Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra
20 de enero de 2023
Aquí, presentamos un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides de dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal).
Este protocolo puede generar fácilmente esferoides de pez cebra, un modelo 3D in vitro con diferente aplicación potencial en pruebas de toxicidad de peces. Este es un método simple y rápido para generar esferoides individuales de líneas celulares de pez cebra muy similares en tamaño y forma. Si sigue todos los pasos descritos correctamente, uno no debería encontrar ningún problema.
Los esferoides del pez cebra pueden beneficiar enormemente el mecanismo, la exploración de los efectos de los productos químicos en los peces, lo que ayuda a mejorar la evaluación de la seguridad ambiental de productos como los cosméticos. Demostrando el procedimiento estará Irisdoris Rodrigues de Souza, doctora en genética de mi laboratorio. Para empezar, tome un matraz T75 de células de pez cebra en torno al 80% de confluencia.
Retirar el medio completo y lavar las células añadiendo 0,01 PBS molares al matraz de cultivo con una pipeta. Lavar el matraz de cultivo con PBS agitándolo suavemente y, a continuación, retirar el PBS. Añadir tres mililitros de tripsina 0,5 milimolar EDTA al matraz de cultivo e incubar a 28 grados centígrados durante tres minutos.
Para desprender las células del matraz, golpee suavemente el matraz para liberar las células. Y luego detener la digestión de tripsina agregando tres mililitros de medio de cultivo completo al matraz. Con una pipeta, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros y centrifuga a 100 G durante cinco minutos.
Luego retire con cuidado el sobrenadante. Agregue un mililitro del medio completo para la línea celular respectiva en uso y resuspenda el pellet usando una micropipeta. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular y 10 microlitros de colorante azul de tripán a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad.
Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta, y transferir 10 microlitros de esta mezcla a una cámara Neubauer. Contar las celdas en los cuatro cuadrados grandes o cuadrantes colocados en las esquinas de la cámara, considerando viables las celdas que no absorben el azul de tripano. Luego calcule el número de celdas viables usando la ecuación que se muestra en la pantalla.
Multiplique este número de celda por dos para calcular el número de celda final en la suspensión de celdas. Después de calcular el número de celdas, ajuste la suspensión celular a la placa 200 microlitros de esta suspensión por pocillo de una placa ULA de fondo redondo de 96 pocillos con el número de celdas requeridas para cada línea celular. Preparar la suspensión con la concentración ajustada de células en un depósito medio y mezclarla con una micropipeta multicanal sin formar espuma ni burbujas.
Agregue 200 microlitros de la suspensión celular ajustada a cada pocillo de la placa ULA de fondo redondo. utilizando una pipeta multicanal. La placa debe sellarse con Parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo de la placa de 96 pocillos.
Incubar la placa en un agitador orbital a 70 RPM durante cinco días en una incubadora de 28 grados centígrados sin dióxido de carbono. Después de cinco días, observe los esferoides bajo un microscopio de luz invertida para evaluar los esferoides generados. Para medir su forma y tamaño, obtenga imágenes de los esferoides y use software para procesar y analizar las imágenes.
Después de configurar el software para medir un área seleccionada en función de una escala conocida, seleccione el lado exterior del esferoide para determinar su área y circularidad. El área del esferoide se utiliza para determinar su tamaño calculando el diámetro, d, y el software proporciona la circularidad del esferoide mediante una fórmula que utiliza el área y el perímetro seleccionados. Un agregado de células ZFL se forma el primer día de agitación orbital.
El agregado celular aumenta su circularidad en el tercer día, y alcanza una forma esferoidal adecuada en el día cinco. Aquí se muestra un esferoide ZFL de 16 días de edad en la placa ULA. La línea celular ZEM2S forma esferoides desde el primer día de agitación orbital.
El esferoide mantiene su forma y aumenta de tamaño al tercer día, y su máxima circularidad se alcanza en el quinto día. Aquí se muestra un esferoide ZEM2S de 10 días de edad en una placa ULA. El tamaño medido de los esferoides de las líneas celulares ZFL y ZEM2S y el índice de circularidad medido de los esferoides ZFL y ZEM2S se muestran en esta figura.
Esta imagen gráfica representa el patrón de crecimiento de los esferoides ZFL y ZEM2S. Aquí se muestra un esferoide ZFL y un esferoide ZEM2S formados después de cinco días de sacudida orbital a 100 RPM. El patrón de crecimiento y el índice de circularidad de los esferoides formados a velocidades de rotación de 70 y 100 RPM se presentan en esta figura.
70 RPM es la velocidad más adecuada para formar esferoides ZFL y ZEM2S por este método. La tinción de las membranas celulares por Lectina Alexa Fluor 594 y núcleos por DAPI demuestra la integridad celular en el núcleo de los esferoides. La fluorescencia de la resorufina formada por una reducción de AlamarBlue demuestra células viables en el núcleo de ambos esferoides.
Aquí se muestra el ensayo de viabilidad MTT en cultivo 3D y cultivo 2D de la línea celular ZEM2S y ZFL, demostrando que no hay diferencias significativas. Al intentar este procedimiento, asegúrese de sellar las placas para evitar cambiar el pH de los medios de cultivo y la evaporación en los pocillos. Los esferoides se pueden aplicar en una variedad de ensayos in vitro para evaluar los efectos tóxicos en el hígado de pescado o estudios de desarrollo utilizando la línea celular ZEM2S del embrión.
Este protocolo puede ayudar a impulsar el desarrollo de pruebas in vitro con peces, contribuyendo al progreso de los estudios de ecotoxicidad sin animales.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo sencillo y eficiente para generar esferoides tridimensionales de pez cebra utilizando dos líneas celulares: ZEM2S y ZFL. El método está diseñado para facilitar su uso y ejecución rápida, lo que lo hace adecuado para diversas aplicaciones en pruebas de toxicidad en peces.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Toxicología
Antecedentes
- Los peces cebra se utilizan comúnmente en investigaciones biológicas debido a sus embriones transparentes y su desarrollo rápido.
- Los esferoides sirven como un modelo in vitro tridimensional que imita de cerca las condiciones in vivo.
- Comprender los efectos químicos en los peces es fundamental para las evaluaciones de seguridad ambiental.
- Este protocolo tiene como objetivo agilizar el proceso de formación de esferoides con fines de investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido y eficaz para crear esferoides de pez cebra.
- Facilitar la investigación sobre los efectos de los productos químicos en los peces.
- Mejorar las metodologías en las pruebas de toxicidad en peces.
Métodos Utilizados
- Uso de matraces T75 para el cultivo celular.
- Mantenimiento de las células a una confluencia aproximada del 80 %.
- Seguimiento de un protocolo paso a paso para la formación de esferoides.
- Demostación realizada por un experto en genética para garantizar claridad.
Resultados principales
- El protocolo genera con éxito esferoides uniformes a partir de líneas celulares de pez cebra.
- Los esferoides presentan tamaño y forma consistentes, adecuados para uso experimental.
- Aplicaciones potenciales en la evaluación de la toxicidad química en ambientes acuáticos.
- El proceso optimizado minimiza complicaciones durante la formación de los esferoides.
Conclusiones
- Este protocolo de cultivo tridimensional es eficaz para generar esferoides de pez cebra.
- Tiene potencial para mejorar las metodologías de pruebas de toxicidad en peces.
- Investigaciones futuras pueden aprovechar este modelo para evaluaciones de seguridad ambiental.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los cultivos de esferoides tridimensionales de pez cebra proporcionan una plataforma in vitro escalable y reproducible para la evaluación mecanicista de ecotoxicidad y seguridad de compuestos. Este método aborda las limitaciones de los cultivos en 2D al permitir una organización celular semejante al tejido y una longevidad funcional, lo que respalda la confianza predictiva en ensayos de cribado temprano. Su compatibilidad con alto rendimiento lo posiciona como un recurso valioso para la selección de carteras y el avance ajustado al riesgo en I+D ambiental y farmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación mecanicista de los efectos de compuestos en un contexto tridimensional relevante para el tejido.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al reproducir funciones celulares similares a las in vivo.
- Facilita la confianza predictiva en el acoplamiento al blanco y el análisis de rutas metabólicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona esferoides estandarizados y reproducibles adecuados para cribado de compuestos de alto rendimiento.
- Ofrece resultados cuantitativos como el tamaño del esferoide, la circularidad y la viabilidad para las lecturas del ensayo.
- Reduce la intervención manual al generar un solo esferoide uniforme por pocillo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos de biología del desarrollo y modelos relacionados con enfermedades para la toxicología traslacional.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la evaluación preclínica de seguridad en contextos acuáticos y ambientales.
- Apoya decisiones ajustadas al riesgo al proporcionar datos in vitro sólidos y escalables.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de esferoide tridimensional se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico, conectando estudios mecanicistas iniciales y cribado de alto rendimiento para la evaluación de compuestos ambientales y farmacéuticos.
- Biología del Descubrimiento: Avanza en la prueba de hipótesis y la aclaración de vías en un sistema fisiológicamente relevante.
- Selección: Asegura la preparación y reproducibilidad del ensayo para flujos de trabajo de evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de la morfología y viabilidad de esferoides para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Proporciona una plataforma para alinear hallazgos in vitro con puntos finales in vivo en toxicología.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo estandarizado y escalable, adaptable a múltiples clases de compuestos y equipos de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la evaluación de toxicidad.
- Valor operativo: Proporciona cultivos tridimensionales estandarizados, reproducibles y escalables para flujos de trabajo de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la eficiencia del capital al reducir los riesgos biológicos en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de compuestos con mayor relevancia biológica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular y manipulación de esferoides tridimensionales.
- Necesita acceso a placas de adherencia ultrabaja, agitadores orbitales y software de análisis de imágenes.
- Exige estandarización entre equipos para lograr reproducibilidad en estudios multisitio.
- Adaptable a diferentes líneas celulares de pez cebra y potencialmente a otras especies con optimización del protocolo.
- Las limitaciones incluyen la necesidad de sellar cuidadosamente las placas para prevenir la evaporación y cambios de pH.
