Name: Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprende a generar y cultivar organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado. Este método permite estudiar terapias novedosas y biomarcadores predictivos en modelos que recapitulan la heterogeneidad tumoral.

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Estamos agradecidos por la orientación de Ron Bose, MD, PhD, y la ayuda de Barbara Blachut, MD, en el establecimiento de este protocolo. También nos gustaría reconocer a la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de St. Louis y la División de Oncología Ginecológica, al Programa de Becarios del Decano de la Universidad de Washington y al Programa de Desarrollo de Científicos Reproductivos por su apoyo a este proyecto.

Todas las muestras de tejido humano recolectadas para la investigación se obtuvieron de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los protocolos descritos a continuación se realizaron en un entorno estéril de cultivo de tejidos humanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de sujetos humanos. Las pacientes elegibles tenían que tener un diagnóstico o presunto diagnóstico de cáncer de ovario, estar dispuestas y ser capaces de firmar el consentimiento informado y tener al menos 18 años de edad. El tejido tumoral (tumor primario maligno o sitios metastásicos), la ascitis y el líquido pleural se obtuvieron de pacientes que dieron su consentimiento en el momento del procedimiento. Estas muestras fueron transportadas inmediatamente al laboratorio y procesadas para la generación de organoides utilizando los métodos descritos a continuación.
1. Preparación de los medios
<ol><li>Preparación completa de los medios organoides<ol><li>Preparar R-spondin 1/medio acondicionado Noggin siguiendo un informe previamente publicado7. NOTA: El medio condicionado R-spondin-1/Noggin es una alternativa más asequible a las proteínas recombinantes disponibles comercialmente. Las células HEK293T que secretan de manera estable R-spondin-1 y Noggin a través de la transducción mediada por lentivirus fueron un generoso regalo de Ron Bose, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en St. Louis, y Anil Rustgi, New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. El medio acondicionado comercial podría usarse como sustituto (ver Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Para hacer el medio organoide completo, combine 10% de R-spondina 1/medio condicionado con Noggin, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nicotinamida, 1.25 mmol/L N-acetilcisteína, 1 μmol/L de prostaglandina E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 e inhibidor de ROCK de 10 μM (ver Tabla de materiales). NOTA: El medio puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Este medio fue adaptado de Hill et al.11. Las concentraciones e ingredientes del medio son los mismos, con la adición de un inhibidor de ROCK.</li>
	<li>Prepare el medio base organoide combinando 500 ml de una formulación avanzada de DMEM/F12 con 1% de penicilina-estreptomicina, 1x dipéptido, L-alanil-L-glutamina y 1x HEPES (10 mM) (ver Tabla de materiales).</li>
</ol>2. Recolección de organoides de ascitis y líquido pleural
NOTA: La ascitis y el líquido pleural deben procesarse lo antes posible para obtener el mejor rendimiento de los organoides. Descongele el tampón de reacción de BME, DNasa I y DNasa I previamente acitado (consulte la Tabla de materiales) colocándolo en hielo hasta que el contenido se licúe.
<ol><li>Obtenga ascitis y líquido pleural de los pacientes que dan su consentimiento en el momento de las cirugías o procedimientos de atención estándar, y transporte a temperatura ambiente en un contenedor de viaje al laboratorio. NOTA: Toda ascitis o procesamiento de líquido pleural debe realizarse en un ambiente estéril.</li>
	<li>Transfiera 50 ml de ascitis o líquido pleural a 50 ml de tubos cónicos (el número de tubos depende del volumen de ascitis obtenido). Centrifugadora a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, utilice una pipeta de vidrio Pasteur para aspirar cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Continuar añadiendo 50 ml de ascitis o líquido pleural al pellet previamente centrifugado, y centrifugar de nuevo a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. Repita este paso hasta que se hayan procesado todas las ascitis o el líquido pleural.</li>
	<li>Preparar una solución de DNasa I de 100 μg/ml combinando 1.000 μL de agua libre de nucleasa, 100 μL de tampón de reacción de la DNasa I y 10 μL de DNasa I. NOTA: El tratamiento con DNasa I aplicado es suficiente para hacer una suspensión unicelular independientemente de la presencia de agregados celulares en algunas muestras de pacientes12.</li>
	<li>Resuspender cada pellet celular en 1 mL de solución de DNasa I de 100 μg/mL. Agregue suavemente la solución de DNasa I gota a gota y deje que el tubo se incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Agregue un mínimo de 1 ml de solución de DNasa I. Si 1 ml no es suficiente para perturbar el pellet, agregue 1 ml adicional.</li>
	<li>Después de la incubación, añadir 25 ml de medio base organoide (paso 1.3) a las células, e invertir suavemente para mezclar. A continuación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Resuspenda los gránulos de células recién formados en 5 ml precalentados de 1x tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el vórtice a 458 x g y vortice las soluciones en cada tubo cónico. Una vez que las soluciones sean homogéneas, utilice una pipeta serológica para combinar el contenido de todos los tubos cónicos en un solo tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Incubar el tubo cónico que contiene la solución vortexed a temperatura ambiente durante 5 min. Una vez finalizada la incubación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: Examine el pellet. Un pellet rosa/rojo indica la presencia de glóbulos rojos, lo que requeriría que el paso de amortiguación de lisis de glóbulos rojos se repita hasta que el pellet ya no sea rojo.</li>
	<li>Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. A continuación, lavar el pellet con 10 ml de PBS, vaporizar la solución a 458 x g y centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Si se forma un pellet de células grandes, aspirar el PBS con una pipeta de vidrio Pasteur y añadir 1 ml de medio base organoide (paso 1.3) encima del pellet. Vortex la solución a 458 x g y transferir 300-400 μL a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar el tubo de microcentrífuga a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: La porción del pellet celular no colocada en el tubo de microcentrífuga se puede congelar para su uso futuro (500 μL de células a 1 ml de DMSO al 10% en FBS). El pellet de celda congelada se puede almacenar durante semanas a -80 ° C y durante años si se coloca en nitrógeno líquido13.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el medio base organoide (paso 1.3) con una pipeta de vidrio Pasteur y resuspender en BME (ver Tabla de materiales) utilizando puntas frías. NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda utilizar un 25% de medio base organoide (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.</li>
	<li>Placa 40 μL alícuotas de la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos. Placa de hasta cinco alícuotas por pocillo (Figura 1).</li>
	<li>Colocar inmediatamente la placa en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos para permitir que el BME se solidifique. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) en cada pocillo.</li>
</ol><img alt="Experimento de laboratorio con pipeta en estación de trabajo de PCR para la preparación del análisis de ADN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Recubrimiento de organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Imagen representativa del revestimiento organoide. Las alícuotas de la mezcla de organoides se chapan cuidadosamente, asegurando que no se formen burbujas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Recolección de organoides de tejidos
NOTA: El tejido debe procesarse lo antes posible para obtener el mejor rendimiento de los organoides.
<ol><li>Recolectar y transportar el tumor en hielo en un recipiente de viaje que contenga PBS.</li>
	<li>Colocar la muestra en una placa de cultivo de tejido de 10 cm (Figura 2). Usando un bisturí desechable, pica el tejido. A continuación, utilizando el extremo opaco de una jeringa desechable, aplaste el tejido hasta que se haya creado una mezcla homogénea.</li>
	<li>Usando fórceps, coloque la mezcla de tejido homogéneo en un tubo de disociación. Por cada 1-2 ml de tejido homogeneizado, añadir 7-8 ml de solución de colagenasa tipo II de 1 mg/ml (ver Tabla de materiales) en medio base organoide (paso 1.3) y 1 ml de solución de DNasa I. Vortex la solución a 458 x g. NOTA: La cantidad de tejido determinará la cantidad de solución de colagenasa y la cantidad de tubos necesarios.</li>
	<li>Use la máquina de disociación (consulte la Tabla de materiales) para licuar el tejido mientras está en la solución de colagenasa. Ejecute el programa 37C_h_TDK3 (1 h) hasta que sea una suspensión de una sola celda. NOTA: Será necesario volver a ejecutar el programa si la mezcla resultante no es homogénea (es decir, si todavía hay trozos de tejido presentes en la mezcla). Si el tejido se digiere pero la solución es viscosa, diluir con medio base organoide (paso 1.3).</li>
	<li>Transfiera la mezcla homogeneizada a un nuevo tubo cónico de 50 ml y añada 20-40 ml de medio base organoide (paso 1.3). Luego, filtre la solución a través de un filtro celular de 100 μm en un tubo cónico de 50 ml recién etiquetado.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla filtrada a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Preparar una solución de DNasa I de 100 μg/ml combinando 1.000 μL de agua libre de nucleasa, 100 μL de tampón de reacción de la DNasa I y 10 μL de DNasa I. NOTA: El tratamiento con DNasa I aplicado es suficiente para hacer una suspensión unicelular independientemente de la presencia de agregados celulares en algunas muestras de pacientes12.</li>
	<li>Resuspender las células en 1 ml de solución de DNasa I de 100 ug/ml. Agregue suavemente la solución de DNasa I gota a gota y deje que el tubo se incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la incubación, añadir 25 ml de medio base organoide (paso 1.3) a las células, e invertir suavemente para mezclar. A continuación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular recién formado en 5 ml de tampón de lisis 1x RBC precalentado. Vortex las soluciones en cada tubo cónico a 458 x g.</li>
	<li>Incubar el tubo cónico que contiene el pellet celular resuspendido en el tampón de lisis RBC durante 5 min. Una vez finalizada la incubación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: Examine el pellet. Un pellet rosa / rojo indica la presencia de glóbulos rojos, lo que requeriría que el paso de amortiguación de lisis de glóbulos rojos se repita hasta que el pellet aparezca blanco.</li>
	<li>Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. A continuación, lavar el pellet con 10 ml de PBS, vaporizar la solución a 458 x g y centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Si se forma un pellet de células grandes, aspirar el PBS con una pipeta de vidrio Pasteur y añadir 1 ml de medio base organoide (paso 1.3) encima del pellet. Vortex la solución a 458 x g y transferir 300-400 μL a un tubo de microcentrífuga. Centrifugadora a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: La porción del pellet celular no colocada en el tubo de microcentrífuga se puede congelar para su uso futuro (500 μL de células a 1 ml de DMSO al 10% en FBS) (paso 5.1). El pellet de celda congelada se puede almacenar durante semanas a -80 ° C y durante años si se coloca en nitrógeno líquido13.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el medio base organoide con una pipeta de vidrio Pasteur y resuspender en BME con puntas frías. NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda añadir un 25% de medio base organoide (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.</li>
	<li>Colocar la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos en alícuotas de 40 μL. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo.</li>
	<li>Coloque inmediatamente la placa del pozo en la incubadora durante 20 minutos. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) en cada pocillo.</li>
</ol><img alt="Proceso de cultivo celular con medios de crecimiento, contenedores y muestras de tejido en laboratorio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Tejido tumoral antes de la disección. Imagen representativa del tejido tumoral obtenido para la generación de organoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Paso de organoides
NOTA: Si la muestra es confluente, cada pocillo organoide se puede pasar semanalmente a dos nuevos pocillos.
<ol><li>Utilizando una pipeta de 1 ml, añadir 1 ml de medio base organoide (paso 1.3) a cada pocillo y pipetear el medio hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las lengüetas del organoide para disociarlo. Recoger todo el medio que contiene los pellets resuspendidos en un tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico de 15 ml que contiene la mezcla a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Agregue 1 ml de enzima recombinante libre de origen animal (consulte la Tabla de materiales) a la bolita celular, haga un vórtice de la solución a 458 x g y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Dejar que el tubo se incube durante 15 minutos en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Después de la incubación, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Resuspender el pellet en BME. NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda añadir un 25% de medios base organoides (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.</li>
	<li>Colocar la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos en alícuotas de 40 μL. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo. Una vez que todas las alícuotas hayan sido plateadas, coloque inmediatamente la placa del pozo en la incubadora durante 20 minutos. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) en cada pocillo.</li>
</ol>5. Congelación y descongelación de organoides
<ol><li>Congelación de organoides<ol><li>Comience con los pasos 4.1-4.4.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 0.5-1 ml de medio de congelación de cultivo celular de recuperación (ver Tabla de materiales) y transferir 1 ml a cada criovial.</li>
		<li>Luego, coloque los crioviales en un recipiente lleno de isopropanol a -80 °C durante un máximo de 2 semanas antes de transferirlos a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo13.</li>
	</ol></li>
	<li>Descongelación de organoides<ol><li>Retirar las muestras del depósito de nitrógeno líquido y descongelar al baño maría a 37 °C.</li>
		<li>Una vez descongelado, transferir a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
		<li>Resuspender el pellet en BME. NOTA: La cantidad de BME se basa en el tamaño del pellet. Se recomienda añadir un 25% de medios base organoides (paso 1.3) con células resuspendidas al 75% de BME.</li>
		<li>Colocar la solución celular resuspendida en una placa de 6 pocillos en alícuotas de 40 μL. Colocar hasta cinco alícuotas por pozo.</li>
		<li>Coloque inmediatamente la placa en la incubadora durante 20 minutos. Después de la incubación, añadir suavemente 2 ml de medio organoide completo (paso 1.2) a los pocillos.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Incrustación y generación de portaobjetos fijados en parafina (FFPE) para evaluar la composición organoide
<ol><li>Después de cultivar organoides durante al menos 10 días para asegurar un tamaño adecuado, retire el medio organoide completo de los pocillos y agregue 1 ml de fijador de paraformaldehído al 2% (PFA). Incubar a temperatura ambiente durante 5-10 min.</li>
	<li>Después de la incubación, lavar las alícuotas de organoides cultivados 3 veces durante 5 min cada vez con 1 ml de PBS.</li>
	<li>Retire el PBS de cada pocillo y agregue 1 ml de agar caliente al 2% en H2O desionizado a cada pocillo. Al agregar el agar, levante las alícuotas organoides cultivadas de la placa con una espátula. NOTA: Es importante no dejar que el agar se endurezca antes de levantar las alícuotas organoides cultivadas.<ol><li>Permita que el agar se solidifique en el pozo a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando una espátula pequeña, libere el agar solidificado del pozo y guárdelo en un casete hasta 48 h (consulte la Tabla de materiales) a 4 ° C en etanol al 70% hasta el procesamiento14.</li>
	<li>Incrustar las muestras en parafina 15, cortar los portaobjetos a un espesor de 5 μm y teñir los portaobjetos con tinción de hematoxilina y eosina (H&amp;E, consulte la Tabla de materiales) utilizando un protocolo estándar15.</li>
</ol>

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<li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El cáncer de ovario es extremadamente mortal debido a su etapa avanzada en el momento del diagnóstico, así como al desarrollo común de resistencia a la quimioterapia. Se han logrado muchos avances en la investigación del cáncer de ovario mediante la utilización de líneas celulares cancerosas y modelos PDX; Sin embargo, existe una necesidad evidente de un modelo in vitro más representativo y asequible. Las PDO han demostrado representar con precisión la heterogeneidad tumoral, el microambiente tumoral y las carac...

En 2021, aproximadamente 21,410 mujeres en los Estados Unidos fueron diagnosticadas recientemente con cáncer epitelial de ovario, y 12,940 mujeres murieron de esta enfermedad1. Aunque se han logrado avances suficientes en cirugía y quimioterapia, más de 70% de los pacientes con enfermedad avanzada desarrollan resistencia quimioterapéutica y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico 2,3. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para tratar esta enfermedad mortal y modelos representativos y confiables para la investigación preclínica.
Las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) creados a partir de tumores ováricos primarios son los principales instrumentos utilizados en la investigación del cáncer de ovario. Una ventaja importante de las líneas celulares de cáncer es su rápida expansión. Sin embargo, su cultivo continuo da como resultado alteraciones fenotípicas y genotípicas que hacen que las líneas celulares cancerosas se desvíen de la muestra original del tumor primario de cáncer. Debido a las diferencias existentes entre la línea celular del cáncer y el tumor primario, los ensayos farmacológicos que tienen efectos positivos en las líneas celulares no tienen los mismos efectos en los ensayos clínicos2. Para superar estas limitaciones, se utilizan modelos PDX. Estos modelos se crean mediante la implantación de tejido fresco de cáncer de ovario en ratones inmunodeficientes. Como son modelos in vivo , se parecen con mayor precisión a las características biológicas humanas y, a su vez, son más predictivos de los resultados de los medicamentos. Sin embargo, estos modelos también tienen limitaciones significativas, incluyendo el costo, el tiempo y los recursos necesarios para generarlos4.
Las PDO ofrecen un modelo alternativo para la investigación preclínica que supera las limitaciones tanto de las líneas celulares cancerosas como de los modelos PDX. Las PDO recapitulan el tumor y el microambiente tumoral de un paciente y, así, proporcionan un modelo intratable in vitro ideal para la investigación preclínica 2,3,5. Estos modelos 3D tienen capacidades de autoorganización que modelan el tumor primario, que es una característica que sus contrapartes de línea celular bidimensional (2D) no poseen. Además, se ha demostrado que estos modelos representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevos procesos terapéuticos y biológicos. En resumen, ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo similares a las líneas celulares, pero también abarcan el microambiente y las interacciones célula-célula inherentes a los modelos de ratón 4,6.
El presente protocolo describe la creación de PDOs a partir de tumores derivados de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Los cultivos PDO pueden expandirse durante múltiples generaciones y usarse para probar la sensibilidad a la terapia farmacológica y los biomarcadores predictivos. Este método representa una técnica que podría utilizarse para personalizar los tratamientos en función de las respuestas terapéuticas de las DOP.

<table><tbody><tr><td>1% HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1% Penicilina-estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos Eppendorf&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>14125</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plato de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>Serológica</tr><tr><td>100 &micro; m Filtro de celdas</td><td>MidSci</td><td>100ICS Tubos de</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Cryovial</td><td>Simport Scientific</td><td>T301-2</td><td></td></tr><tr><td>2% Paraformaldehído Fijador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C baño de agua &nbsp;</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>3dGRO R-Spondin-1 Suplemento de medios acondicionados</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCM104</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R31541GA</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Lamda Biotech</td><td>C121</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Tipo 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-010-02 extracto de</td><td>membrana basal</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de reacción de DNasa I</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Disociador con Calentadores</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-427</td><td>Utilizamos el protocolo de los fabricantes.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>dipéptido, L-alanil-L-glutamina</td></tr><tr><td>Hematoxilina y Eosina Kit de tinción</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1470670</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina Histoplast</td><td>Microcentrífuga</td> de <td>22900700</td><td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Contenedor de congelación</td><td>Fisher Scientific</td><td>07202363S</td> N-acetilcisteína <td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta con puntas&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta con puntas&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur 9"</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Controller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>R& D Systems</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recuperación de Cultivo Celular Medio de Congelación</td><td>Invitrogen</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de Lisis de Glóbulos Rojos</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>T75 Frasco</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casete</td><td></td><td></td><td></td>de inclusión de tejidos</tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>enzima recombinante libre de origen animal</td></tr><tr><td>Colágenosa tipo II Life</td><td>Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Los organoides son modelos tumorales dinámicos 3D que se pueden cultivar con éxito a partir de tejido tumoral ovárico derivado del paciente, ascitis o líquido pleural y ayudan en el descubrimiento de nuevas terapias y biomarcadores predictivos para el cáncer de ovario. Estos modelos recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Además, se ha demostrado que coinciden con el tumor primario morfológicamente, citológicamente, inmunohistoquímicamente y genéticamente. Por lo tanto, los organoides facilitan la investigación sobre las células tumorales y el microambiente tumoral y son superiores a las líneas celulares. El presente protocolo describe distintos métodos para generar organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a partir de tumores de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Las muestras de pacientes se separan en suspensiones celulares mediante digestión mecánica y enzimática. Luego, las células se colocan utilizando un extracto de membrana basal (BME) y se apoyan con medios de crecimiento optimizados que contienen suplementos específicos para el cultivo de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC). Después de formar organoides iniciales, los PDO pueden sostener el cultivo a largo plazo, incluido el paso por expansión para experimentos posteriores.

Para generar DOP, las muestras se digirieron mecánica y enzimáticamente en suspensiones unicelulares. Las células se resuspendieron en BME y se complementaron con medios específicamente diseñados (Figura 3). Los organoides se establecen típicamente en un marco de tiempo de 10 días, después de lo cual demuestran organoides discretos en cultivo (Figura 4).
<img alt="Diagrama de proceso tumor-or...

Los organoides derivados del paciente (PDO) son un cultivo tridimensional (3D) que puede imitar el entorno tumoral in vitro. En el cáncer de ovario seroso de alto grado, las PDO representan un modelo para estudiar nuevos biomarcadores y terapias.

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Los modelos de organoides impulsados por pacientes representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevas terapias y procesos biológicos complejos en el cáncer de ovario. Al recapitular la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones in vitro de célula a célula, estos modelos superan las limitaciones de las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados del paciente. Los organoides derivados del paciente ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo e imitan la fisiología tumoral.Como resultado, son modelos ideales para el estudio de nuevas terapias y biomarcadores predictivos. Comience la recolección de los organoides colocando las muestras de tumor en un plato de cultivo de tejido de 10 centímetros y picando el tejido para crear una mezcla homogénea usando un bisturí desechable. Coloque la mezcla de tejido homogéneo en un tubo de disociación con fórceps.Por cada uno o dos mililitros de tejido homogeneizado, agregue de siete a ocho mililitros de un miligramo por mililitro de solución de colagenasa tipo dos en medio base organoide y un mililitro de solución de DNa

generation-culturing-high-grade-serous-ovarian-cancer-patient-derived

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Presentamos un protocolo que se puede utilizar para realizar pruebas terapéuticas de fármacos con organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes.

Modelos de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario para pruebas preclínicas de medicamentos

Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.

Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Este protocolo ofrece un marco sistemático para el establecimiento de organoides de cáncer de ovario de diferentes estadios de la enfermedad y aborda los desafíos de la variabilidad específica del paciente para aumentar el rendimiento y permitir una expansión robusta a largo plazo para aplicaciones posteriores. Incluye pasos detallados para el procesamiento de tejidos, la siembra, el ajuste de los requisitos de medios y la tinción de inmunofluorescencia.

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

Este protocolo describe el establecimiento de organoides tisulares tridimensionales (3D) a partir de células primarias del epitelio de superficie ovárica humana (hOSE). El protocolo incluye el aislamiento de hOSE a partir de ovarios recién recolectados, la expansión celular de la hOSE, los procedimientos de criopreservación-descongelación y la derivación de organoides. Se incluyen la inmunofluorescencia, el análisis cuantitativo y la demostración de su utilidad como plataforma de cribado.

Organoides del epitelio de la superficie del ovario humano como plataforma para estudiar la regeneración de tejidos

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Describimos métodos para aislar células somáticas ováricas de ratón a partir de una fracción del ovario enriquecida con estroma y para generar organoides somáticos ováricos de ratón utilizando un enfoque sin andamiaje.

Investigación del microambiente ovárico: métodos para aislamiento, cultivo 2D y cultivo organoide de células somáticas ováricas de ratón

Para permitir la detección altamente sensible de lo cáncer colorrectal humano difundiendo células (CRC) colonizando los tejidos, aquí mostramos un protocolo para la transducción eficiente de partículas lentivirales proteína fluorescente verde (GFP) en células de organoides derivados de PDX CRC antes de su inyección en ratones receptores, con observación en el microscopio estéreo-fluorescencia.

Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) recapitulan más robustamente las características moleculares y biológicas del melanoma y son más predictivos de la respuesta terapéutica en comparación con los ensayos tradicionales basados en el cultivo de tejido plástico. Aquí describimos nuestro protocolo operativo estándar para el establecimiento de nuevos modelos PDX y la caracterización/experimentación de los modelos PDX existentes.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma

Aprende a generar y cultivar organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado. Este método permite estudiar terapias novedosas y biomarcadores predictivos en modelos que recapitulan la heterogeneidad tumoral.

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

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