Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares

Nuestro protocolo proporciona herramientas para estudiar el epitelio intestinal del cerdo para la investigación veterinaria y biomédica. Los organoides intestinales de los cerdos se pueden utilizar para estudiar el transporte de nutrientes, la función de barrera y las interacciones huésped-microbio. A través de la preservación de las criptas epiteliales intestinales del cerdo permiten crear un gran stock de células madre que luego se pueden utilizar para cultivar organoides en monocapas 3D o 2D.

Este protocolo está detallado para el yeyuno, pero también se puede usar para otros segmentos intestinales como el duodeno, el íleon y el colon. Para comenzar, descongele rápidamente un frasco que contiene 900 criptas congeladas en un baño de agua a 37 grados centígrados. Transfiera la solución de cripta a un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante. Añadir 150 microlitros de la matriz extracelular o ECM con una punta enfriada para obtener una concentración final de 150 criptas por cada 25 microlitros de ECM. Pipet arriba y abajo 10 veces para obtener una suspensión homogénea de criptas en el ECM.

Siembre seis pocillos con una gota de 25 microlitros por pocillo en una placa de 48 pocillos precalentada. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para la polimerización de la ECM. Añadir un 250 microlitro por pocillo de cultivo de medio a temperatura ambiente e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Cambie el medio de cultivo cada dos o tres días. Para pasar organoides 3D derivados de criptas congeladas 10 días después de la siembra, retire los medios de cultivo y agregue 250 microlitros de PBS precalentado a 37 grados centígrados. Después de la incubación, reemplace el PBS con 250 microlitros de reactivo de disociación enzimática precalentado complementado con 10 inhibidores de roca micromolar a 37 grados centígrados en cada pocillo.

Separar los organoides en el ECM raspando con una pipeta P-1000 y homogeneizar cuidadosamente pipeteando cinco veces. Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono antes de disociar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Agregue 500 microlitros de DMEMc en cada pocillo que contenga células disociadas y extraiga hasta 12 pocillos en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tres mililitros de DMEMc frío.

Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de DMEMc frío. Cuente las células con una dilución de una a dos en azul de tripano con un contador de células.

Centrifugar el volumen necesario de la solución celular para tener 3000 células vivas por domo. Resuspender el pellet con 17 microlitros de DMEMc frío por cada 3000 células vivas en hielo. Ajuste el volumen al número requerido de pozos.

Agregue lentamente 33 microlitros de ECM fría por cada 3000 células vivas. Ajuste el volumen al número requerido de pocillos y homogeneice sin hacer burbujas. Luego vea los pocillos con 50 microlitros de la suspensión celular ECM por pozo en una placa precalentada de 24 pocillos e incube durante 30 minutos para la polimerización de la ECM.

Añadir 500 microlitros del medio de cultivo por pocillo. Luego incubar y cambiar el medio de cultivo cada dos o tres días. Para recubrir el prospecto de cultivo, prepare la solución de recubrimiento que contiene colágeno IV diluido a 50 microgramos por mililitro en PBS frío.

Agregue 150 microlitros de la solución de recubrimiento diluida a cada inserto de cultivo celular e incube durante la noche o durante tres horas. Cinco días después de la división, separe los organoides con el ECM raspándolos con una pipeta P-1000. Homogeneizar cuidadosamente mediante pipeteo en el medio de cultivo y transferir a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de DMEMc frío en hielo.

Centrifugar los organoides recolectados a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un mililitro de reactivo de disociación enzimática precalentado suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK. Pipet arriba y abajo 10 veces para iniciar la disociación de los organoides.

Incubar durante cinco minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados para la digestión enzimática. Interrumpir mecánicamente los organoides pipeteando 10 veces y añadir cuatro mililitros de DMEMc helado. Centrifugar y desechar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet de células organoides en un mililitro de DMEMc.

Cuente las células en azul de tripano con un contador de células y calcule el volumen necesario para sembrar de 2,5 veces de 10 a la quinta celda por inserto de cultivo. Centrifugar el volumen necesario de la suspensión celular correspondiente a 2,5 veces 10 de las quintas células por inserto de cultivo. Durante la centrifugación, aspire cuidadosamente la solución de recubrimiento de los insertos de cultivo y deje que se seque debajo de la campana sin la tapa durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el volumen necesario de medio 2D suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK. Semilla 200 microlitros de la suspensión celular sobre la membrana permeable recubierta. Agregue 500 microlitros del medio 2D suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK al compartimento inferior e incube.

Se debe observar una alta densidad de células en la membrana. Un día después de la siembra, reemplace los medios épicos y basales con medios 2D frescos sin el inhibidor ROCK. Cambie los medios de comunicación cada día.

La monocapa se vuelve confluente un día después de la siembra y puede usarse para sus experimentos. En este estudio, se obtuvieron criptas epiteliales del intestino del cerdo y se criopreservaron para su almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. Después de la descongelación, las células madre de la cripta se sembraron en la ECM.

Los organoides se observaron dentro de tres o cuatro días y rápidamente crecieron y desarrollaron estructuras en ciernes. Aproximadamente 10 días después de la descongelación, se realizó el paso de organoides para expandir el cultivo. Para un mantenimiento óptimo del cultivo, los organoides utilizados para el envasado deben presentar una luz clara y vacía y bordes bien definidos sin residuos negros en la luz como se observa en los organoides maduros.

Las células se unen y forman una monocapa totalmente confluente en un día, lo que se confirma por la alta resistencia eléctrica transepitelial, o TEER, de alrededor de 700 cúpulas de centímetros cuadrados. El TEER permanece alto durante tres días. La tinción de actina indica que el lado apical de las células epiteliales está orientado hacia la luz en los organoides 3D.

Las células organoides sembradas en inserciones de cultivo forman una sola capa confluente de células epiteliales con el lado apical orientado hacia el compartimiento superior. La tinción de occludina revela la presencia de uniones estrechas en el lado apical de las células epiteliales en organoides 3D y en monocapas celulares. Es importante recordar que el organoide utilizado para sembrar monocapas celulares debe aparecer claro con un lumen vacío sin restos negros correspondientes a una acumulación de células muertas.

Las monocapas de organoides intestinales de cerdo se pueden usar para probar los efectos de metabolitos o microbios en la función de barrera epitelial mediante el uso de ensayos funcionales, imágenes y análisis de expresión génica.