Name: Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a generar esferoides 3D de líneas celulares de pez cebra (ZEM2S y ZFL) para estudios de toxicidad acuática. Este método simple y rápido mejora la evaluación de seguridad ambiental sin usar animales.

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En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticário.

Los pasos clave para generar esferoides 3D de líneas celulares ZFL y ZEM2S en una placa de fondo redondo de 96 pocillos se presentan en la Figura 1.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para ver las soluciones y los medios de cultivo utilizados en este protocolo.
1. Medio de cultivo celular y cultivos monocapa
<ol><li>Cultivar ambas líneas celulares (ZFL, ZEM2S) como monocapas en una incubadora a 28 °C sinCO2, y subcultivarlas a una relación de subcultivo de 1:3 cuando alcancen ~80% de confluencia.<ol><li>Comience con un matraz T75 de células de pez cebra en ~80% de confluencia, cultivado como se describió anteriormente.</li>
		<li>Retirar el medio completo y lavar las células añadiendo 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M) al matraz de cultivo con la ayuda de una pipeta.</li>
		<li>Con la ayuda de una pipeta, añadir 3 ml de 1x tripsina-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) a los matraces de cultivo e incubar a 28 °C durante 3 min para separar las células del matraz.</li>
		<li>Golpee suavemente el matraz para liberar las células y luego detenga la digestión de tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo completo al matraz.</li>
		<li>Con una pipeta, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrifugar a 100 × g durante 5 min.</li>
		<li>Después de la formación del pellet, retire con cuidado el sobrenadante, agregue 1 ml del medio completo para la línea celular respectiva en uso (ZFL o ZEM2S) y vuelva a suspender con una micropipeta. Tome una alícuota para el conteo de células.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Conteo celular con prueba de exclusión de colorante azul de tripano
<ol><li>Agregue 10 μL de la suspensión celular y 10 μL de colorante azul de tripano a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad. Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta.</li>
	<li>Luego, transfiera 10 μL de esta mezcla (suspensión celular + azul de tripano) a una cámara de Neubauer y cuente las celdas en los cuatro cuadrados grandes (cuadrantes: Q) colocados en las esquinas de la cámara, considerando viables las células que no absorben azul de tripano. Calcula el número de celdas viables usando la ecuación (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Para calcular el número de células final en la suspensión celular, multiplique el número de células determinado mediante la ecuación (1) por 2 (el factor de dilución debido al uso de azul de tripano). NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema automatizado de conteo de células.</li>
</ol>3. Recubrimiento celular en placas ULA
<ol><li>Después de calcular el número de celdas, ajuste la suspensión celular a la placa 200 μL de esta suspensión por pocillo de una placa ULA de fondo redondo de 96 pocillos con el número de celdas requeridas para cada línea celular, como se indica a continuación:<ol><li>Placa 7.000 células ZFL viables/pocillo; por lo tanto, para toda la placa ULA, use 700,000 células en 20 ml de medio completo.</li>
		<li>Placa 3.500 células ZEM2S viables /pocillo; por lo tanto, para toda la placa ULA, use 350,000 células en 20 ml de medio completo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar la suspensión celular con la concentración ajustada de células en un depósito medio y mezclarla con una micropipeta multicanal, teniendo cuidado de no formar espuma ni burbujas. Utilizando la micropipeta multicanal, añadir 200 μL de la suspensión celular ajustada a cada pocillo de la placa ULA. NOTA: La placa debe sellarse con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo de la placa de 96 pocillos.</li>
</ol>4. Formación de esferoides
<ol><li>Incubar la placa ULA en un agitador orbital a 70 rpm durante 5 días en una incubadora de 28 °C. Permitir que los esferoides se formen durante 5 días de agitación orbital (Figura 2), alcanzando un tamaño promedio de ~225 μm de diámetro (esferoides ZFL) y ~226 μm de diámetro (esferoides ZEM2S)12. NOTA: Después de 5 días de incubación (circularidad máxima), los esferoides están listos para ser utilizados.</li>
	<li>Para mantener los esferoides en cultivo durante más de 5 días, retire 100 μL del medio gastado cada 5 días y agregue 100 μL de medio de cultivo completo fresco utilizando una micropipeta multicanal. NOTA: Tenga cuidado de no aspirar los esferoides durante este proceso.</li>
</ol>5. Medición del tamaño (diámetro) y la forma (índice de circularidad) de los esferoides
<ol><li>Adquiere las imágenes.<ol><li>Bajo un microscopio de luz invertida con un sistema de captura de imágenes, obtenga una imagen de una escala definida. NOTA: Utilice un portaobjetos de calibración de etapa de microscopio o un portaobjetos Neubauer (en el que se conocen los tamaños de cuadrante) para obtener la escala.</li>
		<li>Bajo el microscopio y utilizando la misma lente objetiva utilizada para obtener la imagen de la escala, obtenga imágenes de los esferoides completamente formados (es decir, esferoides de 5 días de edad). NOTA: Todas las imágenes deben tomarse utilizando el mismo sistema de captura de imágenes, ya que la resolución de la imagen es importante para determinar el tamaño y la forma de los esferoides, y puede diferir entre los tipos de sistemas.</li>
	</ol></li>
	<li>Establece la escala.<ol><li>Con el software ImageJ, abra la imagen de la escala definida (haga clic en Archivo | abrir).</li>
		<li>Seleccione el selector de línea recta de la barra de herramientas y, con el ratón, arrastre una línea a través de la extensión de la escala definida en la imagen.</li>
		<li>Establezca la escala seleccionando Analizar | Defina la escala y espere a que se abra la ventana Definir escala .</li>
		<li>En la ventana Definir escala, rellene el espacio en blanco de Distancia conocida con la distancia conocida (μm) correspondiente a la línea recta; rellene la unidad de longitud con mmm para μm. Haga clic en Aceptar. NOTA: La escala en píxeles/μm se muestra en la parte inferior de la ventana.</li>
	</ol></li>
	<li>Establezca los parámetros de medición.<ol><li>En el software ImageJ, seleccione Analizar | Defina medidas para abrir la ventana Definir medidas .</li>
		<li>En la ventana Establecer medidas, seleccione las casillas para las mediciones deseadas (es decir, descriptores de área y forma). Haga clic en Aceptar.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtener el diámetro y la circularidad de los esferoides.<ol><li>Abrir la imagen de un esferoide (Archivo | Abierto).</li>
		<li>Seleccione la herramienta de selección a mano alzada en la barra de herramientas y, con el ratón, seleccione el lado exterior del esferoide, como se muestra en la figura 3A. NOTA: Para acercar o alejar la imagen, presione la tecla Ctrl y use el mouse para desplazarse hacia abajo o hacia arriba, o presione la tecla Ctrl y use las teclas de flecha arriba o abajo en el teclado.</li>
		<li>Seleccione Analizar | Medida para abrir la ventana Resultados , en la que se muestran los valores medidos.</li>
		<li>Usando el valor de Área , calcule el tamaño (diámetro) de los esferoides usando la ecuación (2): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
		<li>El índice de circularidad se da en la ventana Resultados como "Circ.", y es calculado automáticamente por el software utilizando la ecuación (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) NOTA: El índice de circularidad de 1.0 representa una forma esferoidal perfecta, mientras que un valor cercano a 0.0 indica una forma alargada13.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Este es un método simple, fácil y rápido para generar esferoides de hígado de pez cebra y líneas celulares embrionarias. Este método fue desarrollado por este grupo basado en modificaciones de los métodos de esferoides 3D existentes para superar los problemas reportados en estudios científicos relacionados con la formación de esferoides, así como las incertidumbres en la precisión de los datos de los ensayos de esferoides 3D. Por ejemplo, los problemas reportados radican en las dificultades de manejo, la naturaleza lenta...

Los esferoides son pequeñas esferas de células que se forman cuando las células se cultivan en estrecho contacto de célula a célula en cultivo 3D. La capacidad de los esferoides para imitar el entorno tisular in vivo ya ha sido estudiada en una variedad de líneas celulares y células primarias 1,2. Sin embargo, aunque los esferoides están bien desarrollados para estudios de toxicidad en mamíferos, el desarrollo de esferoides para estudios de toxicidad con vertebrados no mamíferos (por ejemplo, peces) todavía está en curso3. Para las líneas celulares de peces, los esferoides se han desarrollado mediante una variedad de métodos diferentes, como la agitación orbital (OS) utilizando diferentes tipos de placas de pozo 3,4,5,6,7, y el método de levitación magnética utilizando nanopartículas magnéticas8. Sin embargo, algunos de estos métodos de cultivo para esferoides pueden tener más desventajas que otros.
Por ejemplo, los métodos giratorios en microplacas grandes (placas de 24 pocillos) pueden generar un gran número de esferoides que difieren en tamaño y forma; De hecho, se ha demostrado la formación de estructuras multiesferoides7. Esto requiere intensos esfuerzos para seleccionar esferoides con un tamaño y forma similares para un experimento. El método de cultivo 3D de gota colgante se utiliza comúnmente para generar esferoides de líneas celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, por lo que se pueden generar esferoides individuales por gota, evitando los problemas descritos anteriormente. Sin embargo, aunque un método modificado de gota colgante (gota colgante + agitación orbital) es capaz de generar esferoides ZFL utilizando un método económico, tiene sus desventajas12. Los agregados celulares formados no pueden mantenerse durante largos períodos en las gotas; Por lo tanto, deben transferirse a placas de pozo. Este proceso requiere una manipulación intensa y largos períodos de trabajo en una campana de flujo laminar, ya que se realiza gota a gota utilizando una micropipeta12. Además, este método requiere 10 días para formar completamente los esferoides ZFL (5 días en gota colgante + 5 días en SG)12. Estas desventajas pueden limitar la aplicación de esferoides de peces 3D para pruebas de toxicidad, especialmente teniendo en cuenta las posibles aplicaciones para la priorización química y la sostenibilidad del producto.
Por lo tanto, este artículo describe un protocolo de cultivo 3D capaz de generar esferoides individuales de líneas celulares ZFL (D. rerio hepatocito normal) y ZEM2S (embrión en fase blastula de D. rerio) basado en el uso combinado de placas de fijación ultra bajas de 96 pocillos (placas ULA) y un agitador orbital (22 mm de diámetro rotacional). El método aplicado es simple y reproducible, y puede generar un gran número de esferoides de tamaño y forma similares en un corto período de tiempo (5 días). Las ventajas de este método pueden apoyar la aplicación de modelos 3D de peces para estudios de toxicidad acuática tanto en la industria como en la academia, así como el progreso de la implementación de métodos alternativos para pruebas de ecotoxicidad.

<table><tbody><tr><td>Microplaca transparente de ultra baja fijación con fondo redondo y transparente de 96 pocillos, envuelta individualmente, con tapa, estéril</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, polvo, glucosa alta, piruvato</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix, polvo</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Procesamiento y análisis de imágenes en Java ( ImageJ) software 1.52p</td><td>&nbsp; Institutos Nacionales < Salud de >, EE. UU</td><td></td>. <td>Disponible en:</td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html Leibovitz's L-15 Medium, polvo</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm de diámetro</td></tr><tr><td>de rotación Dulbeccos PBS (10x) con calcio y magnesio</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, polvo, &nbsp; biorreactivo para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripano (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>línea celular ZEM2S</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Esta línea celular fue amablemente donada por el Profesor Dr. Michael J. Carvan (Universidad de Wisconsin, Milwaukee, EE. UU.)</td></tr><tr><td>Línea celular ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de cultivo 3d de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

Las líneas celulares de peces son modelos in vitro prometedores para la evaluación de la ecotoxicidad; sin embargo, los sistemas convencionales de cultivo monocapa (cultivo 2D) tienen limitaciones bien conocidas (por ejemplo, la longevidad del cultivo y el mantenimiento de algunas funciones celulares in vivo ). Así, se han propuesto cultivos 3D, como los esferoides, ya que estos modelos pueden reproducir estructuras similares a tejidos, recapturando mejor las condiciones in vivo . Este artículo describe un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides con dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal). El protocolo consiste en enchapar las celdas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, de fijación ultrabaja. Después de 5 días bajo agitación orbital (70 rpm), se forma un solo esferoide por pocillo. Los esferoides formados presentan tamaño y forma estables, y este método evita la formación de múltiples esferooides en un pozo; Por lo tanto, no es necesario seleccionar esferoides de tamaños similares. La facilidad, velocidad y reproducibilidad de este método esferoide lo hacen útil para pruebas in vitro de alto rendimiento.

Los esferoides individuales por pozo con un tamaño y forma estables se forman por este método. La Figura 2 ilustra el proceso de formación de esferoides individuales de células ZFL y ZEM2S en un pocillo de una placa ULA bajo agitación orbital (70 rpm). Las líneas celulares ZFL y ZEM2S tienen diferentes comportamientos en la cultura 3D. La línea celular ZEM2S presenta características que confieren la capacidad de formar fácilmente una forma esferoidal desde el primer día de la sacudida orbita...

Aquí, presentamos un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides de dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal).

Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

Este protocolo puede generar fácilmente esferoides de pez cebra, un modelo 3D in vitro con diferente aplicación potencial en pruebas de toxicidad de peces. Este es un método simple y rápido para generar esferoides individuales de líneas celulares de pez cebra muy similares en tamaño y forma. Si sigue todos los pasos descritos correctamente, uno no debería encontrar ningún problema.Los esferoides del pez cebra pueden beneficiar enormemente el mecanismo, la exploración de los efectos de los productos químicos en los peces, lo que ayuda a mejorar la evaluación de la seguridad ambiental de productos como los cosméticos. Demostrando el procedimiento estará Irisdoris Rodrigues de Souza, doctora en genética de mi laboratorio. Para empezar, tome un matraz T75 de células de pez cebra en torno al 80% de confluencia.Retirar el medio completo y lavar las células añadiendo 0,01 PBS molares al matraz de cultivo con una pipeta. Lavar el matraz de cultivo con PBS agitándolo suavemente y, a continuación, retirar el PBS. Añadir tres mililitros de tripsina 0,5 milimolar EDTA al matraz de cultivo e incubar a 28 grados centígrados durante tres minutos.Para desprender las células del matraz, golpee suavemente el matraz para liberar las células. Y luego detener la digestión de tripsina agregando tres mililitros de medio de cultivo completo al matraz. Con una pipeta, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros y centrifuga a 100 G durante cinco minutos.Luego retire con cuidado el sobrenadante. Agregue un mililitro del medio completo para la línea celular respectiva en uso y resuspenda el pellet usando una micropipeta. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular y 10 microlitros de colorante azul de tripán a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad.Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta, y transferir 10 microlitros de esta mezcla a una cámara Neubauer. Contar las celdas en los cuatro cuadrados grandes o cuadrantes colocados en las esquinas de la cámara, considerando viables las celdas que no absorben el azul de tripano. Luego calcule el número de celdas viables usando la ecuación que se muestra en la pantalla.Multiplique este número de celda por dos para calcular el número de celda final en la suspensión de celdas. Después de calcular el número de celdas, ajuste la suspensión celular a la placa 200 microlitros de esta suspensión por pocillo de una placa ULA de fondo redondo de 96 pocillos con el número de celdas requeridas para cada línea celular. Preparar la suspensión con la concentración ajustada de células en un depósito medio y mezclarla con una micropipeta multicanal sin formar espuma ni burbujas.Agregue 200 microlitros de la suspensión celular ajustada a cada pocillo de la placa ULA de fondo redondo. utilizando una pipeta multicanal. La placa debe sellarse con Parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo de la placa de 96 pocillos.Incubar la placa en un agitador orbital a 70 RPM durante cinco días en una incubadora de 28 grados centígrados sin dióxido de carbono. Después de cinco días, observe los esferoides bajo un microscopio de luz invertida para evaluar los esferoides generados. Para medir su forma y tamaño, obtenga imágenes de los esferoides y use software para procesar y analizar las imágenes.Después de configurar el software para medir un área seleccionada en función de una escala conocida, seleccione el lado exterior del esferoide para determinar su área y circularidad. El área del esferoide se utiliza para determinar su tamaño calculando el diámetro, d, y el software proporciona la circularidad del esferoide mediante una fórmula que utiliza el área y el perímetro seleccionados. Un agregado de células ZFL se forma el primer día de agitación orbital.El agregado celular aumenta su circularidad en el tercer día, y alcanza una forma esferoidal adecuada en el día cinco. Aquí se muestra un esferoide ZFL de 16 días de edad en la placa ULA. La línea celular ZEM2S forma esferoides desde el primer día de agitación orbital.El esferoide mantiene su forma y aumenta de tamaño al tercer día, y su máxima circularidad se alcanza en el quinto día. Aquí se muestra un esferoide ZEM2S de 10 días de edad en una placa ULA. El tamaño medido de los esferoides de las líneas celulares ZFL y ZEM2S y el índice de circularidad medido de los esferoides ZFL y ZEM2S se muestran en esta figura.Esta imagen gráfica representa el patrón de crecimiento de los esferoides ZFL y ZEM2S. Aquí se muestra un esferoide ZFL y un esferoide ZEM2S formados después de cinco días de sacudida orbital a 100 RPM. El patrón de crecimiento y el índice de circularidad de los esferoides formados a velocidades de rotación de 70 y 100 RPM se presentan en esta figura.70 RPM es la velocidad más adecuada para formar esferoides ZFL y ZEM2S por este método. La tinción de las membranas celulares por Lectina Alexa Fluor 594 y núcleos por DAPI demuestra la integridad celular en el núcleo de los esferoides. La fluorescencia de la resorufina formada por una reducción de AlamarBlue demuestra células viables en el núcleo de ambos esferoides.Aquí se muestra el ensayo de viabilidad MTT en cultivo 3D y cultivo 2D de la línea celular ZEM2S y ZFL, demostrando que no hay diferencias significativas. Al intentar este procedimiento, asegúrese de sellar las placas para evitar cambiar el pH de los medios de cultivo y la evaporación en los pocillos. Los esferoides se pueden aplicar en una variedad de ensayos in vitro para evaluar los efectos tóxicos en el hígado de pescado o estudios de desarrollo utilizando la línea celular ZEM2S del embrión.Este protocolo puede ayudar a impulsar el desarrollo de pruebas in vitro con peces, contribuyendo al progreso de los estudios de ecotoxicidad sin animales.

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Research

Investigación

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Entorno

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Los esferoides son un tipo de modelo de cultivo celular en 3D que se utiliza para representar con mayor precisión el entorno de una célula en comparación con los modelos monocapa de cultivo celular en 2D. En el protocolo de ejemplo, veremos a los científicos generar esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal y aplicar imágenes de células vivas para rastrear el crecimiento de los esferoides.

Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

Somitogenesis es un proceso de desarrollo rítmico que espacialmente los patrones de los ejes corporales de los embriones de vertebrados. Anteriormente, hemos desarrollado líneas de pez cebra transgénico que utilizan los reporteros fluorescentes para observar los genes cíclicos que impulsan este proceso. En este sentido, la cultura dispersamos las células de estas líneas y la imagen de sus oscilaciones en el tiempo en vitro.

Generación de Dispersed presomitic mesodermo Cultivos Celulares for Imaging del pez cebra Segmentación del Reloj en células individuales

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Aquí se proporciona un método reproducible para examinar la neurogénesis adulta usando un ensayo de neurosphere derivado de todo el cerebro o ya sea del telencephalic, tectal o regiones del cerebelo del cerebro adulto de pez cebra. Además, se describe el procedimiento para manipular la expresión génica en neuroesferas de pez cebra.

Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Presentamos un protocolo eficiente y fácil de usar para la preparación de cultivos celulares primarios de células de embriones de pez cebra para transfección celular directo imágenes así como un protocolo para preparar células primarias del cerebro del pez cebra adulto.

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Aquí, presentamos el protocolo para el cultivo de tejidos 3-D del eje posterior del cuerpo del pez cebra, lo que permite el estudio en vivo de la segmentación de vertebrados. Este modelo de explant proporciona control sobre el alargamiento del eje, alteración de las fuentes de morfógenos y obtención de imágenes vivas a nivel de tejido de resolución subcelular.

Un cultivo de explantes de cola 3-D para estudiar la segmentación de vertebrados en el pez cebra

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Presentamos un protocolo para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad y su caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

Los organoides revolucionan el modelado personalizado de tejidos para el desarrollo de órganos, el descubrimiento de fármacos y la investigación de enfermedades. La ingeniería de organoides avanza en la creación de intrincados tejidos sintéticos. El objetivo es integrar la morfogénesis, la tecnología de ensamblaje y las biomatrices para avanzar en la ingeniería de tejidos. Este protocolo ayuda a modelar la organogénesis hepática y a establecer directrices para la construcción de tejidos...

Técnicas de cultivo in vitro para modelar la organogénesis del hígado, construir ensamblajes y diseñar tejidos sintéticos utilizando líneas celulares humanas

Aprende a generar esferoides 3D de líneas celulares de pez cebra (ZEM2S y ZFL) para estudios de toxicidad acuática. Este método simple y rápido mejora la evaluación de seguridad ambiental sin usar animales.

Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra

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