Name: Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a monitorizar cambios morfológicos en células endoteliales de vena umbilical humana durante infecciones virales mediante análisis celular en tiempo real basado en impedancia. Este método no invasivo permite detectar efectos transitorios como desprendimiento celular y fugas vasculares.

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Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019) y la financiación en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

1. Preparación celular
<ol><li>Preparación de HUVECs<ol><li>Cultivar 7,5 x 105 células HUVEC/ml en un matraz de cultivo celular de 75cm2 (recubierto con 20 μg/ml de colágeno tipo 1) que contenga 12 ml de medio de células endoteliales (MEC) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS), un suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS) al 0,01 % que contenga factores de crecimiento, hormonas y proteínas necesarias para el cultivo de HUVEC, y 0,01% de penicilina-estreptomicina (P/S). Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 (Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuración del experimento RTCA
<ol><li>Ejecución de verificación de resistencias en RTCA<ol><li>Haga doble clic en el icono del software RTCA en el escritorio para iniciar la aplicación. Aparecerá una ventana de inicio de sesión, escriba el nombre de usuario y la contraseña para iniciar sesión.</li>
		<li>Coloque una placa de resistencia RTCA de 96 pocillos con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.</li>
		<li>En la pestaña Notas de experiencia del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo (placa de control de calidad).</li>
		<li>En la pestaña Diseño en la pestaña Celda del software RTCA, resalte todos los pozos y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos (atenuados).</li>
		<li>En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Step_1. Introduzca Barridos: 10 e Intervalo: 30 s. Haga clic en Aplicar. Haga clic en Iniciar/Continuar en la esquina superior izquierda del software para iniciar la ejecución de verificación. NOTA: Asegúrese de que la conexión de los pozos a la estación RTCA sea correcta observando "Placa escaneada. Conexiones OK" en la parte inferior de la página.</li>
	</ol></li>
	<li>Ejecución de verificación de resistencias para el análisis de datos<ol><li>En la pestaña Índice de celda , compruebe los datos al finalizar la ejecución. Todos los valores de IC deben ser inferiores a 0,063.</li>
		<li>En la parte inferior de la pestaña Índice de celda , compruebe los datos de escaneo sin procesar. Los datos de escaneo sin procesar deben mostrar patrones de valores repetidos de 40,0 ± 2,0 (filas A y H), 67,5 ± 2,5 (filas B y G), 93,6 ± 2,9 (filas C y F) y 117,6 ± 3,2 (filas D y E).</li>
		<li>Para detener la ejecución de la verificación, haga clic en Placa > Placa de liberación. La placa de resistencia RTCA de 96 pocillos ya está lista para ser retirada de la estación RTCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtención de lectura de antecedentes en RTCA<ol><li>Lave la placa de microelectrodo de oro especializada recubierta de colágeno tipo 1 (recubierta con 20 μg/ml de colágeno tipo 1) con 60 μl/pocillo de solución salina equilibrada de Hank (HBSS; con bicarbonato de sodio, sin cloruro de calcio ni sulfato de magnesio) 2 veces.</li>
		<li>Deseche el HBSS restante y agregue 50 μL/pocillo de ECM. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada que contiene ECM con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.</li>
		<li>En la pestaña Exp Notes del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo (formato de 96 pocillos).</li>
		<li>En la pestaña Diseño en la pestaña Celda del software RTCA, resalte los pozos que se utilizarán y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos (atenuados).</li>
		<li>En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Step_1 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software para obtener una lectura de fondo. NOTA: Asegúrese de que la conexión de los pocillos sea correcta observando "Placa escaneada. Conexiones OK" en la parte inferior de la página.</li>
		<li>Una vez que se obtiene la lectura de fondo, la placa de microelectrodo de oro especializada ahora está lista para la siembra celular y lista para ser retirada de la estación RTCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de HUVEC en la placa especializada de microelectrodos de oro<ol><li>Siembre los HUVEC en la placa de microelectrodos de oro especializada con 50 μL/pocillo de medio acondicionado, 1 x 104 células/pocillo (medio acondicionado: ECM suplementado con 10% de FBS, 0,01% de ECGS y 0,01% de P/S). Vuelva a colocar la placa en la estación RTCA con el pocillo A1 hacia adentro para la incubación nocturna en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2. NOTA: Se realizó un recuento celular en la suspensión celular con un factor de dilución de dos utilizando un hemocitómetro.</li>
		<li>En la pestaña Programación , haga clic en Agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_2 y cambie los Barridos: 601 e Intervalo: 2 min. Haga clic en Aplicar. Haga clic en Step_2 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software.</li>
		<li>Después de 20 h de incubación y cuando los valores de IC en la pestaña Gráfico de pocillos muestran una meseta, la placa está lista para la infección. En la pestaña Programación del software RTCA, haga clic en Abortar paso.</li>
		<li>La placa de microelectrodo de oro especializada ahora está lista para ser retirada de la estación RTCA para los pasos posteriores.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Infección viral en HUVECs
<ol><li>Dilución de virus<ol><li>El cultivo de la madre ZIKV se mantiene a -80 °C. Para este estudio, se debe retirar el stock de virus guardado en los viales criogénicos y diluir el stock de ZIKV con MEC sin suero en tubos de centrífuga de 1,5 ml para lograr una multiplicidad de infecciones (MOI) de 0,1 y 1. NOTA: El stock de ZIKV se preparó previamente realizando la propagación en células Vero y cosechando el sobrenadante34 del ZIKV.</li>
	</ol></li>
	<li>Infección de la monocapa celular<ol><li>Retire y deseche el medio acondicionado (ECM suplementado con 10% de FBS, 0.01% de ECG y 0.01% de P/S) de cada pocillo. Enjuague cada pocillo con 60 μL de HBSS 2x. Inserte el HBSS con la ayuda del costado del pozo; No dispare la monocapa de la célula.</li>
		<li>Trabajando de la dilución más alta a la más baja, agregue 40 μL de cada muestra de virus diluida en ECM sin suero en el pocillo. Triplicar el pocillo para cada dilución y mantener seis pocillos sin infección (control negativo y trombina control positivo). No dispare a la monocapa de la célula; En su lugar, agregue el virus diluido con la ayuda del costado del pocillo. Utilice una punta de pipeta nueva para cada inserción. NOTA: Se eligió la trombina como control positivo, ya que puede aumentar rápidamente la permeabilidad endotelial de los HUVEC.</li>
		<li>Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2 para permitir la adsorción del virus. Agite la placa 5 veces cada 15 minutos para permitir la adsorción del virus en toda la monocapa celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Adición del medio de cultivo celular superpuesto<ol><li>Después de 1 h de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta.</li>
		<li>Lavar las células infectadas con 60 μL de HBSS 2x. Cubra el pocillo con ECM suplementado con un 2% de FBS. Para los pocillos de control positivo, diluir la trombina a 20 U/ml con MEC suplementada con FBS al 2% y recubrir los pocillos con medio de MEC que contenga trombina. No dispare a la monocapa de la célula; En su lugar, agregue medios superpuestos con la ayuda del lado del pozo.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocación de la placa de microelectrodo de oro especializada infectada de nuevo en la estación RTCA<ol><li>En la pestaña Programación , haga clic en Agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_3 y cambie los Barridos: 3.601 y el Intervalo: 2 min. Haga clic en Aplicar.</li>
		<li>Haga clic en Aceptar en la ventana emergente que aparece. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada infectada con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivo celular.</li>
		<li>Haga clic en Step_3 y haga clic en Inicio/Continuar en la esquina superior izquierda del software.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de datos y exportación de datos
<ol><li>Adición de información experimental de cada pozo<ol><li>En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Celda (Figura 2A). Para ingresar la información de la celda de destino y determinar el tipo de pocillo para cada pozo, resalte el pocillo y escriba el nombre, el número y el color de la celda de destino en la parte inferior del software. Haga clic en Aplicar (Figura 2B).</li>
		<li>Para seleccionar y determinar el tipo de pozo para cada pozo en la pestaña Celda , resalte el pozo, seleccione el tipo de pozo (muestra, control positivo o control negativo) y haga clic en Establecer.</li>
		<li>En la pestaña Diseño , haga clic en la pestaña Tratamiento (Figura 2C). Para ingresar la información del tratamiento, resalte el pocillo y escriba el nombre del tratamiento, la concentración del tratamiento, la unidad y el color. Haga clic en Aplicar (Figura 2D).</li>
		<li>Para seleccionar y determinar el tipo de pocillo para cada pocillo en la pestaña Tratamiento , resalte el pozo, seleccione el tipo de pocillo (muestra, control positivo o control negativo) y haga clic en Establecer. NOTA: Para cada selección, se pueden resaltar varios pozos al mismo tiempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalización del valor de IC<ol><li>Haga clic con el botón derecho a la derecha de la pestaña Análisis de datos y seleccione Índice de celda normalizado en el cuadro desplegable Eje Y (Figura 3A). En la sección Eje X en la parte inferior, seleccione el tiempo normalizado como el último punto de tiempo medido donde se retiró la placa de microelectrodo de oro especializada para la infección (Figura 3B). NOTA: El proceso de normalización llevado a cabo por el software elimina la mayor parte de la variabilidad debida a las diferencias en la siembra y adhesión de los pozos, siempre y cuando el punto de normalización elegido sea anterior a la adición del virus y/o al tratamiento. Por lo tanto, el punto de tiempo óptimo de normalización debe ser el último punto de tiempo antes de la adición del virus y/o del tratamiento. El punto de tiempo para normalizar se puede comprobar en la pestaña Programación en Step_2. El tiempo total indicado es el punto de tiempo para normalizar (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Representación gráfica de los datos obtenidos mediante el software RTCA<ol><li>En la pestaña Análisis de datos , seleccione los pozos que se agregarán al gráfico resaltando los pozos y haciendo clic en << Agregar. El índice de celda normalizado con respecto al gráfico de tiempo ya está listo para copiarse y exportarse. Asegúrese de marcar la casilla de verificación Promedio .</li>
	</ol></li>
	<li>Exportación de datos con el software RTCA<ol><li>En la esquina superior izquierda del software RTCA, haga clic en Placa > Exportar información del experimento.... Marque la casilla para seleccionar los datos que se van a exportar. Haga clic en Aceptar. NOTA: Los datos sin procesar (valores de CI sin procesar) se pueden exportar cuando la opción Índice de celda > Todo está marcada.</li>
		<li>Seleccione la carpeta para guardar el archivo de exportación. Haga clic en GUARDAR. Aparecerá una ventana emergente que indica la exportación de la información experimental. Una vez finalizada la exportación, aparecerá otra ventana que indica que la información del experimento exportado está lista para ser vista.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

La infección viral citocida en células permisivas suele asociarse a cambios sustanciales en la morfología celular y la biosíntesis36. Los cambios morfológicos celulares inducidos por el virus, como el encogimiento celular, el agrandamiento celular y/o la formación de sincitios, también se conocen como efectos citopáticos (CPE), característicos de ciertas infecciones virales37. En los CE, el CPE se describió como la destrucción de las células y la ruptura de las uniones estr...

Las células endoteliales (CE) recubren la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos. Están conectados por uniones adherentes y estrechas, creando una barrera semipermeable entre la sangre o la linfa y los tejidos circundantes 1,2. Las uniones endoteliales intactas célula-célula son fundamentales para regular el transporte de macromoléculas, solutos y fluidos, cruciales para las actividades fisiológicas de los tejidos y órganos correspondientes3. La barrera endotelial es dinámica y modulada por estímulos específicos4. La alteración o pérdida de la función de la barrera endotelial es un sello distintivo de la fisiopatología de la enfermedad en la inflamación aguda y crónica en la patogénesis de muchas enfermedades 5,6,7, incluida la infección viral 8,9,10,11. En el caso de los flavivirus, se encontró que la proteína no estructural NS1 puede alterar la permeabilidad endotelial, por ejemplo, a través de la interrupción de la capa endotelial similar al glicocálix como resultado del aumento de la expresión y activación de catepsina L, sialidasas y endoglicosidasa heparinasa9. En el estado de enfermedad, la integridad de la monocapa endotelial se ve afectada y las uniones célula-célula se interrumpen, lo que puede conducir a lesiones y disfunciones endoteliales12 y, finalmente, a manifestaciones patológicas generalizadas en múltiples sistemas de órganos13,14. La infección viral de las CE da lugar a cambios en las vías de señalización celular y en el perfil de expresión génica celular, lo que puede afectar a las funciones de barrera de líquidos, causar alteraciones de las CE e inducir fugas vasculares10,15. Se ha descubierto que la infección por el virus del Zika (ZIKV) en las CE altera la integridad de la unión, lo que provoca cambios en la permeabilidad vascular y conduce a una disfunción de la barrera endotelial, lo que resulta en fugas vasculares10,15. Los estudios han demostrado que el ZIKV está relacionado con defectos congénitos graves; Sin embargo, no se sabe mucho sobre el mecanismo exacto por el cual esto ocurre16,17. Por lo tanto, comprender los cambios en la barrera endotelial durante una infección es fundamental para comprender el mecanismo de la enfermedad.
En la actualidad, las CE se utilizan como un importante sistema experimental modelo vascular in vitro para diversos procesos fisiológicos y patológicos 18,19,20,21. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se han utilizado ampliamente como un sistema celular primario no inmortalizado para estudiar el endotelio vascular y la biología vascular in vitro 22,23,24,25. Los HUVEC se aislaron por primera vez para cultivo in vitro a principios de la década de 1970 de la vena umbilical del cordón umbilical humano26. Los HUVEC tienen una morfología similar a la de un adoquín que se hace proliferar fácilmente en el laboratorio. Debido al esfuerzo cortante después de mantenerse durante largos períodos en estado confluente, se observa un alargamiento de la forma de la célula. Los HUVEC pueden caracterizarse por la presencia de cuerpos de Weibel y Palade (WPB), vesículas pinocíticas, pequeñas cantidades de fibrillas ubicadas cerca del núcleo, mitocondrias con formas tubulares que rara vez muestran ramificaciones, un núcleo elipsoide con un patrón granular fino de cromatina condensada y de uno a tres nucléolos presentes en cada núcleo27. Aunque los HUVEC muestran numerosas características morfológicas, la identificación de los HUVEC no puede lograrse únicamente mediante un examen óptico. Los ensayos, como la tinción por inmunofluorescencia de la cadherina endotelial vascular (EV), se utilizan comúnmente para la monitorización de la integridad vascular en los HUVEC 28,29,30,31.
Este estudio describe el protocolo de análisis celular en tiempo real (RTCA) de la infección de HUVECs. El sistema RTCA utiliza placas especializadas recubiertas de oro que contienen microelectrodos que proporcionan una superficie conductora para la unión de la celda. Cuando las células se adhieren a la superficie del microelectrodo, se forma una barrera que impide el flujo de electrones a través de los microelectrodos. La medición de la impedancia generada por los microelectrodos se puede utilizar para obtener información sobre algunos procesos celulares, incluidas las uniones celulares, la proliferación y la migración32. El ensayo reportado es un ensayo celular basado en impedancia que, junto con un analizador celular en tiempo real, proporciona una medición continua de la proliferación de células vivas, los cambios morfológicos (como el encogimiento celular) y la calidad de la unión celular de una manera no invasiva y sin etiquetas. En este estudio, el analizador celular en tiempo real se utiliza para monitorizar la integridad endotelial y los cambios morfológicos de los HUVEC durante la infección por ZIKV. Brevemente, el instrumento mide el flujo de electrones transmitido en placas especializadas de microtitulación recubiertas de microelectrodos de oro en presencia de un medio de cultivo (solución conductora de electricidad). La adherencia celular o los cambios en el número y la morfología de las células perturban el flujo de electrones y causan variaciones de impedancia que pueden ser capturadas por el instrumento (Figura suplementaria 1). La diferencia entre el crecimiento, la proliferación y la adherencia de HUVEC antes y después de la infección por ZIKV se registra en tiempo real mediante una señal de impedancia eléctrica y luego se traduce en el valor del índice celular (IC). El valor de IC de la preinfección se utiliza como referencia para la normalización del valor de IC. Los cambios en los valores de IC reflejan cambios morfológicos celulares o pérdida de adherencia celular tras la infección33. Los resultados del estudio muestran que el protocolo RTCA permite la detección de efectos transitorios o cambios morfológicos celulares durante la infección viral en comparación con un ensayo de punto final, como la tinción por inmunofluorescencia de VE-cadherina. El método RTCA podría ser útil para analizar los cambios en la integridad vascular de HUVEC tras la infección por otros virus.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Nest</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; Incubadora C con 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 matraz de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica, Clase II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo 1</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Medio de células endoteliales (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232368001</tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer células</td> endoteliales de vena umbilical humana mejoradas <td></td></tr><tr><td>(HUVECs)</td><td>Sciencell</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520 Portátil</td><td>Dell&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta multicanal (10 - 100 y micro; L)</td><td>Micropipeta multicanal Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>(30 - 300 y micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo reservador</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>RTCA placa de resistencia 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232350001</tr><tr><td>RTCA Software Pro (versión 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>5454433001</tr><tr><td>Pipetas monocanal (10 - 100 y micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>pipetas monocanal (100 - 1000 y micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas monocanal (20 - 200 y micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Analizador de células en tiempo real SP (Modelo: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

Las células endoteliales recubren la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos, creando una barrera semipermeable que regula el intercambio de líquidos y solutos entre la sangre o la linfa y sus tejidos circundantes. La capacidad de un virus para cruzar la barrera endotelial es un mecanismo importante que facilita la diseminación del virus en el cuerpo humano. Se ha informado que muchos virus alteran la permeabilidad endotelial y/o causan la ruptura de la barrera de las células endoteliales durante la infección, lo que puede causar fugas vasculares. El estudio actual describe un protocolo de análisis celular en tiempo real (RTCA, por sus siglas en inglés), que utiliza un analizador celular comercial en tiempo real para monitorear la integridad endotelial y los cambios en la permeabilidad durante la infección por el virus del Zika (ZIKV, por sus siglas en inglés) de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, por sus siglas en inglés). Las señales de impedancia registradas antes y después de la infección por ZIKV se tradujeron a valores de índice celular (IC) y se analizaron. El protocolo RTCA permite la detección de efectos transitorios en forma de cambios morfológicos celulares durante una infección viral. Este ensayo también podría ser útil para estudiar los cambios en la integridad vascular de los HUVEC en otras configuraciones experimentales.

Antes de la infección por ZIKV, el IC registrado para la monocapa de HUVEC cultivada en una placa de microtitulación especializada recubierta de microelectrodos de oro estaba por encima de 8, lo que sugiere fuertes propiedades de adherencia. Las placas o pocillos con un índice de IC inferior a 8 deben desecharse. A continuación, los HUVEC se infectaron con ZIKV a un MOI de 0,1 y 1, y se registró la impedancia celular durante 7 días. El valor de IC de los HUVEC infectados con ZIKV P6-740 a un MOI de 0,1 (línea azul claro)...

El presente estudio describe un protocolo para monitorizar los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) durante la infección viral utilizando un sistema de análisis celular en tiempo real (RTCA).

Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

Este protocolo permitió la detección continua del efecto transitorio en forma de algunos cambios morfológicos durante una infección viral, como el desprendimiento y la flotación de células adherentes. Este protocolo permitió un enfoque no invasivo y no intensivo en mano de obra para la monitorización continua de los cambios morfológicos celulares y la captura de efectos transitorios, como la fuga vascular, que podrían pasar desapercibidos en el ensayo de punto final. Este protocolo se puede utilizar para analizar los cambios en la integridad vascular de otras líneas celulares en diferentes configuraciones experimentales si las células son células adherentes.Después de preparar los HUVEC, inicie la aplicación de software RTCA haciendo doble clic en el icono en el escritorio. Escriba el nombre de usuario y la contraseña en la ventana de inicio de sesión. Coloque una placa de resistencia RTCA de 96 pocillos con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.A continuación, vaya a la pestaña de notas del experimento del software RTCA y escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo. En la pestaña de diseño debajo de la pestaña de celda del software RTCA, resalte todos los pozos y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos. A continuación, abra la pestaña de programación del software RTCA.Haga clic en Step_1 y establezca los barridos en 10 y el intervalo en 30 segundos. A continuación, haga clic en iniciar continuar en la esquina superior izquierda del software para comenzar la ejecución de la verificación. Después de la ejecución, abra la pestaña de índice de celda para verificar los datos.Todos los valores del índice de celda deben ser inferiores a 0,063. A continuación, compruebe los datos de escaneo sin procesar en la parte inferior de la pestaña de índice de celda para ver si hay patrones de valores repetidos como se describe en el manuscrito. Para finalizar la ejecución de verificación, haga clic en la placa y seleccione la placa de liberación.Retire la placa de resistencia RTCA de 96 pocillos de la estación RTCA. Para obtener una lectura de fondo en RTCA, lave la placa de microelectrodo de oro especializado recubierta de colágeno tipo uno dos veces con 60 microlitros por pocillo de HBSS. Deseche el HBSS restante y agregue 50 mililitros por pocillo de matriz extracelular.A continuación, coloque la placa en la estación RTCA situada en la incubadora de cultivos celulares con el pocillo A1 hacia dentro. En la pestaña de notas de experiencia del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo. Vaya a la pestaña de celda del software RTCA y seleccione la pestaña de diseño.Resalte los pozos que se utilizarán y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos. Ahora vaya a la pestaña de programación del software RTCA. Haga clic en Step_1 y haga clic en Iniciar o Continuar en la esquina superior izquierda para obtener una lectura de fondo.La placa ya está lista para la siembra celular y la eliminación de la estación RTCA. Después, siembre de 10 a la cuarta celda por pocillo de HUVEC en la placa de microelectrodos de oro con 50 microlitros por pocillo de medio acondicionado. Vuelva a colocar la placa en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares, con el pocillo A1 hacia adentro.Luego, en la pestaña de programación del software, haga clic en agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_2. Cambie los barridos a 601, el intervalo a dos minutos y haga clic en aplicar.Haga clic en Step_2 y haga clic en Inicio o Continuar en la esquina superior izquierda del software. Después de 20 horas de incubación, cuando los valores del índice celular en la pestaña del gráfico de pocillos muestran una meseta, la placa está lista para la infección. En la pestaña de programación del software RTCA, haga clic en abortar paso.La placa ya está lista para ser retirada de la estación RTCA. Para infectar los HUVEC, saque las existencias del virus del Zika del congelador a menos 80 grados Celsius. Diluir el stock del virus del Zika con matriz extracelular libre de suero en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros para lograr multiplicidades de infección de 0,1 y uno.A continuación, deseche el medio acondicionado de cada pocillo y enjuague cada pocillo con 60 microlitros de HBSS mientras usa el costado del pocillo. Agregue 40 microlitros de muestra de virus diluida en el pocillo, comenzando de la dilución más alta a la más baja, usando el costado del pocillo. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono para permitir la absorción del virus.Agite la placa cinco veces cada 15 minutos para permitir la absorción del virus en toda la monocapa celular. Después de una hora de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta. Lave las células infectadas dos veces con 60 mililitros de HBSS.Recubrimiento de los pocillos con matriz extracelular suplementada con 2% de FBS. Para los pocillos de control positivo, diluir la trombina en 20 unidades por mililitro con matriz extracelular suplementada con 2% de FBS, y recubrir los pocillos con medio de matriz extracelular que contenga trombina, utilizando el lado del pocillo. Ahora haga clic en la pestaña de programación y agregue un paso en la esquina superior izquierda.Vaya a Step_3 y modifique los barridos a 3, 601 y el intervalo a dos minutos. Haga clic en Aplicar y, a continuación, haga clic en Aceptar en la ventana emergente. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada infectada con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivo.Finalmente, haga clic en Step_3 y haga clic en iniciar continuar en la esquina superior izquierda del software. El valor del índice celular de los HUVEC infectados con el virus del Zika P6-740 con una multiplicidad de infección de 0.1 comenzó a disminuir a las 15 horas después de la infección, en comparación con el control negativo de la infección. Los HUVEC infectados con una dosis más alta del virus del Zika P6-740 en una multiplicidad de infección de uno mostraron una caída en el índice celular a las 11 horas después de la infección.A las 24 horas después de la infección, hubo una caída del 5% y del 7% en el valor del índice celular normalizado cuando las células endoteliales se infectaron con una multiplicidad de infección de 0,1 y uno respectivamente. Se registró una reducción del 50% en el valor del índice celular normalizado a las 96 horas después de la infección y a las 66,75 horas después de la infección en el momento de la infección con una multiplicidad de infección de 0,1 y uno respectivamente. El valor del índice celular normalizado alcanzó su punto más bajo a las 107 horas después de la infección, con una reducción del 51% y del 60% tras la infección a una multiplicidad de infección de 0,1 y uno respectivamente.Se encontró que el valor del índice celular normalizado tenía un aumento del 4% y del 13% desde las 107 horas posteriores a la infección hasta el final del experimento a las 168 horas posteriores a la infección. Antes de cada experimento RTCA, es esencial realizar una verificación de la resistencia utilizando la placa RTCA de 96 pocillos para garantizar que cada biosensor funcione bien para producir valores fiables del índice celular.

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Investigación

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Biology

Biología

Este protocolo de vídeo ilustra el aislamiento y cultivo de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) de cordón umbilical humano. Una vez aisladas estas células se pueden utilizar en los ensayos de la angiogénesis in vitro, como el gel de fibrina Optimizado ensayo de bolas también se demuestra por el laboratorio de Hughes.

El aislamiento de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC)

A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

En este video, demostramos el proceso de monitoreo en tiempo real de eventos celulares, incluida la proliferación de células adherentes, a través de un ensayo de impedancia celular. Aquí, las celdas adherentes actúan como aislantes, restringiendo el flujo de corriente entre los electrodos y aumentando la impedancia.

Análisis basado en impedancia celular para la monitorización de procesos celulares en tiempo real

Este video describe una técnica basada en impedancia celular para estudiar la cinética de supervivencia de los virus que inducen efectos citopáticos. El método mide la impedancia eléctrica de las células adherentes infectadas por el virus pretratadas con solución salina.

Ensayo cinético de supervivencia basado en impedancia celular para evaluar la supervivencia del virus

Este protocolo revisa eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección, un método para registrar y analizar el espectro de impedancia de las células adherentes para la cuantificación de la unión celular, la proliferación, motilidad, y las respuestas celulares a estímulos farmacológicos y tóxicos. La detección de la permeabilidad endotelial y la evaluación de los contactos célula-célula y célula-sustrato que se obtienen.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron hasta la confluencia dentro de un dispositivo de red microfluídica. Se ilustró la unión de las células endoteliales y las distribuciones de F-actina, y se cuantificaron en tiempo real los cambios en la concentración de calcio intracelular y la producción de óxido nítrico en respuesta al trifosfato de adenosina (ATP) a nivel de células individuales.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Se detallan los protocolos para el cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), la transfección transitoria de marcadores de crecimiento de microtúbulos marcados con fluorescencia, la obtención de imágenes de células vivas y el análisis automatizado de la dinámica de crecimiento de microtúbulos en interfase.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

Aquí se informa un protocolo para la cuantificación de partículas virales infecciosas utilizando el monitoreo en tiempo real de la impedancia eléctrica de las células infectadas. Una aplicación práctica de este método se presenta mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A bajo diferentes parámetros fisicoquímicos que imitan las condiciones ambientales.

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Aquí, demostramos el uso de la impedancia eléctrica basada en células (CEI) como un método muy fácil y directo para estudiar la infección y replicación del virus Zika en células humanas en tiempo real. Además, el ensayo CEI es útil para la evaluación de compuestos antivirales.

Plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del Zika en tiempo real

El ensayo TCID50 aquí reportado utiliza mediciones de impedancia en tiempo real sin etiqueta y el módulo de Virología del sistema para monitorizar objetivamente los efectos citopáticos (CPE) inducidos por virus en tiempo real. Este ensayo simplificado reduce significativamente el tiempo de trabajo práctico, al tiempo que permite mediciones cuantitativas de CPE cinética de alto rendimiento y permite cálculos automatizados y en tiempo real de TCID50.

Un ensayo de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) en tiempo real y sin marcador, optimizado y sin marcador, utilizando impedancia para la cuantificación automatizada de títulos virales

Aprende a monitorizar cambios morfológicos en células endoteliales de vena umbilical humana durante infecciones virales mediante análisis celular en tiempo real basado en impedancia. Este método no invasivo permite detectar efectos transitorios como desprendimiento celular y fugas vasculares.

Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia (Video) | JoVE Journal

Monitorización de los cambios en las células endoteliales de la vena umbilical humana tras la infección viral mediante el análisis celular en tiempo real basado en la impedancia

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