Name: Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales nasales primarias en interfaz aire-líquido para estudiar interacciones entre coronavirus y el huésped humano. Este método permite analizar cinética de replicación y respuestas inmunes innatas.

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Este estudio cuenta con las siguientes fuentes de financiamiento: Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01AI 169537 (S.R.W. y N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. y N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. y N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

El uso de muestras nasales fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania (protocolo # 800614) y la Junta de Revisión Institucional de VA de Filadelfia (protocolo # 00781).
1. Infección de cultivos nasales de ALI
NOTA: La adquisición de muestras clínicas, así como el crecimiento y la diferenciación de cultivos nasales de ALI, están fuera del alcance de este trabajo. Los métodos específicos para el cultivo de células epiteliales nasales primarias se pueden encontrar en trabajos publicados recientemente que utilizan estos cultivos 18,22,23. Los siguientes protocolos también se pueden aplicar a los cultivos de ALI epitelial nasal disponibles comercialmente si se desea. Los protocolos y volúmenes que se detallan a continuación son aplicables a los insertos transpocillos de placa de 24 pocillos (6,5 mm de diámetro, 0,33 cm2 de superficie de membrana). Si se utilizan cultivos de ALI cultivados en transpocillos más grandes (es decir, placas de 12 pocillos, 12 mm de diámetro, 1,12 cm2 de superficie), ajuste los volúmenes proporcionalmente para reflejar el tamaño del transpocillo.
<ol><li>Día antes de la infección:<ol><li>Lavar los cultivos de ALI 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) por vía apical (añadir ~200 μL de PBS calentado, colocar en la incubadora a 37 °C durante 5 min, aspirar PBS y repetir).</li>
		<li>Reemplace el medio basal (500 μL).</li>
		<li>Permita que los cultivos se equilibren a la temperatura a la que se llevarán a cabo las infecciones durante la noche (es decir, si infecta a 33 °C, coloque los cultivos en una incubadora a 33 °C después de lavar el PBS). NOTA: Se ha informado que los HCoV asociados con el resfriado común, como el HCoV-229E y el HCoV-NL63, se replican de manera más eficiente a 33 °C. Además, la temperatura del epitelio nasal in vivo es de 33 °C (esto difiere de la temperatura del pulmón, que es de 37 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluya el virus según sea necesario en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco sin suero para lograr la multiplicidad deseada de infección (MOI) en un volumen total de inóculo de 50 μL. NOTA: Por lo general, las infecciones se han llevado a cabo en MOI = 5 (MOI alto); sin embargo, las infecciones con MOI = 0,5 (MOI bajo) también se han utilizado para el SARS-CoV-2 y los HCoV asociados al resfriado común, y estos dan lugar a títulos virales máximos comparables, pero con cinética variable (cualquiera de los MOI es aceptable).</li>
	<li>Agregue el inóculo por vía apical y vuelva a colocar los cultivos en la incubadora durante 1 h.</li>
	<li>Balancee las placas suavemente cada 15 minutos durante la infección (sosteniendo la placa firmemente con ambas manos, muévala hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para asegurar una adsorción uniforme del inóculo viral).</li>
	<li>Después de 1 h de incubación, aspire el inóculo viral y lave cada cultivo infectado 3 veces con PBS para asegurar la eliminación del inóculo viral (para cada lavado, agregue 200 μL de PBS, incube durante 5 minutos y aspire o retire con una pipeta).</li>
	<li>Si lo desea, recoja el tercer lavado de PBS para confirmar la eliminación adecuada del virus de entrada.</li>
	<li>Reemplace el medio basal con medio fresco en las ILA infectadas cada 72 h durante la infección.</li>
</ol>2. Recolección de líquido de superficie apical (ASL) y titulación del virus excretado
<ol><li>En puntos de tiempo predeterminados después de la infección, agregue 200 μL de PBS a la cámara apical de cada pocillo trans infectado. NOTA: Los puntos de tiempo relevantes varían según el HCoV de interés y oscilan entre 24 h y 192 h después de la infección (consulte la sección de resultados representativos para obtener datos de replicación viral para varios HCoV).</li>
	<li>Pipetee PBS hacia arriba y hacia abajo 5 veces para garantizar la máxima recolección del virus excretado apicalmente y recoja todo el volumen en un tubo de microcentrífuga (esta es la muestra de ASL). NOTA: El ASL incluye partículas virales excretadas, además de moco y otros productos secretados apicalmente por cultivos de ALI.</li>
	<li>Cuantificar el virus infeccioso en ASL mediante un ensayo de placa viral estándar (diluir en serie muestras que contienen virus para cuantificar la concentración de partículas virales). NOTA: Los tipos de células y el período de incubación utilizados para el ensayo de placa dependerán del virus utilizado: SARS-CoV-2 (células VeroE6); MERS-CoV (células VeroCCL81); HCoV-NL63 (células LLC-MK2); HCoV-229E (células Huh7). Los detalles sobre cómo realizar ensayos de placa viral están más allá del alcance de este manuscrito, pero se han detallado previamente en una publicación del Journal of Visualized Experiments (JoVE)24.</li>
	<li>Si lo desea, recoja el medio basal en varios momentos después de la infección para confirmar la ausencia de virus liberado basalmente. Por lo general, los HCoV se liberan apicalmente de las células epiteliales nasales, pero lo confirman mediante un ensayo de placa de medio basal sin diluir.</li>
	<li>Almacene las muestras de ASL a -80 °C si la cuantificación mediante ensayo de placa no se realizará el día de la recolección.</li>
</ol>3. Cuantificación del virus intracelular
<ol><li>Después de recolectar la muestra de ASL, mueva cada pocillo transversal a una placa limpia de 24 pocillos precargada con 500 μL de DMEM que contenga un 2% de suero fetal bovino (FBS) basalmente. NOTA: El DMEM con 2% de FBS se utiliza para estabilizar el virus durante los ciclos de congelación y descongelación posteriores.</li>
	<li>Lave cada transpocillo 3 veces apicalmente con PBS para asegurar la eliminación completa del virus excretado apicalmente.</li>
	<li>Después de aspirar para eliminar el lavado final de PBS, agregue 100 μL de DMEM con 2% de FBS al compartimiento apical.</li>
	<li>Mueva la placa que contiene los transpocillos con medios apicales y basales a un congelador de -80 °C y complete tres ciclos consecutivos de congelación y descongelación para lisar las células.</li>
	<li>Después del ciclo final de congelación-descongelación, agrupe los medios apicales (100 μL) y basales (500 μL) en un tubo limpio.</li>
	<li>Centrifugar a 500 × g durante 10 min a 4 °C para granular cualquier residuo celular.</li>
	<li>Recoge el sobrenadante. Esta es la muestra de virus intracelular para la valoración mediante ensayo de placa estándar. NOTA: Durante el proceso de recolección se produce una dilución triple en relación con la recolección de ASL; Las muestras de ASL se recogen en 200 μL de PBS, mientras que las muestras de virus intracelulares se recogen en un volumen total de 600 μL.</li>
</ol>4. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)
NOTA: Para la medición de TEER, se debe utilizar PBS suplementado con calcio y magnesio (PBS + Ca 2+/Mg2+). Se utiliza un voltímetro/ohmímetro epitelial configurado para leer en ohmios (consulte la Tabla de materiales).
<ol><li>Limpie, equilibre y deje en blanco el instrumento EVOM de acuerdo con las instrucciones del fabricante; Use un transpocillo "vacío" sin células nasales agregadas para el blanqueo. Registre la medición de TEER en blanco. NOTA: Si se utilizan varios virus, el instrumento EVOM debe limpiarse rigurosamente entre condiciones para evitar la contaminación cruzada (los lavados con etanol al 70% seguido de agua desionizada son suficientes).</li>
	<li>Mueva cada pocillo infectado a una placa limpia y preetiquetada de 24 pocillos con 500 μl de PBS + Ca 2+/Mg2+ basalmente para lavar el medio basal residual de los pocillos trans.</li>
	<li>Añadir 200 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ al compartimento apical de cada pocillo trans.</li>
	<li>Agregue 1 mL de PBS + Ca 2+/Mg2+ a la cámara de medición Endohm-6.</li>
	<li>Mueva cada transpocillo a la cámara de medición Endohm-6 y vuelva a colocar la tapa de la cámara de modo que el electrodo apical descanse en los 200 μL de PBS en el compartimiento apical; el electrodo basal está integrado en la parte inferior de la cámara Endohm-6.</li>
	<li>Permita que la lectura de EVOM se estabilice y registre la medición de TEER sin procesar.</li>
	<li>Recoja la muestra de ASL como se ha descrito anteriormente después de realizar la medición de TEER si se desea el ajuste de la titulación (recoja los 200 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ que se añadieron para la medición de TEER). NOTA: La recolección de muestras de ASL puede inducir microdesgarros en la barrera epitelial que pueden confundir las lecturas de TEER, por lo que la ASL debe recolectarse después de la medición de TEER. Además, el medio basal no debe cambiarse inmediatamente antes de las lecturas de TEER, ya que esto también puede afectar los valores de TEER.</li>
	<li>Para convertir las lecturas brutas de TEER en mediciones finales en ohmios/cm2, reste el valor de TEER en blanco y multiplique este valor por el área de superficie de la membrana transpocillo usando la ecuación (1): TEER = [Lectura de TEER - valor TEER en blanco] × (área superficial de transwell) (1)</li>
	<li>En el caso de los HCoV, evalúe el TEER cada 24 h o 48 h después de la infección; la cinética de los cambios de TEER a menudo varía entre los virus y requiere la resolución de problemas en varios puntos de tiempo.</li>
	<li>Al medir la TEER, incluya siempre cultivos infectados simulados y evalúe en cada punto de tiempo (control negativo). NOTA: En el caso de los cultivos simulados, las mediciones de TEER deben permanecer estables o pueden aumentar ligeramente con respecto al valor basal después de completar la diferenciación de los cultivos. El área de superficie de los soportes de membrana variará según el tamaño y el fabricante de los transpozos; Los transpozos de 24 pocillos suelen tener una superficie de 0,33 cm2.</li>
</ol>5. Medición de la citotoxicidad durante la infección mediante ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH)
NOTA: En este trabajo, el contenido de LDH en muestras de ASL se cuantificó utilizando un kit de detección de citotoxicidad disponible comercialmente. La señal de LDH en el medio basal a menudo estaba por debajo del límite de detección y, a menudo, era menos reproducible que la LDH cuantificada en muestras de ASL de cultivos infectados con HCoV.
<ol><li>Prepare los controles adicionales necesarios para el ensayo de LDH.<ol><li>Control de fondo: use PBS (use PBS que contenga calcio y magnesio si las muestras de ASL se recolectaron de esta manera).</li>
		<li>Control positivo (valor techo): tratar las ALI por vía apical con Triton X-100. Recoja los pozos de control de Tritón (normalmente use tres cultivos ALI para esto en cada punto de tiempo).<ol><li>Añadir 200 μL de Triton X-100 al 2% en PBS directamente al compartimento apical del transpocillo.</li>
			<li>Incubar durante 10-15 minutos para permitir que las células se lisen por completo.</li>
			<li>Recoja todo el volumen como una muestra de techo Triton.</li>
		</ol></li>
		<li>Control negativo (baja liberación de LDH de control/inicial): recolectar ASL de cultivos de ALI infectados simuladamente derivados del mismo donante que los cultivos infectados.<ol><li>Recopile ASL simulado de control negativo siguiendo el procedimiento de recopilación de ASL anterior. NOTA: Se pueden utilizar los mismos transpocillos para este control negativo para todos los puntos de tiempo, mientras que para el control Tritón se necesitarán transpocillos nuevos para cada punto de tiempo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Para permitir la cuantificación del virus excretado además de las lecturas de LDH de cada muestra de ASL, cargue una placa negra de 96 pocillos de fondo plano ópticamente transparente de la siguiente manera:<ol><li>Diluir todas las muestras en PBS, utilizando 45 μL de muestra y 55 μL de PBS (100 μL de volumen total).</li>
		<li>Trate las muestras de control positivo Triton y de control de fondo simulado de la misma manera. NOTA: Esta dilución permite la carga por triplicado de cada muestra experimental (45 μL x 3) y suficiente volumen residual de ASL para el ajuste mediante ensayo de placa.</li>
		<li>Cargue la placa LDH por triplicado: techo Triton, control de fondo simulado, control PBS y muestras experimentales.</li>
		<li>Prepare la mezcla de reacción según lo indicado por el fabricante (solución de colorante + catalizador).<ol><li>Añadir 100 μL de mezcla de reacción a cada pocillo e incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min protegida de la luz.</li>
		</ol></li>
		<li>Después de 20 minutos, mida la absorbancia a 492 nm.</li>
		<li>Calcule el porcentaje de citotoxicidad en relación con el valor máximo de Tritón utilizando la ecuación (2). Citotoxicidad (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64868/64868eq01.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparación de cultivos nasales de ALI para imágenes de inmunofluorescencia (IF)
<ol><li>Mueva el transwell a una placa nueva de 24 pocillos y lave 3 veces por vía apical con PBS (recoja el primer lavado de PBS como ASL si se titula; luego, realice dos lavados adicionales de PBS para eliminar el exceso de virus excretados que podrían obstaculizar la calidad del FI)</li>
	<li>Después del lavado final de PBS, cubra el transpocillo apical y basalmente con PFA al 4%.</li>
	<li>Incubar durante 30 minutos para fijar en PFA al 4%, y luego retirar y lavar 3 veces con PBS.</li>
	<li>Extirpe el soporte transwell que contiene las células con una cuchilla de afeitar afilada o unas tijeras.</li>
	<li>Para aumentar el número de dianas de FI para cada transpocillo, corte cada membrana por la mitad y tiña cada mitad con diferentes combinaciones de anticuerpos.</li>
	<li>Permeabilizar con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 10 min.</li>
	<li>Bloquear con 10% de suero de burro normal y 1% de BSA en PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) durante 60 min a temperatura ambiente. NOTA: Proteja las muestras de la exposición a la luz a partir de este paso.</li>
	<li>Incubar en solución primaria de anticuerpos durante la noche a 4 °C. Diluir todos los anticuerpos 1:1.000 en tampón de bloqueo. NOTA: A continuación se enumeran los anticuerpos representativos para la tinción de la nucleocápside de HCoV, así como los marcadores de tipo de células epiteliales y las tinciones del citoesqueleto (consulte la Tabla de materiales para obtener información del fabricante y números de catálogo).<ol><li>Para la tinción del antígeno HCoV, utilice anticuerpos dirigidos a la nucleocápside del SARS-CoV-2, la nucleocápside del MERS-CoV y la nucleocápside HCoV-NL63.</li>
		<li>Para identificar los tipos de células epiteliales, utilice anticuerpos dirigidos al marcador de células caliciformes MUC5AC y al marcador de células ciliadas tipo IV β-tubulina.</li>
		<li>Para los marcadores citoesqueléticos, use anticuerpos dirigidos contra la faloidina (se une a la F-actina) y el marcador de adhesión de células epiteliales: EpCAM (CD326).</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar en solución secundaria de anticuerpos durante 60 min a temperatura ambiente; Utilice colorantes de anticuerpos secundarios diluidos 1:1.000 en tampón de bloqueo.</li>
	<li>Una vez completada la tinción, transfiera la membrana a un portaobjetos de vidrio con una espátula, oriente el transpocillo con el lado apical hacia el portaobjetos y agregue la solución de montaje. Deje reposar durante 15-30 minutos antes de aplicar el esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes.</li>
	<li>Adquisición de imágenes con un microscopio confocal (paso del eje Z: 0,5 μm; barrido secuencial)1,16,17. NOTA: Después de la fijación de los cultivos en PFA al 4% y el lavado con PBS, los cultivos fijos pueden almacenarse a 4 °C durante semanas o meses antes de la tinción y la preparación para la obtención de imágenes. Después de la tinción y el montaje de las membranas, las muestras pueden almacenarse a largo plazo (&gt;2 años) a 4 °C en la oscuridad.</li>
</ol>7. Recolección de proteína intracelular para inmunotransferencia occidental o ARN para análisis de RT-qPCR
<ol><li>Recolectar ASL como se describe anteriormente si cuantifica títulos virales (sección 2 del protocolo).</li>
	<li>Mueva el transpocillo a una placa limpia de 24 pocillos, ya que raspar la membrana puede provocar la rotura del inserto.</li>
	<li>Para el análisis de Western blot, recoja el lisado de proteínas totales en 125 μL de tampón RIPA (50 mM de Tris, pH 8, 150 mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 1% de NP40) suplementado con inhibidores de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa.</li>
	<li>Añadir 125 μL de tampón RIPA al compartimento apical e incubar durante 5-10 min.</li>
	<li>Raspe la membrana con una punta de pipeta P200 para eliminar las células adheridas restantes y recoja todo el volumen (raspe vigorosamente toda la superficie de la membrana y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para recolectar toda la muestra).</li>
	<li>Incubar muestras de lisado de proteínas en hielo durante 10 minutos y, a continuación, centrifugar a velocidad máxima (20.000 × g) durante 10 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Mezcle el sobrenadante con 4 tampones de muestra Laemmli con β-mercaptoetanol (agente reductor) de acuerdo con los protocolos del fabricante.</li>
	<li>Hervir las muestras de proteínas a 95 °C durante 5 min, y luego ejecutarlas utilizando los protocolos tradicionales de Western blot 1,16,17.</li>
	<li>Para la recolección de ARN total, use un kit de extracción de ARN disponible comercialmente. NOTA: El compartimento apical de los insertos transpocillos de 24 pocillos tiene un volumen máximo de ~200 μL; Por lo tanto, realizamos dos lavados secuenciales en cada cultivo para alcanzar el volumen total recomendado. Los detalles a continuación corresponden a la recolección recomendada de muestras de ARN en un volumen total de 350 μL.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de lisis al compartimento apical del transpocillo infectado.</li>
	<li>Deje reposar durante 5-10 minutos, raspe las células restantes de la membrana con la punta de una pipeta y recoja todo el volumen en un tubo de microcentrífuga etiquetado.</li>
	<li>Agregue 150 μL de tampón de lisis adicional al compartimiento apical del transpocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo antes de recolectar en el mismo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Extraiga el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
</ol>

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<li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749(2020).</li>
<li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333(2013).</li>
<li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753(2020).</li>
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<li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding%2C+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119(2022).</li>
</ol>

Susan Weiss forma parte de los Consejos Asesores Científicos de Ocugen. Noam A. Cohen es consultor de GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron y Oyster Point Pharmaceuticals y tiene una patente estadounidense, "Terapia y diagnóstico para infecciones respiratorias" (10.881.698 B2, WO20913112865), y un acuerdo de licencia con GeneOne Life Sciences.

Los métodos que se detallan aquí describen un sistema de cultivo epitelial primario en el que las células epiteliales nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido y se aplican al estudio de las interacciones HCoV-huésped. Una vez diferenciados, estos cultivos nasales de ALI recapitulan muchas características del epitelio nasal in vivo , incluida una población celular heterogénea con células ciliadas, caliciformes y basales representadas, así como una función mucociliar intacta con una ...

Hasta la fecha se han identificado siete coronavirus humanos (HCoV) que causan una serie de enfermedades respiratorias2. Los HCoV comunes o estacionales (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1) generalmente se asocian con patología del tracto respiratorio superior y causan aproximadamente entre el 10% y el 30% de los casos de resfriado común anualmente. Aunque este es el fenotipo clínico típico asociado con los HCoV comunes, estos virus pueden causar una enfermedad más significativa del tracto respiratorio inferior en poblaciones de riesgo, incluidos niños, adultos mayores e inmunodeprimidos 3,4. En los últimos 20 años han surgido tres HCoV patógenos que han causado importantes emergencias de salud pública, entre ellos el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV y el SARS-CoV-2. Los HCoV letales se asocian con una patología más grave de las vías respiratorias, lo que queda claramente ilustrado por la tasa de letalidad del >34% asociada a los casos de MERS-CoV (894 muertes en más de 2.500 casos desde su aparición en 2012)5,6. Es importante tener en cuenta que los HCoV letales también causan una serie de enfermedades de las vías respiratorias, desde infecciones asintomáticas hasta neumonía letal, como se ha visto con la actual pandemia de COVID-197.
Los HCoV, al igual que otros patógenos respiratorios, entran en el tracto respiratorio y establecen una infección productiva en el epitelio nasal8. Se cree que la diseminación a la vía aérea inferior está asociada con la aspiración desde la cavidad oral/nasal hasta el pulmón, donde los HCoV causan una patología más significativa del tracto respiratorio inferior 9,10,11. Por lo tanto, la nariz sirve como el portal inicial para la entrada viral y es la principal barrera para la infección con su robusta maquinaria de eliminación mucociliar y mecanismos inmunológicos innatos únicos destinados a prevenir una mayor propagación viral a las vías respiratorias inferiores12,13. Por ejemplo, se ha reportado que las células epiteliales nasales expresan niveles basales más altos que el promedio de interferones antivirales y genes estimulados por interferón, lo que indica que las células nasales pueden estar preparadas para respuestas tempranas a virus respiratorios14,15,16.
Anteriormente hemos utilizado células epiteliales nasales primarias derivadas de pacientes cultivadas en una interfaz aire-líquido (ALI) para modelar las interacciones entre el HCoV y el huésped en la nariz, donde comienzan las infecciones por HCoV. Los cultivos nasales de ALI son permisivos tanto para los HCoV patógenos (SARS-CoV-2 y MERS-CoV) como para los comunes (HCoV-NL63 y HCoV-229E) y ofrecen varias ventajas sobre las líneas celulares epiteliales tradicionales de las vías respiratorias, como A549 (una línea celular de adenocarcinoma de pulmón)16,17. Después de la diferenciación, los cultivos nasales de ALI contienen una población celular heterogénea y exhiben muchas de las funciones esperadas del epitelio nasal in vivo, como la maquinaria de depuración mucociliar18. Las células nasales también ofrecen ventajas sobre los sistemas de cultivo de la vía aérea inferior (como las células epiteliales bronquiales humanas, HBEC), ya que la adquisición de células epiteliales nasales a través del cepillado citológico es significativamente menos invasiva en comparación con el uso de técnicas como la broncoscopia para la obtención de HBEC 19,20,21.
En este artículo se describen los métodos para utilizar este sistema de cultivo nasal de ALI para caracterizar las interacciones HCoV-huésped en el epitelio nasal. Hemos aplicado estos métodos en trabajos publicados recientemente para comparar SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E 1,16,17. Aunque estos métodos y resultados representativos enfatizan el estudio de los HCoV en este modelo de células nasales, el sistema es altamente adaptable a otros HCoV, así como a otros patógenos respiratorios. Además, estos métodos pueden aplicarse de forma más amplia a otros sistemas de cultivo de ALI para investigar la replicación viral y el tropismo celular, así como la citotoxicidad y la inducción inmunitaria innata tras la infección.

<table><tbody><tr><td>Alexa Anticuerpos secundarios contra fluor (488, 594, 647)</td><td>Invitrogen</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini inhibidor de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td> Kit de detección de citotoxicidad Roche 11644793001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + calcio + magnesio</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de medición Endohm-6G</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de adhesión de células epiteliales (EpCAM; CD326)</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>Medidor epitelial de voltios/ohmios (TEER) (EVOM)</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS (suero fetal bovino)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW software para imágenes</td><td>Olympus</td><td>versión 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 (coronavirus humano, NL63)</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de nucleocápside HCoV-NL63</td><td>Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de Hoescht</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra Laemmli (4x)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>células LLC-MK2</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>Para valorar HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV (Coronavirus humano, Coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), EMC/2012)</td><td>Recursos del BEI&nbsp;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de nucleocápside MERS-CoV</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo MUC5AC</td><td>Sigma-Aldrich AMAB91539</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus Microscopio confocal Fluoview</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de faloidina-iFluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack (inhibidores de la fosfatasa)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>Cualquier lector de placas o lector ELISA es suficiente; debe ser capaz de leer la absorbancia a 492 nm</td></tr> de <tr><td>tampón RIPA (50 mM Tris pH 8; 150 mM de NaCl; 0,5 % de desoxicolato; 0,1 % SDS; 1 % NP40)</td><td>Thermo Fisher</td><td>89990</td><td>Puede prepararse internamente o comprar</td></tr> el <tr><td>kit RNeasy Plus</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td>SARS-CoV-2</tr><tr><td>(Coronavirus relacionado con el SARS 2, aislado USA-WA1/2020)</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-52281</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de nucleocápside contra el SARS-CoV-2</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific BP151100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo IV &beta;- anticuerpo de tubulina</td><td>Abcam</td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>Células VeroCCL81</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>Para valorar las células MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>Para valorar el SARS-CoV-2</td></tr></tbody></table>

infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

En los últimos 20 años han surgido tres coronavirus humanos altamente patógenos —el SARS-CoV (2002), el MERS-CoV (2012) y el SARS-CoV-2 (2019)— que han causado importantes crisis de salud pública. Cuatro HCoV adicionales causan una parte significativa de los casos de resfriado común cada año (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1), lo que destaca la importancia de estudiar estos virus en sistemas fisiológicamente relevantes. Los HCoV ingresan al tracto respiratorio y establecen la infección en el epitelio nasal, el sitio principal que encuentran todos los patógenos respiratorios. Utilizamos un sistema de cultivo epitelial nasal primario en el que las muestras nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido (ALI) para estudiar las interacciones huésped-patógeno en este importante sitio centinela. Estos cultivos recapitulan muchas características de la vía aérea in vivo , incluidos los tipos de células presentes, la función ciliar y la producción de moco. Describimos métodos para caracterizar la replicación viral, el tropismo de la célula huésped, la citotoxicidad inducida por virus y la inducción inmune innata en cultivos nasales de ALI después de la infección por HCoV, utilizando como ejemplo trabajos recientes que comparan HCoV letales y estacionales1. Una mayor comprensión de las interacciones huésped-patógeno en la nariz tiene el potencial de proporcionar nuevos objetivos para la terapéutica antiviral contra los HCoV y otros virus respiratorios que probablemente surjan en el futuro.

Las figuras representativas están parcialmente adaptadas de los datos que se pueden encontrar en el manuscrito Otter et al.1. Los cultivos nasales de ALI derivados de cuatro o seis donantes se infectaron con uno de los cuatro HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E) de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente, y los títulos virales promedio de diseminación apical para cada virus se representan en la Figura 1A. Si bien estos cuatro HCoV se replican ...

El epitelio nasal es el principal sitio de barrera que encuentran todos los patógenos respiratorios. Aquí, describimos métodos para utilizar células epiteliales nasales primarias cultivadas como cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped en un sistema fisiológicamente relevante.

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

Los protocolos descritos aquí abordan cuestiones clave como la cinética de replicación, el tropismo de la célula huésped, la inducción inmunitaria innata y la inducción de citotoxicidad en el epitelio nasal durante las infecciones con coronavirus humanos. Este protocolo permite el estudio de las interacciones del huésped del coronavirus humano en un microambiente organoide que recapitula de cerca las características del epitelio nasal in vivo, incluida su población celular heterogénea y sus funciones mucociliares. Esta técnica se puede aplicar a otros sistemas de cultivo de ALI, como los derivados de la vía aérea inferior.Además, el sistema se puede utilizar para imitar estados clínicos de enfermedades como las vías respiratorias asmáticas o con fibrosis quística. Crecimiento y diferenciación de la interfase nasal aire-líquido, o cultivos ALI, en transpocillos que tienen una cámara basal y otra apical. Expandir las células nasales humanas disociadas en condiciones sumergidas, después de lo cual, retire el medio de la cámara apical para permitir la diferenciación de los cultivos en una interfaz aire-líquido.El día antes de la infección, lave los cultivos de ALI por vía apical con so

infection-primary-nasal-epithelial-cells-grown-at-an-air-liquid

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este método permite la caracterización de bacterias extendido co-cultivo con EpiAirways, principal tejido humano respiratorias epiteliales cultivadas en la interfase aire-líquido, un biológicamente...

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Se describe el aislamiento rápido de células primarias de murino de tipo II alveolares epiteliales (AECII) por citometría de flujo negativo de selección. Estos AECII mostrar una alta viabilidad y pureza, y son adecuados para una amplia gama de estudios funcionales y molecular respecto a su función en condiciones respiratorias tales como enfermedades autoinmunes o infecciosas.

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Fuente: Otter, C. J., et al. Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfase aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra el crecimiento del coronavirus en células epiteliales nasales humanas cultivadas en una interfaz aire-líquido, imitando la infección y la replicación viral en la cavidad nasal humana.

Crecimiento viral en células epiteliales nasales humanas cultivadas en interfaz aire-líquido

Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

Células epiteliales nasales, obtenidas mediante biopsia raspadura superficial de voluntarios humanos, se expanden y se transfieren a insertos de cultivo de tejidos. Al llegar a la confluencia, las células se cultivan en la interfase aire-líquido, produciendo cultivos de células ciliadas y no ciliadas. Cultivos de células epiteliales nasales diferenciados proporcionan modelos experimentales viables para el estudio de la mucosa respiratoria.

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

El virus respiratorio sincitial humano (HRSV) puede causar bronquiolitis grave en lactantes pequeños. Parte de la patogenia de la enfermedad grave por HRSV es causada por la respuesta inmunitaria del huésped. La estimulación de las células inmunitarias humanas primarias con HRSV proporciona un sistema modelo rápido y reproducible para estudiar la activación de las vías inflamatorias y la infección.

Un modelo in vitro para estudiar las respuestas inmunitarias de las células mononucleares de sangre periférica humana a la infección por el virus respiratorio sincitial humano

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Este protocolo detalla una investigación de las interacciones tempranas entre las células epiteliales nasales infectadas viralmente y la activación de células innatas. Los subconjuntos individuales de células inmunes se pueden distinguir en función de su activación en respuesta a infecciones virales. Luego se pueden investigar más a fondo para determinar sus efectos sobre las respuestas antivirales tempranas.

Modelo de cocultivo sin contacto para el estudio de la activación de células inmunes innatas durante la infección por virus respiratorios

Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.

Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Este artículo describe la generación de un modelo complejo de barrera multicelular de la vía aérea compuesto por epitelio pulmonar derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), mesénquima, células endoteliales y macrófagos en un cultivo de interfaz aire-líquido.

Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar

Aprende a cultivar células epiteliales nasales primarias en interfaz aire-líquido para estudiar interacciones entre coronavirus y el huésped humano. Este método permite analizar cinética de replicación y respuestas inmunes innatas.

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano (Video) | JoVE Journal

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

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