Clonación molecular
<ol><li>Diseño de ARN guía única (sgRNAs)<ol><li>Diseñar sgRNAs para la activación de CRISPR utilizando CHOPCHOP, disponibles en https://chopchop.cbu.uib.no/, o cualquier otra herramienta adecuada. Utilice los siguientes parámetros para diseñar sgRNA dirigidos al gen Prdm16: Diana: Prdm16; En: Mus musculus; Utilizando: Crispr/Cas9; Para: Activación. NOTA: Diseñe sgRNAs para cada región de interés repartidas en una región de sitio de inicio de transcripción (TSS) ascendente de 200 pb. Por ejemplo, el sgRNA dirigido a Prdm16 utilizado en este estudio se une a 154 pb aguas arriba de TSS.</li>
		<li>Agregue voladizos al sgRNA para que coincida con el sitio de restricción de SacI en la columna vertebral del vector pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (consulte la Tabla de materiales). Incluye: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleótidos). Por ejemplo, la secuencia dirigida al gen Prdm16 es 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', y con voladizos es 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.</li>
		<li>Obtenga la secuencia inversa del complemento 3' sgRNA utilizando la herramienta disponible en https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Por ejemplo, la secuencia 3' sgRNA dirigida al gen Prdm16 es 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.</li>
	</ol></li>
	<li>Recocido de oligonucleótidos complementarios monocatenarios<ol><li>Añadir 1 μL de cada oligonucleótido monocatenario de 5' y 3' (concentración madre: 100 μM), 1 μL de tampón ligasa T4, 0,5 μL de polinucleótido quinasa T4 (PNK) (1 × 104 unidades/ml) y 6,5 μL deH2Oa un volumen de reacción final de 10 μL. Analice los oligonucleótidos monocatenarios complementarios utilizando un termociclador en las siguientes condiciones: 37 °C durante 30 min y 95 °C durante 5 min, seguido de una velocidad de descenso de 5 °C/min. NOTA: La enzima PNK se suministra con tampón PNK y no contiene suficiente ATP requerido para la reacción de fosforilación (ver Tabla de materiales). Para simplificar la reacción, use el tampón ligasa T4 (en lugar del tampón PNK). El tampón de la ligasa T4 proporciona la cantidad adecuada (1 mM de ATP) de fosfato para la reacción de fosforilación. La enzima PNK proporciona una fosforilación final 5' de oligonucleótidos para la posterior reacción de ligadura.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura de oligonucleótidos de ARNg recocidos<ol><li>Añadir 25 ng de plásmido pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry a 2 μL de oligonucleótidos de ARNg recocido, 1 μL de enzima SacI, 2 μL de tampón de ADN ligasa T4x T4, 1 μL de ADN ligasa T4 (1-3 u/μL) (ver Tabla de materiales) yH2Oa un volumen de reacción final de 10 μL.</li>
		<li>Realizar la ligadura incubando la mezcla de reacción utilizando un termociclador en las siguientes condiciones: 15 ciclos de 37 °C durante 5 min y 25 °C durante 5 min, seguidos de mantener a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformación seguida de reacción en cadena de la polimerasa de colonias (PCR)<ol><li>Transformar las células competentes de E. coli DH10B (ver Tabla de materiales) con 4 μL del producto de ligadura mediante choque térmico (42 °C durante 45 s) y extender sobre una placa de agar que contenga 100 μg/ml de ampicilina. </li>
		<li>Confirme las colonias transformadas por PCR de colonias utilizando la mezcla maestra de PCR (consulte la Tabla de materiales). Recoger la colonia y mezclar con 5 μL de mezcla maestra, 0,1 μL de cebador universal (concentración madre: 100 μM), 0,1 μL de cebador inverso de sgRNA (concentración madre: 100 μM) (Tabla 1) y 5 μL deH2O. Ejecutar la PCR con un termociclador en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial (94 °C durante 2 min), seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94 °C durante 20 s), recocido (60 °C durante 30 s), extensión (72 °C durante 30 s) y una etapa final de elongación (72 °C durante 5 min). Resolver el ADN mediante electroforesis en gel de agarosa (1,5%) en tampón TAE 0,5x a 90 V durante 30 min. NOTA: Los clones positivos dan una banda de ~280 pb.</li>
		<li>Enviar muestras positivas para la secuenciación de Sanger utilizando cebador universal (Tabla 1, Archivo Suplementario 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de plásmidos<ol><li>Purificar el plásmido de un clon positivo usando un kit de purificación de plásmidos (ver Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: Purificar el plásmido utilizando resina de intercambio aniónico u otro kit adecuado para su uso en la transfección celular.</li>
		<li>Incubar el clon positivo (12 h a 37 °C con agitación a 200 rpm) utilizando un medio de crecimiento bacteriano estándar que contenga 100 μg/ml de ampicilina.</li>
		<li>Centrifugar las células bacterianas a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C. Siga los siguientes pasos de acuerdo con las instrucciones del kit del fabricante.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Embalaje AAV
NOTA: El envasado AAV se realizó de acuerdo con publicaciones anteriores15,16 con modificaciones menores.
<ol><li>Placas de células 293T (ver tabla de materiales) en un matraz de 175 cm2 (siembra de 5 × 106 células por matraz) utilizando 25 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Incubar a 37 °C, 5% deCO2 y 95% de humedad hasta que las células alcancen el 50% -70% de confluencia.</li>
	<li>Mezclar 14 μL de polietilenimina (1 μg/μL) con 1 mL de NaCl 150 mM. Mezclar los tres plásmidos necesarios para la producción de AAV en una relación molar 1:1:1 (es decir, 17,7 μg de pAdDeltaF6, 7,9 μg de AAV2/8 (ver Tabla de materiales) y 5,9 μg de sgRNA clonado del paso 1 en 1 ml de NaCl de 150 mM. Transfiera la mezcla de polietilenimina:NaCl gota a gota al tubo que contiene el ADN (mezcla de plásmidos) e incube durante 20 min a 25 °C. NOTA: pAdDeltaF6 es un plásmido auxiliar y pCapsid pAAV2/8 es un plásmido de empaquetamiento que expresa los genes de replicación (Rep) y cápside (cap). Ambos plásmidos son necesarios para producir AAV.</li>
	<li>Antes de la transfección, reemplace el medio de crecimiento celular con 18 ml de DMEM que contenga 1% de FBS y L-alanil-L-glutamina (0,5 g / L). Añadir 2 ml de la mezcla de polietilenimina:ADN a cada matraz de cultivo e incubar las células en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% CO2, 95% de humedad).</li>
	<li>Después de 5 h, añadir 5 ml de DMEM suplementado con 10% FBS y L-alanil-L-glutamina (0,5 g/L).</li>
	<li>Después de 3 días de incubación, separar las células del matraz de cultivo con un raspador celular. Recoja las células 293T de 10 (175 cm2) matraces de cultivo celular en tubos cónicos de 50 ml y agregue DMEM (consulte la Tabla de materiales) hasta 30 ml.</li>
	<li>Agregue 3 ml de cloroformo a cada tubo cónico de 50 ml que contenga las células 293T y mezcle usando un mezclador de vórtice a alta velocidad durante 5 min. Resuspender las células añadiendo 7,6 mL de NaCl 5 M y vórtice brevemente. Centrifugar a 3.000 × g y 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo cónico y agregue 9.4 ml de polietilenglicol (PEG) al 50% (v / v) 8000. Mezclar con un mezclador de vórtices a alta velocidad durante 10 s y poner las muestras en hielo durante 1 h.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C durante 30 min. Retire el sobrenadante y deje que el pellet se seque durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 1,4 ml de HEPES (50 mM, pH 8) y mezclar durante 5 min con un mezclador de vórtice a alta velocidad. Añadir 3,5 μL de 1 M MgCl2, 14 μL de DNasa I (20 unidades/μL) y 1,4 μL de RNasa A (10 μg/μL). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 20 min, y luego transferir las muestras a nuevos tubos de 1,5 ml (700 μL en cada tubo).</li>
	<li>Añadir 700 μL de cloroformo a cada tubo de 1,5 ml y mezclar con un mezclador de vórtice a alta velocidad durante 10 s. Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C durante 5 min y transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Repita este paso 3 veces.</li>
	<li>Evaporar el cloroformo durante 30 minutos en un gabinete de bioseguridad. Luego, transfiera 300 μL de la fase acuosa a un tubo de ultracentrifugación de 0,5 ml (consulte la Tabla de materiales). Girar el filtro a 14.000 × g a 25 °C durante 5 min. Retire el flujo y gire el filtro de nuevo hasta que todo el volumen haya pasado a través del filtro.</li>
	<li>Lave el filtro añadiendo 300 μL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y mezcle las soluciones con pipeteo. Centrifugar el filtro durante 5 min a 14.000 × g a 25 °C. Repita este paso de lavado 4x.</li>
	<li>Centrifugar el filtro durante 8 min a 14.000 × g a 25 °C. Coloque el filtro boca abajo en un tubo nuevo y gire durante 2 minutos a 1.000 × g a 25 °C.</li>
</ol>3. Titulación del VAA por qPCR
<ol><li>Preparar una curva estándar para la titulación de AAV y determinar el título de AAV de acuerdo con el estudio original de Fripont et al.15.</li>
</ol>4. Inyección in vivo de AAV en el tejido adiposo blanco inguinal (iWAT)
<ol><li>Separe las herramientas quirúrgicas y los suministros necesarios para la cirugía y esterilícelos según lo recomendado para cada material específico.</li>
	<li>Anestesiar al ratón con 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina mediante inyección intraperitoneal. Confirme la anestesia aplicando una presión vigorosa sobre la pata y la cola y verificando si hay un reflejo. Aplique ungüento en los ojos del ratón para evitar la sequedad ocular durante la cirugía.</li>
	<li>Coloque el ratón anestesiado en posición supina y afeite un área pequeña en los flancos, proximal a las articulaciones de la cadera para inyecciones iWAT, con una afeitadora. Aplicar crema depilatoria durante 5 min. Retire la crema residual con agua para evitar quemaduras en la piel.</li>
	<li>Desinfecte la piel usando tres rondas alternas de aplicación de solución antiséptica (povidona yodada) sobre la piel con una gasa limpia y alcohol al 70%. Deseche la gasa después de cada uso.</li>
	<li>Realizar una aplicación final de una solución antiséptica sobre la piel. Luego, haga una incisión de 1-2 cm con tijeras esterilizadas en el área proximal de las articulaciones y mantenga la piel abierta con fórceps para exponer el depósito de grasa. El WAT se puede encontrar adherido a la piel en ambos lados, extendiéndose desde el principio en la espalda y hacia abajo hacia el testículo. NOTA: Use cortinas para evitar la contaminación durante la cirugía o los procedimientos de sutura.</li>
	<li>Usando fórceps, a través de la incisión, tire suavemente del depósito de grasa hacia arriba para asegurarse de que la inyección esté en la ubicación y profundidad correctas. NOTA: Tenga cuidado de no retirar el tejido de su ubicación original.</li>
	<li>Llene la jeringa de microlitros (calibre: 33; estilo de punto: 4; ángulo: 12; longitud: 10) (consulte la Tabla de materiales) con 2,5 μL (5,6 × 1010 genomas virales [VG]/μL) del AAV (que contiene el sgRNA dirigido al gen endógeno Prdm16). Inserte con cuidado la aguja en un ángulo de 30°-45° en el iWAT. Repita la inyección 5 veces en diferentes ubicaciones del tejido para infectar homogéneamente toda la almohadilla de grasa iWAT. Se recomienda un volumen total de 15 μL para infectar el iWAT. NOTA: La profundidad de inserción de la jeringa depende del grosor del depósito de la almohadilla de grasa. Utilice la técnica sin contacto para elaborar la inyección.</li>
	<li>Cierre la incisión de la piel afeitada con suturas de monofilamento 4/0. Coloque el ratón en una almohadilla térmica hasta que recupere la conciencia. Controle al animal cada 10-15 minutos hasta que se recupere por completo. Después de que el animal recupere la conciencia, observe el perfil locomotor, que debe ser lineal y no tener signos de angustia o dolor.</li>
	<li>Realizar el control del dolor postoperatorio dentro de las 48 h después de la cirugía mediante la administración de clorhidrato de tramadol (5 mg / kg) por vía intraperitoneal durante 3 días (2 veces / día). NOTA: Esté atento a los signos de angustia y malestar y controle la ingesta de agua y alimentos. Administre una dosis efectiva de analgésico de manera preventiva, preferiblemente antes o al comienzo de la cirugía.</li>
	<li>Mantenga al ratón en una jaula con acceso gratuito a alimentos y agua durante el período de curación. Después del período de curación, proceda a la eutanasia del ratón. En este estudio, la eutanasia se realizó por una sobredosis de anestésicos inyectables (intraperitoneales) de 3 veces la dosis inductora (300-360 mg / kg de clorhidrato de ketamina + 30-40 mg / kg de clorhidrato de xilazina) seguido de decapitación. NOTA: Se recomienda encarecidamente mantener a los animales alojados en jaulas individuales hasta que estén completamente recuperados de la anestesia.</li>
</ol>5. Diferenciación in vitro de células vasculares estromales (SVF) en adipocitos beige
<ol><li>Realizar el aislamiento y recubrimiento de SVFs primarios del iWAT de ratones AdipoSPH según Aune et al.17. SVF de semillas derivadas de ratones AdipoSPH iWAT en una placa de 6 pocillos que contiene medio completo (DMEM que contiene 3.1 g / L de glucosa, 0.5 g / L de L-alanil-L-glutamina, 10% FBS y 2.5% P / S) durante 1-2 h. NOTA: La fracción SVF contiene una mezcla de diferentes tipos de células. En este paso, no es posible definir el número de células progenitoras sembradas que dan lugar a los adipocitos.</li>
	<li>Aspire el medio, lave el pozo 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) y reemplácelo con un medio fresco completo. Incubar las células a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad hasta que las células alcancen 70% -80% de confluencia.</li>
	<li>Inducir la diferenciación (día 0) mediante el tratamiento de las células con el medio de inducción (Tabla 2). NOTA: El cóctel farmacológico del medio de inducción es necesario para mejorar la diferenciación de los adipocitos beige y para la expresión del programa génico termogénico17.</li>
	<li>Después de 2 días (día 2), reemplace el medio de inducción con el medio de mantenimiento (Tabla 2).</li>
	<li>Después de 2 días (día 4), reemplace el medio de mantenimiento con un nuevo medio de mantenimiento (Tabla 2) durante 2 a 3 días.</li>
	<li>Cambie el medio de mantenimiento cada 48 h hasta que los preadipocitos estén completamente diferenciados en adipocitos (típicamente 6 días después de la adición del medio de inducción). Los adipocitos maduros se pueden observar mediante microscopía óptica, ya que las células diferenciadas parecen estar cargadas de gotas de lípidos.</li>
</ol>6. Infección in vitro por AAV de SVF
NOTA: Los SVF derivados de ratones AdipoSPH iWAT fueron infectados con sgRNA-Prdm16 portadores de AAV como se describió previamente por Wang et al.18 con algunas modificaciones.
<ol><li>Cultivar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos con medio completo hasta que las células alcancen una confluencia del 70%-80%, como se describió anteriormente en los pasos 5.1-5.3.</li>
	<li>Mezclar 5,6 ×10 10 VG/μL de sgRNA-Prdm16 portador de AAV con 2 ml de medio completo y bromuro de hexadimetrina (8 μg/ml) (ver Tabla de materiales). Transducir las células reemplazando el medio completo y agregando el medio completo que contiene AAV. Incubar las células transducidas durante 12 h a 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO2.</li>
	<li>Dividir y sembrar las células como se describe en el paso 5 para la proliferación celular y la diferenciación en adipocitos beige. NOTA: Para el ensayo de consumo de oxígeno, semilla 4.0 × 104 células (del paso 6.2) por pocillo con medio de inducción en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Los pasos posteriores de proliferación y diferenciación celular se realizan como se describe en el paso 5. El ensayo de consumo de oxígeno se realiza cuando las células alcanzan la confluencia del 80%-100% y están completamente diferenciadas, como se informó anteriormente19.</li>
</ol>

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<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
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<li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una de las aplicaciones no editativas más útiles de la tecnología CRISPR es la interrogación de la función génica mediante la activación de genes endógenos utilizando sistemas CRISPRa6. SPH es un potente CRISPRa que fue descrito originalmente para inducir la conversión de astrocitos en neuronas activas al dirigirse a varios genes neurogénicos14. En este estudio, AdipoSPH demostró ser una herramienta adecuada para investigar la biología de la grasa beige mediante la activaci...

Los adipocitos beige (o brite) son adipocitos ricos en mitocondrias que expresan la proteína 1 (UCP1) y que residen dentro de los depósitos de tejido adiposo blanco (WAT). La grasa beige emerge de un subconjunto de progenitores adipocitos o adipocitos blancos maduros en respuesta a la exposición al frío y otros estímulos 1,2. Los adipocitos beige pueden convertir la energía en calor de una manera dependiente de UCP1 o independiente3. Independientemente de su función termogénica, la grasa beige también puede mejorar la salud metabólica por otros medios, como la secreción de adipoquinas y actividades antiinflamatorias y antifibróticas. Los estudios en ratones y humanos han demostrado que la inducción de grasa beige mejora la homeostasis de la glucosa y los lípidos de todo el cuerpo3. Sin embargo, aunque nuestro conocimiento de la biología de la grasa beige ha evolucionado rápidamente en los últimos años, la mayoría de sus beneficios metabólicos y mecanismos relacionados aún no se comprenden completamente.
Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) se describieron por primera vez en células eucariotas como una herramienta capaz de generar una ruptura de doble cadena (DSB) en un sitio específico del genoma a través de la actividad nucleasa de la proteína Cas9 4,5. Cas9 es guiado por un ARN sintético de guía única (sgRNA) para dirigirse a una región genómica específica, lo que lleva a un ADN DSB. Además de utilizar la nucleasa Cas9 con fines de edición, la tecnología CRISPR-Cas9 ha evolucionado para ser utilizada como una herramienta de regulación génica específica de secuencia6. El desarrollo de una proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) y la asociación de módulos transcripcionales capaces de mejorar la expresión génica ha dado lugar a herramientas de activación CRISPR (CRISPRa). Han surgido varios sistemas CRISPRa, como VP647,8, mediador de activación sinérgica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 y SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, que combina los componentes de los activadores SAM y SunTag. Recientemente se ha demostrado que la expresión inducida de genes neurogénicos en neuroblastos N2a y astrocitos primarios es mayor utilizando SPH en comparación con otros sistemas CRISPRa14, demostrando SPH como una herramienta CRISPRa prometedora.
Aquí, aprovechamos un ratón SPH14 previamente desarrollado para generar un modelo de ratón condicional que expresa SPH específicamente en adipocitos utilizando el linaje de adiponectina Cre (AdipoSPH). Usando un virus adenoasociado (AAV) portador del ARNg dirigido al gen endógeno Prdm16, se indujo el pardeamiento (conversión de blanco a beige) de WAT inguinal (iWAT) para aumentar la expresión del programa de genes termogénicos. Además, la sobreexpresión in vitro de Prdm16 mejoró el consumo de oxígeno. Por lo tanto, este protocolo proporciona un modelo versátil de ratón SPH para explorar los mecanismos del desarrollo de grasa beige dentro del tejido adiposo.

<table><tbody><tr><td>3,3',5-Triyodo-L-tironina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro 293T Línea celular</td><td>Takarabio</td><td>632273</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Filtro ultra centrífugo</td><td>Merckmillipore UFC510008</td><td></td><td>100 KDa</td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&trade; suplemento</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td>altas concentraciones de glucosa, aminoácidos y vitaminas</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Excelta Microtijeras de apertura automática</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células Fisherbrand (100 unidades)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas/pinzas de punta ultrafina rectas cónicas de alta precisión de Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección de punta afilada</td><td>Fisherbrand Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Rapid Sistema de ligadura de ADN</td><td>Promega</td><td>M8225</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep kit de purificación&nbsp;</td>Jeringa de microlitro <td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td>Modelo 701</td></tr><tr><td>NEB 10-beta/Estable&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019H</td><td>E. coli células competentes</td></tr><tr><td>pAAV2/8&nbsp;</td><td>Addgene &nbsp;</td><td></td><td></td>112864</tr><tr><td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>91947</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6&nbsp;</td><td>Addgene &nbsp;</td><td></td><td></td>112867</tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23966</td><td>Lineal, MW 25000</td></tr><tr><td>Povidona yodada</td><td>Rioqu&iacute; Mica</td><td>510101303</td><td>Antiséptico</td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Enzima SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156</td><td></td></tr><tr><td>Diseño quirúrgico Premier Adson Pinzas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-741</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Hamilton</td><td>475-40417</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>Promega</td><td>M180B</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ADN ligasa T4&nbsp;</td><td>Kit de enzimas New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tramadol</td><td>SEM</td><td>43930</td><td></td></tr><tr><td>Gel Vidisic &nbsp;</td><td>Bausch + Lomb&nbsp;</td><td>99620</td><td></td></tr></tbody></table>

investigación de la biología y el metabolismo de la grasa beige utilizando el sistema de activación crispr suntag-p65-hsf1

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

La tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) ha provocado una revolución en la biología, y las herramientas recientes se han aplicado mucho más allá de la edición de genes descrita originalmente. El sistema de activación CRISPR (CRISPRa) combina la proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) con distintos módulos de transcripción para inducir la expresión génica endógena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) es una tecnología CRISPRa recientemente desarrollada que combina componentes de mediadores de activación sinérgicos (SAM) con los activadores SunTag. Este sistema permite la sobreexpresión de genes únicos o múltiples mediante el diseño de un ARN guía única personalizado (sgRNA). En este estudio, se utilizó un ratón SPH previamente desarrollado para generar un ratón condicional que expresa SPH en adipocitos (linaje adiponectina Cre), llamado AdipoSPH. Para inducir un fenotipo de grasa blanca a beige (pardeamiento), se inyectó un virus adenoasociado (AAV) portador de sgRNA dirigido al gen endógeno Prdm16 (un factor de transcripción bien establecido relacionado con el desarrollo de grasa marrón y beige) en el tejido adiposo blanco inguinal (iWAT). Este modelo de ratón indujo la expresión endógena de Prdm16 y activó el programa del gen termogénico. Además, la sobreexpresión de Prdm16 inducida por SPH in vitro aumentó el consumo de oxígeno de los adipocitos beige, fenocopiando los resultados de un modelo previo de ratón transgénico Prdm16. Por lo tanto, este protocolo describe un modelo de ratón versátil, rentable y rentable para investigar la biología del tejido adiposo.

Los ratones AdipoSPH se desarrollaron mediante la cría de cepas de ratones SPH y Adipoq-Cre. Ambas cepas de ratón tenían un fondo híbrido C57BL6J-DBA/2J (según el proveedor comercial; ver Tabla de materiales). El linaje del ratón SPH fue descrito originalmente por Zhou et al.14.
Desarrollo de adipocitos beige in vivo a través de la sobreexpresión de Prdm16 mediada por AdipoSPH Para evaluar la capacidad del ...

Este protocolo presenta el uso de CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) en adipocitos (AdipoSPH) como una estrategia alternativa al virus adenoasociado (AAV) para investigar la biología de la grasa beige. La inyección in vivo de ARNg portador de AAV dirigida al gen endógeno Prdm16 es suficiente para inducir el desarrollo de grasa beige y mejorar el programa de genes termogénicos.

Investigación de la biología y el metabolismo de la grasa beige utilizando el sistema de activación CRISPR SunTag-p65-HSF1

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

Este protocolo presenta el Sistema de Activación SPH CRISPR como una estrategia alternativa a los vectores virales convencionales para realizar ensayos de función de ganancia en adipocitos. Permite la sobreexpresión de genes endógenos de adipocitos únicos o múltiples dentro del complejo entorno celular del tejido adiposo mediante la entrega de un ARN guía único personalizado utilizando un virus adenoasociado. Los pasos desafiantes de este protocolo están relacionados con la clonación del ARN guía único y la producción e inyección de virus adenoasociados en el tejido adiposo.Para comenzar, diseñe ARN guía única o ARNg para la activación de CRISPR utilizando chopchop o cualquier otra herramienta adecuada. Diseñar el sgRNA dirigido al gen PRDM16 utilizando los siguientes parámetros:Target como PRDM16 en un musculus musculoso usando un CRISPR/Cas9 y para como activación. Agregue voladizos al sgRNA para que coincida con el sitio de restricción Sac1 en la columna vertebral vectorial PAAVU6GRNACBHM cereza.Incluye 5'AGCT 3' donde n corresponde a nucleótidos. Obtener la secuencia inversa del complemento 3'sgRNA utilizando la herramienta indicada. A continuación, para el recocido de oligonuc

investigation-beige-fat-biology-metabolism-using-crispr-suntag-p65

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

En este reportaje de vídeo, mostramos la aplicación de la Luminiscencia de Cerenkov para el tejido adiposo marrón interescapular en ratones en condiciones activadas y deprimidas.

Cerenkov Luminiscencia Imaging de interescapular tejido adiposo marrón

Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Imágenes funcionales y cuantificación de depósitos adiposos termogénicos en ratones utilizando un enfoque basado en imágenes micro-PET / MR.

Visualización y cuantificación de tejidos adiposos marrones y beige en ratones utilizando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la importancia fisiológica del impacto de la actividad del tejido adiposo marrón (BAT) en el metabolismo humano. Esto se logra combinando la carga de carbohidratos y la calorimetría indirecta con mediciones de cambios supraclaviculares en la temperatura. Este nuevo enfoque puede ayudar a desarrollar un objetivo farmacológico para la termogénesis BAT en humanos.

Uso de una combinación de calorimetría indirecta, termografía infrarroja y niveles de glucosa en sangre para medir la termogénesis del tejido adiposo marrón en humanos

Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad del tejido adiposo marrón después de una comida en humanos y animales de laboratorio.

Termografía infrarroja para la detección de cambios en la actividad del tejido adiposo marrón

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe el uso de fragmentos microvasculares aislados de tejido graso humano o de roedores como un enfoque directo para diseñar tejido adiposo beige vascularizado funcional.

Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.

Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Aprende a investigar la biología de la grasa beige utilizando el sistema de activación CRISPR SunTag-p65-HSF1 en adipocitos de Mus musculus. Este método permite la sobreexpresión de genes endógenos mediante AAV.

Investigación de la biología y el metabolismo de la grasa beige utilizando el sistema de activación CRISPR SunTag-p65-HSF1

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