Name: Caracterización funcional y visualización de fibroblastos esofágicos mediante cocultivos organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprenda a caracterizar fibroblastos esofágicos mediante cocultivos organoides para estudiar interacciones célula-nicho. Este modelo permite visualizar cómo los fibroblastos afectan el comportamiento de células progenitoras en biología del esófago y oncología.

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Este estudio fue apoyado por ERC StG TroyCAN (851241). E.E. es un asociado postdoctoral de Cancerfonden. M.G. es Ragnar Söderberg Fellow e Investigador Junior de Cancerfonden. Estamos agradecidos por la asistencia técnica de las instalaciones centrales del Instituto Karolinska, incluidas las instalaciones centrales de citometría de flujo Biomedicum, el núcleo de imágenes Biomedicum (BIC) y las instalaciones para animales de Medicina Comparada Biomedicum (KMB). Agradecemos a los miembros del laboratorio de Genander por leer y comentar cuidadosamente el protocolo.

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<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
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<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

El protocolo presentado aquí establece un modelo in vitro para investigar las interacciones epitelial-fibroblastos esofágicas funcionales.
La capa epitelial está separada del estroma, lo que permite un protocolo de disociación optimizado tanto para el compartimento epitelial como para el estromal. A pesar de la optimización del protocolo de disociación epitelial, los grupos de tejido siguen siendo evidentes. Subir y bajar vigorosamente cada 15 minutos disminuye sustancialmente el número y el tamaño de los grupos. Otros protocolos utilizan tripsina para disociar aún más la capa epitelial 5,6. Aquí, el uso de tripsina, o aumentar aún más el tiempo de disociación, no se recomienda, ya que esto tiende a resultar en una disminución de la viabilidad de las células epiteliales y la eficiencia de formación de organoides. En contraste con el epitelio, el estroma se disocia fácilmente, y 30 minutos en solución de disociación da como resultado una suspensión unicelular con ~ 90% de viabilidad de fibroblastos (Figura 1E). La exclusión del paso de separación epitelial-estomal en el protocolo aumenta sustancialmente el tiempo de disociación, lo que resulta en una disminución de la viabilidad de los fibroblastos y un menor rendimiento de las células epiteliales. Además, separar el epitelio del estroma brinda la oportunidad de determinar el número de células de cada población y mezclar células epiteliales y fibroblastos de diferentes líneas de ratón al establecer los cocultivos.
El estudio de la función de los fibroblastos en el crecimiento de organoides es un método comúnmente utilizado en la biología de células madre 9,10,11,15,16. Los medios de cocultivo establecidos son DMEM suplementado con suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 10%9,15 o factor de crecimiento medio reducido10,16. En este protocolo, el medio reducido del factor de crecimiento se utiliza para imitar las condiciones en el nicho de células madre in vivo, donde los fibroblastos son en gran medida inactivos. FCS es un suero rico en factores de crecimiento que resulta en la activación y proliferación de fibroblastos en los cocultivos, probablemente correspondiente a un estado de células de fibroblastos distinto del estado in vivo. Al excluir FCS y reducir los factores de crecimiento, de modo que el medio solo (ERbajo) no apoya el crecimiento de organoides y no estimula la proliferación de fibroblastos, es posible aislar el efecto de los fibroblastos en el crecimiento de organoides. En este medio, NOGGIN se elimina y RSPO se reduce a un mínimo (10% RPSO). Tanto NOGGIN como RSPO han demostrado ser esenciales para el crecimiento de organoides esofágicos6. EGF se mantuvo en el medio de cocultivo, ya que no admite el crecimiento de organoides por sí mismo. Sin embargo, los fibroblastos también son capaces de soportar el crecimiento de organoides en un medio reducido en EGF (E bajo Rbajo; Figura 2B, D).
Los cocultivos de organoides no pueden sostenerse a través del paso, ya que los fibroblastos se pierden durante la tripsinización. Sin embargo, el paso de organoides se incluyó en el protocolo ya que los organoides esofágicos se pueden mantener, expandir y usar para experimentos adicionales como monocultivos. Los organoides pasados de monocultivos se pueden usar para establecer cocultivos con fibroblastos recién aislados. Una desventaja del uso de células primarias es el número de ratones necesarios para establecer múltiples cocultivos de organoides. Cuando se centra en pequeñas subpoblaciones de fibroblastos, el número de cocultivos obtenidos es limitado. En otros protocolos, los fibroblastos se expanden primero en cultivo antes de usarlos para establecer cocultivos de organoides10. Sin embargo, los fibroblastos cambian morfología e identidad durante el paso, demostrado por el uso de fibroblastos primarios cutáneos y cardíacos17,18. El paso 2D convencional de fibroblastos esofágicos da como resultado cambios tanto en la morfología como en el fenotipo, lo que demuestra que el enriquecimiento in vitro de fibroblastos no es adecuado para cocultivos que tienen como objetivo fenocopiar el nicho de células madre endógenas.
La tinción de montaje completo proporciona una herramienta para mantener y visualizar la interacción fibroblasto-organoide. Cabe señalar que, si bien no todos los organoides tendrán fibroblastos directamente unidos a ellos, la mayoría de los organoides están en contacto con fibroblastos (ver Figura 2C). Para mantener las interacciones epitelial-fibroblasto, es importante manejar los organoides con cuidado y evitar el pipeteo vigoroso, el vórtice y el giro a alta velocidad. La fijación óptima es importante para mantener la arquitectura del tejido 3D, así como para mantener la fluorescencia endógena. Una fijación de 30 minutos es suficiente para retener la señal H2BeGFP y es óptima para los anticuerpos utilizados en este protocolo, sin embargo, esto puede variar entre los fluoróforos y los anticuerpos utilizados. La limpieza de los organoides reduce la dispersión de la luz y mejora sustancialmente la visualización de toda la estructura 3D. Como los organoides son pequeños, la limpieza es fácil y rápida; sin embargo, la obtención de imágenes de organoides completos utilizando microscopía confocal de escaneo láser puede llevar mucho tiempo, ya que se deben hacer múltiples pilas Z. Los microscopios confocales, como el disco giratorio, se pueden usar para reducir el tiempo de obtención de imágenes.
En general, los organoides esofágicos cultivados en presencia de fibroblastos proporcionan una herramienta valiosa para comprender aspectos del nicho de células madre esofágicas. Además, la limpieza de montaje completo proporciona un método accesible para visualizar la interacción entre fibroblastos y organoides.

Los organoides se utilizan como ensayos 3D in vitro para caracterizar células madre y progenitoras, así como para comprender las señales de señalización derivadas de los componentes celulares del nicho de células madre 1,2,3,4. Los organoides esofágicos de ratón se describieron por primera vez en 2014 y varios artículos han identificado factores de crecimiento, como R-Spondin (RSPO), NOGGIN y factor de crecimiento epidérmico (EGF), necesarios para mantener y pasar organoides esofágicos 5,6,7, argumentando que se requieren señales de señalización similares para in vivo Renovación de células progenitoras. Sin embargo, los factores de crecimiento se añaden comúnmente en concentraciones no fisiológicas, lo que da lugar a condiciones de crecimiento de organoides que no reflejan necesariamente el entorno de señalización in vivo.
Los fibroblastos son poblaciones heterogéneas de células estromales que apoyan las propiedades de las células progenitoras en muchos nichos de células madre8. La combinación de células progenitoras epiteliales y fibroblastos en el mismo cultivo de organoides permite la formación de organoides en concentraciones reducidas de factores de crecimiento suplementados exógenamente. Se describen sistemas de cocultivo de organoides a partir de epitelios intestinales y hepáticos, pero sigue pendiente un protocolo para establecer cocultivos organoides-fibroblastos esofágicos 9,10,11.
En este protocolo, se describen dos estrategias de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para fibroblastos del esófago, utilizando ratones transgénicos PdgfrαH2BeGFP 12 o ratones de tipo salvaje con tinción clásica de anticuerpos. Se pueden aislar diferentes subpoblaciones de fibroblastos utilizando marcadores de superficie celular de elección, lo que proporciona flexibilidad al protocolo. Además, se utiliza una técnica de imagen de fluorescencia 3D que preserva la morfología organoide para caracterizar las interacciones fibroblasto-organoide. El aclaramiento de organoides proporciona un método rápido para aumentar la profundidad de penetración de la luz en los organoides, mejorando la visualización de las conexiones organoide-fibroblasto y permitiendo la recapitulación de la estructura organoide en su totalidad. Este protocolo combina el cocultivo de organoides esofágicos con una estrategia de imagen de montaje completo, lo que permite la caracterización funcional de la interacción fibroblasto-organoide.

<table><tbody><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sin suero</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Matrigel&nbsp; Matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento (GFR)</td><td>Fisher Scientific</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución Triton X-100</td><td>Merck</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenol</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td><Solución > productos químicos, péptidos y proteínas recombinantes</fuerte></td>DAPI Thermo Fisher 62248 Solución de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>disociación: 0,25 mg/ml Liberase TM, 0,25 mg/ml Dnasa en HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Dnase I Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>Formaldehído, 37%, con 10-15% de metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murine</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td><td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>Proteína EGF recombinante de ratón, CF</td><td>R& Sistemas D</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-espondina-1 murina</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Mancha de células muertas azules</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Plástico y Cristalería</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtros de células estériles 40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtros de células estériles 70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl&auml; Thermo</td><td>Fisher</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de reacción SafeSeal, 1,5 mL, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Tubos de microcentrífuga de baja retención 0,6 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Slides</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05 mm 4 pocillos circulares iSpacer</td><td>SunJin Lab</td><td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>pinza Dumont #5, punta de biología</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte inclinadas a lado punta esférica de 8 mm borde de corte</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopio Stellaris 5&nbsp;</td>Microscopio de disección <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Anticuerpos</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>conjugados conjugated for FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-ratón CD104 Anticuerpo Clon: 346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-ratón Anticuerpo CD26 (DPP-4)</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-ratón/humano CD324 (E-Cadherin)</td><td>Anticuerpo 147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td><Anticuerpos > fuerte para inmunofluorescencia</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (&szlig;-integrina 4) Clon: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos contra la citoqueratina 14</td><td>Acris (AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Citoqueratina13 Clon:</td><td>EPR3671 abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherina (CD324) Clon: 2.40E+11</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>Queratina 5 Anticuerpo policlonal de pollo, purificado Clon: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 Clon: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>Clon recombinante anti-KLF4 antibod : EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios</anticuerpos antiespecie ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>burro fuerte* con fluoróforo de elección</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización funcional y visualización de fibroblastos esofágicos mediante cocultivos organoides

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Las células madre epiteliales y progenitoras contribuyen a la formación y mantenimiento de la barrera epitelial durante toda la vida. La mayoría de las poblaciones de células madre y progenitoras están escondidas en lugares anatómicamente distintos, lo que permite interacciones exclusivas con señales de nicho que mantienen la derivación. Si bien el desarrollo de cultivos de organoides epiteliales proporciona una herramienta poderosa para comprender el papel de las células madre y progenitoras en la homeostasis y la enfermedad, la interacción dentro del entorno de nicho está ausente en gran medida, lo que dificulta la identificación de los factores que influyen en el comportamiento de las células madre. Los fibroblastos juegan un papel clave en la dirección del tallo epitelial y el destino del progenitor. Aquí, se presenta un protocolo integral de cocultivo organoide-fibroblasto que permite la delineación de subpoblaciones de fibroblastos en la renovación y diferenciación de células progenitoras esofágicas. En este protocolo, se describe un método para aislar tanto las células epiteliales como los fibroblastos en paralelo del esófago. Se describen distintas estrategias de clasificación celular activada por fluorescencia para aislar tanto las células progenitoras esofágicas como las subpoblaciones de fibroblastos de ratones reporteros transgénicos o de ratones de tipo salvaje. Este protocolo proporciona un enfoque versátil que se puede adaptar para adaptarse al aislamiento de subpoblaciones específicas de fibroblastos. El establecimiento y paso de monocultivos de organoides epiteliales esofágicos se incluye en este protocolo, lo que permite una comparación directa con el sistema de cocultivo. Además, se describe un enfoque de limpieza 3D que permite un análisis detallado de imágenes de las interacciones epitelial-fibroblasto. En conjunto, este protocolo describe un método comparativo y de rendimiento relativamente alto para identificar y comprender los componentes del nicho de células madre esofágicas in vitro.

El esófago se divide en diferentes capas: epitelio, lámina propia, submucosa y muscular externa (Figura 1A). Los fibroblastos residen dentro de la submucosa y la lámina propia, conocida como estroma. En este protocolo, la muscularis externa se elimina mecánicamente (Figura 1B), lo que no conduce a una pérdida de fibroblastos (PdgfrαH2BeGFP+) que residen en el estroma (Figura 1C). Antes de la disociación, el epitelio se separa del estroma dando como resultado dos segmentos de tejido (Figura 1B). La separación de las dos capas brinda la oportunidad de aumentar el tiempo de disociación para la capa epitelial más robusta en comparación con la frágil capa estromal. De esta manera, se establece un protocolo de aislamiento eficiente que produce tanto células progenitoras epiteliales viables como fibroblastos estromales (Figura 1B). Las células progenitoras esofágicas se clasifican en función de su alta expresión de INTEGRINA-β4 y E-CADHERINA (Figura 1C, D).
Las subpoblaciones de fibroblastos se pueden aislar mediante el uso de marcadores distintos. En este protocolo, se proporciona una estrategia para el aislamiento de fibroblastos basada en los marcadores de fibroblastos PDGFRα y DPP4 (CD26) de uso común. El aislamiento por la expresión del reportero PdgfrαH2BeGFP o el anticuerpo DPP4 muestra que alrededor del 50% de las células aisladas son fibroblastos (Figura 1E, F). Además, el 70% de los fibroblastos PDGFRα+ son DPP4+, lo que indica que se obtiene una población de fibroblastos en gran parte superpuesta, pero no idéntica. Después de aislar las poblaciones de células epiteliales y estromales, las células progenitoras esofágicas se cultivan solas o junto con fibroblastos en una cúpula de matriz. Para estudiar la contribución de los fibroblastos a la formación de organoides, el cocultivo se mantiene en un factor de crecimiento medio reducido (Figura 1G).
Las células progenitoras esofágicas forman organoides en presencia de EGF, NOGGIN y RSPO (ENR). Eliminar NOGGIN y reducir la cantidad de RSPO (25 ng/μL; ERbajo) es suficiente para prevenir la formación de organoides (Figura 2A). Curiosamente, la adición de fibroblastos DPP4 + o PDGFRα + a las células progenitoras esofágicas en el mediobajo del RE restaura la capacidad de formación de organoides, demostrando una función de apoyo para ambas poblaciones de fibroblastos (Figura 2A-D). La visualización del transgén PdgfrαH2BeGFP muestra que los fibroblastos están en estrecho contacto con las células progenitoras epiteliales durante la formación de organoides (Figura 2A). En el día 6, los fibroblastosPdgfrα H2BeGFP+ todavía están abundantemente presentes en el cocultivo. Los fibroblastos están presentes en toda la cúpula, cerca y tocando los organoides (flecha completa), o unidos a los organoides (punta de flecha; Figura 2D).
La tinción de montaje completo muestra una representación 3D de la interacción de los fibroblastos con los organoides (Figura 3). Si bien es posible realizar todo el protocolo de montaje sin el uso de una solución de limpieza, disminuye la transparencia y la penetración láser del organoide (Figura 3B, vista z). Al montar organoides, el espaciador ayuda a mantener la morfología de los organoides. Por el contrario, el recubrimiento directamente sobre los organoides (sin un espaciador) aplana los organoides y resulta en la pérdida de la estructura del organoide (Figura 3A, B).
Tanto los fibroblastos DPP4+ como los PDGFRα+ se encuentran envueltos alrededor de los organoides (Figura 3C, Video1 y Video 2). La diferenciación de los organoides esofágicos se puede evaluar utilizando diferentes marcadores. La figura 4 muestra que el protocolo de tinción proporcionado es adecuado para queratinas más fáciles de teñir (KRT14/13), así como para factores de transcripción más difíciles de teñir (TRP63/KLF4). El protocolo de cocultivo genera organoides con un patrón de diferenciación similar, como se demostró in vivo13,14 y como se ve en organoides cultivados en medio ENR; Las células progenitoras KRT14+ o TRP63+ forman la capa externa y las células diferenciadas KRT13+ o KLF4+ se orientan hacia el interior.
Este protocolo proporciona una herramienta para estudiar el nicho de células madre esofágicas in vitro y visualiza la interacción entre organoides y fibroblastos. Al implementar un protocolo para el aislamiento de fibroblastos utilizando anticuerpos, el método es adaptable y se puede utilizar para estudiar subpoblaciones de fibroblastos sin necesidad de ratones transgénicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> Figura 1: Aislamiento de células progenitoras y subpoblaciones de fibroblastos del esófago . (A) Resumen esquemático de las diferentes capas del esófago. El estroma contiene la lámina propia y la submucosa. (B) Resumen esquemático del protocolo de aislamiento. El músculo (muscularis externa) se extirpa mecánicamente con fórceps; El esófago restante se abre y se incuba en termolisina para separar la capa epitelial del estroma. El epitelio y el estroma se separan, se pican mecánicamente y se digieren enzimáticamente en suspensiones unicelulares. Las células disociadas se tiñen y se preparan para el FACS. (C) Sección transversal del esófago despojado de la muscular externa que muestra fibroblastos PdgfrαH2BeGFP+ en el estroma. Las células INTEGRIN-β4 (ITGβ4) y E-CADHERINA (ECADIN) doble positivas son las células progenitoras epiteliales del esófago. Barra de escala = 100 μm. (D) Gráfico de citometría de flujo representativo del aislamiento de células epiteliales que muestra el porcentaje de células vivas (panel superior) de todas las células individuales. El panel inferior muestra el porcentaje de células progenitoras ITGβ4+ ECAD+ (Prog.) aisladas de todas las células vivas. (E) Gráfico de citometría de flujo representativo del aislamiento de células estromales que muestra el porcentaje de células vivas (panel superior izquierdo). Gráficos de citometría de flujo representativos que muestran el porcentaje de fibroblastos DPP4+ aislados (Fibr.; panel superior derecho) y fibroblastos Pdgfrα+ (panel inferior izquierdo) de todas las células vivas. El 70% de los fibroblastos Pdgfrα+ también son DPP4+ (panel inferior derecho). (F) Gráfico de citometría de flujo representativo del estroma que muestra células DPP4+ solo (2,5%), células PDGFRα+ DPP4+ (37,5%) y células solo PDGFRα+ (17,7%). Los porcentajes son de todas las células vivas. (G) Las células epiteliales solamente se colocan en una cúpula de matriz en presencia de 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN y 250 ng/μL RSPO (ENR), o junto con fibroblastos en presencia de EGF y una baja concentración de RSPO (25 ng/μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos de cocultivos de organoides. (A) Imágenes de campo claro que muestran el crecimiento de los organoides desde el día 1 hasta el día 6. Las imágenes de campo claro con los organoides cocultivados con fibroblastos PdgfrαH2BeGFP+ también muestran la señal nuclear de eGFP. Barra de escala = 25 μm. (B) Imágenes de campo claro de toda la cúpula de la matriz en el día 6. La columna izquierda muestra cocultivos organoides cultivados en presencia de fibroblastos Pdgfrα+ en ER bajo o E bajo Rbajo medio. La columna central muestra cocultivos organoides cultivados en presencia de fibroblastos DPP4+ en ER bajo o E bajo Rbajo medio. La columna de la derecha muestra monocultivos organoides cultivados en medio ENR. Medio ENR = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) y RSPO (250 ng/μL). ER bajo = EGF y 25 ng/μLRSPO. E bajoRbajo = 5 ng/μL EGF y 25 ng/μL RSPO. Barra de escala = 500 μm. (C) Gráfico que muestra la eficiencia de formación de organoides (%) (es decir, el porcentaje de células que forman organoides en diferentes condiciones de cultivo). Cada punto representa una cúpula matricial y la barra representa la media de todos los puntos por condición. (D) Imagen fluorescente y de campo claro de organoides del día 6 cocultivados con fibroblastos PdgfrαH2BeGFP+. Los fibroblastos PdgfrαH2BeGFP+ están presentes en toda la cúpula, unidos a los organoides (punta de flecha) y no unidos pero en contacto con los organoides (flecha completa). Barra de escala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo de tinción de montaje completo para el estudio de las interacciones fibroblasto-organoide . (A) Resumen esquemático del protocolo de inmunofluorescencia de montaje completo. AB = anticuerpo. (B) Imagen de inmunofluorescencia de tinción de montaje completo no aclarada que muestra una disminución de la transparencia y la penetración de la luz láser en comparación con los organoides eliminados. La ausencia de un espaciador resulta en el aplanamiento del organoide y la pérdida en la morfología del organoide. (C) Las imágenes de montaje completo de los organoides cocultivados muestran superficies 3D de los organoides con fibroblastos VIMENTIN+ (Fibr.) envueltos alrededor y en estrecho contacto con el organoide. Las secciones transversales 3D y las imágenes planas 2D muestran la luz del organoide. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> Figura 4: Las imágenes de montaje completo revelan distintas poblaciones de células basales y suprabasales. (A) Tinción de montaje completo de organoides mono y cocultivados con fibroblastos PdgfrαH2BeGFP+ que muestran células basales KRT14+ en la capa externa y células suprabasales diferenciadas KRT13+. Barra de escala = 50 μm. (B) Tinción de montaje completo de organoides mono y cocultivados con fibroblastos PdgfrαH2BeGFP+ que muestran células basales TRP63+ en la capa externa y células suprabasales diferenciadas KLF4+. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Tabla que describe los componentes de los medios de cultivo de organoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Video 1: Fibroblasto PdgfrαH2BeGFP+ envuelto alrededor y en estrecho contacto con el organoide. El video acompaña al panel superior de la Figura 3C. La barra de escala en la Figura 3C es de 50 μm, y el organoide tiene ~120 μm de diámetro. VIMENTIN se muestra en blanco, E-CADHERIN en rojo, PdgfrαH2BeGFP en verde y DAPI en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Fibroblasto DPP4+ envuelto alrededor y en estrecho contacto con el organoide. El video acompaña al panel inferior de la Figura 3C. La barra de escala en la Figura 3C es de 50 μm, y el organoide tiene ~120 μm de diámetro. VIMENTIN se muestra en blanco, E-CADHERIN en rojo y DAPI en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Los cocultivos organoide-fibroblastos proporcionan un modelo para estudiar el nicho de células madre in vivo . Aquí, se describe un protocolo para los cocultivos organoide-fibroblastos esofágicos. Además, se utilizan imágenes de montaje completo para visualizar la interacción fibroblasto-organoide.

Caracterización funcional y visualización de fibroblastos esofágicos mediante cocultivos organoides

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

Así que las células progenitoras interactúan con el medio ambiente para mantener la homeostasis de los tejidos. Y usando este protocolo podemos comenzar a entender cómo los fibroblastos afectan el comportamiento de las células progenitoras esofágicas. El sistema de cocultivo utiliza en primer lugar células aisladas que imitan el nicho normal del progenitor esofágico.La limpieza de los organoides antes de la obtención de imágenes permite el análisis tanto de las interacciones celulares como de la morfología de los organoides. Este método podría aplicarse a organoides esofágicos humanos. Por ejemplo, utilizando materiales de pacientes sanos o con cáncer.Al hacerlo, podemos obtener información sobre la función específica de los fibroblastos asociados al cáncer. La disociación de las células epiteliales y estromales es crítica para obtener organoides viables. Bajo digestión resultará en un bajo rendimiento celular, donde la sobredigestión reducirá la viabilidad celular y la capacidad de formación de organoides.Para comenzar, extirpe mecánicamente la musculis externa del esófago con un microscopio de disección y fórceps. Sostenga el extremo distal del esófago disecado con un par de fórceps y use los otros fórceps para agarrar y tirar del músculo desde el extremo distal hasta el extremo proximal del esófago. Retire y deseche la capa muscular.Para abrir el esófago longitudinalmente, sostenga un extremo del esófago e inserte la bola de las tijeras de resorte de microdisección en el lumen para evitar daños tisulares. Corte el esófago mientras se sostiene en el extremo y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros, o una placa de 24 pocillos. Sumergir el esófago abierto en 0,5 miligramos por mililitro de termolisina en HBSS e incubar a 37 grados centígrados en un agitador balancín durante 15 minutos.Después de retirar el esófago de la solución de termolisina, separe cuidadosamente el epitelio esofágico del estroma. Transfiera la capa epitelial y estromal a dos tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros con 200 microlitros de solución de disociación en HBSS y colóquelos en hielo. Picar el epitelio esofágico con un bisturí afilado y recoger el tejido picado de la placa de Petri con 200 microlitros de solución de disociación.Transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 800 microlitros de solución de disociación fresca y coloque el tubo con la capa epitelial picada en un agitador balancín a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces con una punta de pipeta de 200 microlitros cada 15 minutos.Corte la capa estromal en trozos finos en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de solución de disociación con tijeras de disección y agregue 800 microlitros de solución de disociación fresca. Coloque el tubo en una coctelera balancín a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos de incubación para la solución estromal y 60 minutos de incubación para la solución epitelial, pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo durante otras 20 veces.Pasar la solución estromal a través de un filtro de células de 70 micrómetros, y la solución epitelial a través de un filtro de células de 40 micrómetros en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 milímetros. Centrifugar a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante eliminando el exceso de líquido con una pipeta de un mililitro. Resuspender el pellet en 200 microlitros de mezcla de anticuerpos.Después de transferir la mezcla a un tubo de citometría de flujo, incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Agregue tres mililitros de 1% FBS y centrifugar nuevamente durante cinco minutos. Luego resuspender las células en un mínimo de 200 microlitros de 1% FBS.Agregue uno a 10, 000 marcadores de tinción de células muertas diluidas, cinco minutos antes de la clasificación por fax para aislar las células vivas. Mezcle las células epiteliales y fibroblastos ordenados en una proporción de uno a dos en un tubo. Después de centrifugar a 300 G durante cinco minutos, deseche el sobrenadante retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 microlitros.Lave las células una vez resuspendiendo el pellet en medio organoide básico frío y centrifugar nuevamente durante cinco minutos. Coloque las células en hielo y deseche el sobrenadante retirándolo cuidadosamente con una pipeta de 200 microlitros. Resuspenda las células en 10 microlitros de mezcla de matriz por domo y vuelva a colocar el tubo en hielo.Tome la placa de 48 pocillos precalentada de la incubadora de 37 grados centígrados y haga una cúpula de matriz por pozo. Usando una pipeta de 20 microlitros, agregue 200 microlitros de medio bajo ER precalentado a las cúpulas de matriz que contienen cocultivos organoides y medio ENR a las cúpulas de matriz respectivas que contienen solo organoides epiteliales. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Y durante los primeros dos días, complemente el medio con 10 inhibidores de roca micromolar. Retire el medio organoide y agregue 200 microlitros de PBS helado a las cúpulas de la matriz. Después de colocar la placa en hielo durante cinco a 10 minutos, pipetear hacia arriba y hacia abajo y transferir la solución a un tubo no adherente de 0,6 mililitros.Centrifugar brevemente durante 30 a 60 segundos a 100G para dejar que los organoides se asienten en el fondo. Después de eliminar el exceso de líquido, agregue PBS helado al tubo y centrifugar nuevamente durante 30 a 60 segundos. Retire el exceso de líquido como se mostró anteriormente y fije el organoide con 200 microlitros de formaldehído frío al 4% en solución de PBS durante 30 minutos en hielo.Coloque el tubo en posición vertical para dejar que el organoide se hunda y retire el formaldehído. Agregue 500 microlitros de PBS frío para lavar el formaldehído restante. Después de eliminar el exceso de PBS, agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo.Coloque el tubo en un agitador balancín durante 60 minutos a temperatura ambiente. Retire el tampón de bloqueo y resuspenda los organoides en 200 microlitros de tampón de bloqueo con anticuerpos primarios. Coloque los organoides nuevamente en una coctelera durante la noche a cuatro grados centígrados.Retire la mezcla de anticuerpos primarios y lave los organoides con 500 microlitros de 0.02% Triton X 100 en PBS durante 60 minutos a temperatura ambiente. Repita esto tres veces. Del mismo modo, retire el tampón de lavado y agregue 200 microlitros de anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia en el tampón de bloqueo durante la noche a cuatro grados centígrados.Vuelva a lavar los organoides usando 0.02% Triton X 100 en PBS seguido de 500 microlitros de PBS. Después de eliminar todo el exceso de líquido, agregue 10 microlitros de solución de limpieza a los organoides e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Coloque un espaciador adhesivo de cuatro pocillos de doble cara de 0,05 milímetros en un portaobjetos de microscopio.Agregue los 10 microlitros de solución de limpieza con los organoides en un pocillo y coloque un cubreobjetos en la parte superior del espaciador. Adquirir imágenes mediante un sistema de microscopía confocal. Las células progenitoras esofágicas se clasifican en función de su alta expresión integrada de beta cuatro y e-cadherina.La gráfica de citometría de flujo representativa del aislamiento de células epiteliales muestra el porcentaje de células vivas de todas las células individuales. Aquí se muestra el porcentaje de células progenitoras aisladas de integrina beta cuatro y e-cadherina de todas las células vivas. Los gráficos de citometría de flujo que se muestran aquí representan el porcentaje de fibroblastos alfa positivos aislados con receptores DPP4+ y Pdgf.Las imágenes de campo brillante con los organoides cocultivados con fibroblastos positivos para el receptor Pdgf alfa H2 BEGFP muestran la señal nuclear de EGFP. Las imágenes de campo brillante de toda la cúpula de la matriz en el día seis se muestran aquí. La eficiencia de formación de organoides se presenta en esta imagen gráfica.Cada punto representa una cúpula matricial, y la barra representa la media de todos los puntos por condición. Aquí se muestran las imágenes fluorescentes y de campo brillante del cocultivo de organoides del día seis con fibroblastos alfa positivos para el receptor Pdgf. Las imágenes completas de montaje de los organoides cocultivados muestran superficies 3D de los organoides con fibroblastos positivos de vimentina envueltos alrededor y en estrecho contacto con el organoide.Toda la tinción de montaje de organoides mono y cocultivados con fibroblastos alfa positivos para el receptor de Pdgf revela distintas poblaciones de células basales y suprabasales. La eficiencia de formación de organoides, así como el tamaño del organoide están influenciados por el fibroblasto incluido en el cocultivo. Se esperan variaciones y resultados cuando se utilizan diferentes subpoblaciones de fibroblastos.La misma estrategia se puede emplear para caracterizar los fibroblastos asociados a tumores tanto en ratones como en humanos.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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