AMEBaS: Extracción automática de la línea media y sustracción de fondo de time-lapses de fluorescencia radiométrica de células individuales polarizadas

Este método cuantifica la dinámica espacio-temporal de las células polarizadas a lo largo de su línea media que expresan un reportero fluorescente o un colorante para entidades específicas de interés, como la actina, los iones o la dinámica de las vesículas. La versión de automatización elimina los sesgos y permite la escalabilidad, especialmente para las tareas que se realizan digitalmente de forma manual y pueden llegar a ser tediosas y subjetivas. Para empezar, abra Jupyter Notebook y lea los archivos de lapso de tiempo, ya sea accediendo a la página principal del bloc de notas interactivo de Google CoLab o descargando y abriendo el AMEBaS_local IP YNB desde GitHub.

Para preparar la configuración del directorio para los datos de entrada y salida utilizando la versión local, coloque el time-lapse de fluorescencia como un archivo TIF o DV dentro de una carpeta llamada data ubicada en la carpeta raíz del programa. Cree una carpeta out para recibir los datos generados y, a continuación, ejecute el bloque de código de instalación. Si usa el bloc de notas en Google CoLab, ejecute el bloque de código de configuración para generar automáticamente los datos y las carpetas de salida, luego ejecute el bloque de código de entrada de archivos para leer los datos de lapso de tiempo haciendo clic en el botón de reproducción.

Si utiliza Google CoLab, cargue el archivo de lapso de tiempo en la carpeta de datos haciendo clic en el botón elegir archivo. A continuación, elija generar salidas adicionales para cada paso estableciendo el parámetro detallado en true o false. Para detectar la celda principal y el segmento del fondo, ejecute el bloque de código de segmentación de celda única haciendo clic en el botón de reproducción para separar automáticamente la celda de interés del fondo.

Ajuste el valor sigma en la variable sigma para ajustar la suavidad de la máscara de segmentación. El valor predeterminado es 2.0. Ahora establezca la estimación de la variable en false para almacenar el umbral estimado directamente a partir de los datos ISO, o true para suavizarlo a través de fotogramas vecinos mediante la regresión polinómica local.

Ajuste la variable n_points para ajustar la función con el valor predeterminado 40. Para trazar la línea media a lo largo de la extensión de celda, ejecute el bloque de código de seguimiento de la línea media de la celda haciendo clic en el botón de reproducción para esqueletizar la celda mediante el método de Lee y extender la punta del último esqueleto a través de la extrapolación lineal. A continuación, seleccione la opción de trazado para la línea media ajustando el argumento complete_skeletonization para trazar en el último fotograma o una vez por fotograma.

Ajuste la variable interpolation_fraction para establecer la fracción de puntos del esqueleto para la interpolación durante la extrapolación. El valor predeterminado aquí es 0,25. A continuación, modifique la variable extrapolation_length para determinar la longitud de la extrapolación de la línea media.

El valor predeterminado es menos uno, que extiende el esqueleto hasta el borde más cercano. Ahora ejecute el primer bloque de código de visualización de datos haciendo clic en el botón de reproducción para generar automáticamente kymographs para ambos canales. Elija el tamaño del kernel gaussiano para suavizar ajustando la variable kymograph_kernel.

Para mostrar correctamente las intensidades de los esqueletos no extendidos, se necesita un mapa de color personalizado para sus quimógrafos tapados. Ajuste la variable shift_fraction para elegir el porcentaje de fracción de intensidades que se designará como color de fondo, negro. A continuación, ejecute el segundo bloque de código de visualización de datos haciendo clic en el botón de reproducción para generar automáticamente un quimógrafo métrico de proporción y un time-lapse.

Ajuste la variable switch_ratio para cambiar el orden de los canales utilizados como numerador y denominador durante los cálculos de proporción, siendo el valor predeterminado false. Compruebe si el lapso de tiempo de relación requiere un suavizado adicional con una pasada de filtro mediana ajustando la variable smooth_ratio. De forma predeterminada, se establece en false.

A continuación, elija eliminar o mantener los valores atípicos resultantes de una señal baja en el canal del denominador ajustando la variable reject_outliers. Los valores atípicos se marcan como valores 1,5 veces el rango intercuartílico por encima del tercer cuartil. Por último, elija si es necesario exportar el fondo y la salida de la métrica de proporción ajustando la variable background_ratio.

El valor predeterminado es false para reemplazar el fondo con ceros. AMEBaS probado en conjuntos de datos como tubos polínicos que expresan el cameleón reportero de calcio, tubos polínicos que expresan el indicador de pH florina, pelos radiculares que expresan el indicador de calcio NESYC 3.6 funcionó con éxito a pesar de las diferencias en la dirección de crecimiento, las técnicas de imagen, los reporteros fluorescentes y los tipos de células. Recuerde ejecutar el conjunto de bloques para que pueda instalar los paquetes necesarios.

Además, es crucial ajustar los valores sigma específicamente para sus imágenes para que pueda obtener resultados más precisos. Los quimógrafos resultantes se pueden utilizar para analizar la dinámica espacio-temporal del interés de resolución. Además, puedes calcularlo encontrando método, crecimiento y series temporales para analizar la solución adecuada.