Name: Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprende a evaluar simultáneamente divisiones celulares, fenotipo y parentesco en progenitores hematopoyéticos mediante citometría de flujo. Este protocolo de alto rendimiento facilita estudios de biología del cáncer e inmunología.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del Institut Curie Flow Facility por su ayuda en la puesta en marcha de los experimentos de citometría de flujo. También queremos reconocer las contribuciones de los otros miembros del Equipo Perié, durante múltiples discusiones. Julia Marchingo y al Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) por compartir su protocolo de multiplexación de colorantes de división celular en linfocitos. Agradecemos al biobanco de sangre del cordón umbilical del hospital de Saint Louis por proporcionar los recursos biológicos necesarios para el desarrollo de este protocolo. El estudio fue apoyado por una subvención ATIP-Avenir del CNRS y la Fundación Bettencourt-Schueller (a L.P.), subvenciones del Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (a L.P. y A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (a L.P.), el Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, a L.P.) y la subvención ITMO MIIC (21CM044, a L.P.). Además de la financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea ERC StG 758170-Microbar (a L.P.), A.D. contó con el apoyo de una beca de la Fundación de Francia.

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses relevante para este trabajo. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de datos, o la decisión de enviar el trabajo para su publicación.

El ensayo MultiGen es un ensayo de alto rendimiento, fácil de realizar y poco costoso, que ha sido fundamental para estudiar los linfocitos 23,24,35 y las células hematopoyéticas murinas26,27. Aquí, presentamos un nuevo desarrollo del enfoque que permite descifrar ex vivo la fase temprana del compromiso de HSPC humano, a nivel unicelular utilizando cultivo a corto plazo (Figura 6). Los sistemas de cultivo ex vivo unicelulares se utilizan típicamente para evaluar el destino a largo plazo de las HSPC en células maduras, pero algunos destinos ocurren antes que otros36, lo que podría sesgar el análisis hacia menos destinos. Además, estos sistemas de cultivo generalmente pierden información sobre las divisiones durante el compromiso del destino. Se ha demostrado que los primeros pasos de compromiso ocurren tan pronto como al comienzo de la cultura, a veces sin división26,37, lo que hace que la cultura a corto plazo y la división de seguimiento sean esenciales para estudiar el compromiso de destino temprano. Al seguir simultáneamente el destino, la división y el parentesco, este ensayo permite comprender el papel de la primera división y la decisión del destino en las HSPC humanas. Usando el ensayo, es posible inferir después de cuántas divisiones ocurre el proceso de compromiso, el equilibrio entre la autorrenovación y la diferenciación para esos progenitores tempranos, y cómo esas propiedades se heredan a través de las generaciones. Hasta donde sabemos, este es el único ensayo que permite este tipo de mediciones para HSPC humanas, a resolución de una sola célula. Además, utilizando diferentes combinaciones de colorantes de división celular, aumentamos el rendimiento del análisis, haciendo de este ensayo una herramienta valiosa para generar grandes conjuntos de datos rápidamente. Las combinaciones de colorantes permiten seguir varias familias en los mismos pocillos, aumentando el número de células disponibles para su análisis en cultivo a corto plazo. El número de combinaciones podría aumentarse aún más, mediante la adición de otros colorantes (por ejemplo, colorante amarillo) o modificando la proporción de CFSE y CTV. Sin embargo, esto reduce el número de otros parámetros que se pueden analizar.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> Figura 6: Representación esquemática del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para realizar el análisis con éxito, debido a la gran cantidad de pocillos y al número reducido de células a analizar, es necesario ejecutar el análisis de citometría de flujo en un analizador equipado con un lector de placas. La nueva generación de analizadores de banco está particularmente adaptada a este ensayo, ya que la mayoría de ellos tienen un volumen muerto menor para reducir el porcentaje de pérdida celular. Esto a su vez garantiza una mayor eficiencia en la recuperación de la totalidad de cada pozo, lo que provoca una eficiencia estimada en el rango del 70%26. La estimación de la pérdida celular durante la adquisición de citometría de flujo es crucial para el análisis de cada familia individual. Por ejemplo, suponiendo que no hay muerte celular y contando el número de divisiones, es posible estimar el número de células por cada familia. Sin embargo, es deseable realizar algunos experimentos confirmatorios, particularmente en la estimación de la muerte celular en las condiciones de cultivo probadas y la medición de la tasa de recuperación experimentalmente utilizando un número definido de células.
Uno de los pasos cruciales de este protocolo es la asignación de picos. Como ya se mencionó, una distribución de picos de buena calidad depende en gran medida del aislamiento de picos muy estrechos en la clasificación celular. Sin embargo, todavía es difícil asignar el número correcto de divisiones basadas únicamente en la distribución. Como la clasificación celular y el análisis de citometría de flujo se realizan en dos máquinas diferentes, no es posible comparar directamente la intensidad de cada señal, por lo que podría ser difícil saber si el primer pico observado en el extremo derecho del histograma es el pico 0 o el pico 1. En este sentido, pocas soluciones son posibles; Una forma es realizar un experimento ortogonal para medir con precisión el número de divisiones realizadas por estas células (por ejemplo, imágenes de células vivas). Otra posibilidad es simplemente contar el número de células en el pozo bajo un microscopio de campo claro invertido, antes de ejecutar el análisis de citometría de flujo. Esto inferirá un número promedio de divisiones (suponiendo que no haya muerte celular). Finalmente, una solución post-hoc para la asignación de picos es la detección de un número inusual de "familias imposibles"; Estas familias están compuestas por un número mayor de lo posible de células por generación (por ejemplo, cinco células en la generación 2, o dos células en la generación 1 y una célula en la generación 2). La posibilidad de excluir familias imposibles se codifica en el paso de análisis estadístico y marca la familia imposible. Si la ocurrencia de estos errores es demasiado alta, es razonable suponer que la asignación de pico necesita ser revisada.
En este protocolo, incluimos algunos ejemplos de representación y análisis de datos para el ensayo, ya que se ha convertido en un paso esencial en la generación e interpretación de grandes conjuntos de datos38. El primer ejemplo es el mapa de calor que muestra la totalidad de todas las celdas analizadas, organizadas por familia. Esta es una herramienta eficiente para explorar las propiedades generales de los datos y las posibles conclusiones: ¿las familias están compuestas por múltiples tipos de células o tienden a ser homogéneas en composición? ¿Las familias están distribuidas a lo largo de varias generaciones, o en su mayoría se dividen el mismo número de veces? Este análisis exploratorio debe complementarse con gráficos más específicos y pruebas estadísticas. Se puede utilizar para evaluar cuantitativamente el compromiso de destino simétrico y asimétrico, la diferenciación sin división, el equilibrio entre la autorrenovación y la diferenciación, y el número de divisiones para un destino de compromiso dado. Es fundamental, durante la planificación experimental, establecer la duración del cultivo celular de acuerdo con el tipo de pregunta formulada; Por ejemplo, para las dos primeras preguntas (equilibrio simétrico/asimétrico y diferenciación sin división), la planificación de pasos de cultivos muy cortos permite el aislamiento de un gran número de familias que han realizado sólo una o ninguna divisiónen absoluto 26. Por el contrario, los experimentos más largos permiten la exploración del número de divisiones requeridas para un compromiso celular específico, ya que muestrean familias en diferentes etapas de diferenciación. Sin embargo, este método no está diseñado para cultivos a largo plazo (2-3 semanas), ya que la dilución del colorante celular no es capaz de rastrear con precisión más de siete u ocho divisiones22. Como consecuencia, esta herramienta está adaptada principalmente para estudiar el compromiso temprano de los progenitores hematopoyéticos, y no está diseñada para sacar conclusiones sólidas sobre las propiedades de diferenciación a largo plazo de estas células.
El marco estadístico fue desarrollado específicamente para el análisis de este tipo de datos y basado en el concepto de permutaciones26. Esto fue necesario debido a la observación de una dependencia familiar en la distribución del tipo celular y en el número de divisiones realizadas. En otras palabras, las células que forman parte de la misma familia también tienen más probabilidades de mostrar fenotipos similares y dividirse el mismo número de veces. Si bien un análisis en profundidad está más allá del alcance de este trabajo, el conjunto de pruebas estadísticas proporcionadas debería ser suficiente al evaluar diferentes condiciones.
En conclusión, este protocolo constituye una valiosa herramienta para evaluar la dinámica celular de las células madre y progenitoras hematopoyéticas ex vivo, de forma rápida y económica. Debido a su flexibilidad y versatilidad en cuanto al punto de tiempo, las condiciones de cultivo y el tipo de HSPC analizadas, permite probar una variedad de condiciones experimentales. Como ensayo basado en citometría de flujo, se puede implementar en la mayoría de los laboratorios y no requiere un amplio conocimiento previo, lo que lo convierte en un buen candidato para exámenes y experimentos piloto.

La última década estuvo marcada por la difusión mundial de enfoques unicelulares para la biología celular y molecular. Siguiendo los pasos de la genómica unicelular1,2, hoy en día es posible estudiar muchos componentes de una sola célula (por ejemplo, ADN, ARN, proteínas), con nuevas técnicas de una sola célula que florecen cada año. Estas técnicas han arrojado luz sobre viejas y nuevas preguntas para los campos de la inmunología, la neurobiología, la oncología y otros, tanto utilizando células humanas como de organismos modelo3. Al resaltar las diferencias entre células individuales, las ómicas unicelulares impulsaron la definición de un nuevo modelo de hematopoyesis, centrado en la heterogeneidad de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) y alejándose del modelo clásico de poblaciones homogéneas discretas 4,5.
Uno de los pocos inconvenientes de todas las técnicas -ómicas es la destrucción de la célula de interés, lo que impide la posibilidad de evaluar su funcionalidad. Por el contrario, otros métodos unicelulares, como el ensayo de trasplante de células individuales y las tecnologías de rastreo de linaje, proporcionan una lectura de la funcionalidad de la célula ancestra al evaluar el destino de células individuales in vivo 6,7. Las tecnologías de rastreo de linaje implican etiquetar la célula de interés con un7 genético hereditario o una etiqueta fluorescente8,9, lo que permite seguir el destino de múltiples células individuales al mismo tiempo. Sin embargo, la caracterización de las células iniciales se limita típicamente a un número restringido de parámetros, como la expresión de unas pocas proteínas de superficie evaluadas por citometría de flujo10. Además, las tecnologías de rastreo de linaje de una sola célula requieren una detección laboriosa de la etiqueta celular, generalmente a través de secuenciación de ADN / ARN o imágenes. Este último punto en particular limita el número de condiciones que se pueden probar en un solo experimento.
Otra clase de métodos que se utilizan para estudiar la funcionalidad de células individuales son los sistemas de cultivo celular ex vivo de HSPC individuales. Fáciles de realizar, estos ensayos estándar de oro implican la clasificación de células individuales en recipientes de cultivo celular de 96 pocillos y, después del cultivo, caracterizando el fenotipo de la progenie celular, generalmente por citometría de flujo o análisis morfológico. Estos ensayos se han utilizado principalmente para caracterizar la diferenciación a largo plazo de las CPHS en células maduras, típicamente después de 2-3 semanas de cultivo11,12. Alternativamente, se han utilizado para tratar de mantener y expandir las HSPC ex vivo 13,14,15,16,17,18, con la promesa de un beneficio médico para el trasplante de células madre humanas 19. Por último, se han utilizado para estudiar el compromiso temprano de las HSPCs mediante cultivo a corto plazo20, siendo el bajo número de células generadas en este cultivo el principal factor limitante. Un inconveniente de estos diferentes tipos de ensayos ex vivo es que solo reflejan parcialmente la complejidad in vivo; aún así, son una de las raras formas de estudiar la diferenciación de HSPC humana.
Una pieza faltante de información de los métodos unicelulares existentes (ómicas de células individuales, rastreo de linaje y cultivo ex vivo) es la detección precisa de divisiones celulares, un parámetro esencial a considerar cuando se estudia la dinámica de HSPC21. Una forma sencilla de evaluar el número de divisiones a través de la citometría de flujo es el uso de "colorantes proteicos" solubles, como el éster succinimidílico de diacetato de 5-(y 6)-carboxifluoresceína (CFSE)22. Estos colorantes de división se difunden dentro del citoplasma de las células teñidas, y se diluyen a la mitad y pasan a las dos células hijas en cada división celular, lo que permite enumerar hasta 10 divisiones. Combinando varios tintes de división, es posible sembrar múltiples progenitores individuales en el mismo pozo, ya que cada tinte individual permite la separación de los diferentes descendientes. Este es el principio detrás del uso de colorantes celulares para el seguimiento clonal y de división múltiple que se introdujo por primera vez para los linfocitos murinos23,24.
Aquí, presentamos el desarrollo del ensayo MultiGen para su uso con HSPC murinos y humanos. Permite probar muchas células individuales simultáneamente por sus propiedades de diferenciación, división y parentesco ex vivo. Este ensayo de alto rendimiento, fácil de realizar y económico permite medir el fenotipo celular, el número de divisiones realizadas y el parentesco celular y la relación clonal con las otras células en el pozo, todo al mismo tiempo. Se puede utilizar para evaluar cuantitativamente el compromiso de destino simétrico y asimétrico, el equilibrio entre la autorrenovación y la diferenciación, y el número de divisiones necesarias para un destino de compromiso dado. El protocolo requiere un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) y un citómetro de flujo con un lector de placas, además del equipo necesario para realizar el cultivo celular. Además del protocolo técnico para la ejecución del ensayo en HSPC humanas, también proporcionamos el marco de análisis detallado, incluyendo las pruebas estadísticas necesarias para evaluar las propiedades celulares relacionadas con el concepto de familia celular25. Este protocolo ya ha sido utilizado con éxito para describir el compartimento murinoHSPC 26,27.
El siguiente protocolo utiliza células CD34+ enriquecidas magnéticamente como material de partida28. De esta manera, es posible teñir y aislar eficientemente las HSPC humanas de diferentes fuentes de sangre (por ejemplo, sangre del cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica). Es importante no descartar la fracción CD34- , ya que se utilizará como parte del protocolo para establecer diferentes tipos de controles experimentales. Las cantidades y volúmenes de celdas mencionados se pueden ampliar o reducir, de acuerdo con el flujo de trabajo y las necesidades experimentales. Del mismo modo, el protocolo se puede adaptar al estudio de diferentes tipos de progenitores, simplemente modificando los anticuerpos utilizados para los pasos de clasificación celular y citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL</td><td>vWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 15 mL</td><td>vWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 50 mL vWR</td><td></td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo con fondo en U de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano Lin APC</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-7776-72</td><td>Dilución 1/40</td></tr><tr><td>ARIA III</td><td>BD</td><td></td><td>Se puede reemplazar con cualquier clasificador FACS capaz de clasificar celdas individuales en una placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>C34570</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trace Violet (CTV)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de compensación&nbsp;</td><td>BD</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62948-36</td><td>Preparar una solución 0,5 M, en agua esterilizada</td></tr><tr><td>bloque FC Fc1.3216</td><td>BD</td><td>564220</td><td>Dilución 1/50</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Dutscher</td><td>S1900-500C</td><td>Lote S00CH</td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD10 PerCP-5.5, clon HI10a</td><td>Biolegend</td><td>312216</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD123 BUV395, clon 7G3</td><td>BD</td><td>564195</td><td>Dilución 1/15</td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD34 APC-Cy7, clon 581</td><td>Biolegend</td><td>343513</td><td>Dilución 1/40</td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD38 BV650, clon HB7</td><td>Biolegend</td><td>356620</td><td>Dilución 1/40</td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD45RA AF700, clon HI100</td><td>BD</td><td>560673</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD45RA PE-Cy7, clon HI100</td><td>BD</td><td>560675</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Ratón antihumano CD90 PE, clon 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Dilución 1/20</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X</td><td>Life Technologies</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles de polipropileno de 12x75 mm</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZE5&nbsp;</td><td>Biorad</td><td></td><td>Puede sustituirse por cualquier analizador de citometría de flujo equipado con un lector de placas</td></tr><tr><td><fuerte>Preparado</td> en laboratorio</fuerte>medios de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cultivo celular</td> Depende del experimento específico.<td></td><td></td><td> Prepare fresco todos los días y almacene a +4 &deg; C hasta su uso</td></tr><tr><td>DMEM + 10% FBS</td><td></td><td></td><td>Se puede almacenar en condiciones estériles, a +4 & grados; C hasta 1 año. Para preparar 500 mL, agregue 50 mL de FBS a 450 mL DMEM</td></tr><tr><td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td><td></td><td></td><td>Se puede almacenar en condiciones estériles, a temperatura ambiente, hasta 1 año. Para preparar 500 mL, agregue 3.42 mL de EDTA 0.5 M a 500 mL PBS 1X</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de tinción <td>Se puede almacenar en condiciones estériles, a +4 & grados; C hasta 1 año. Para preparar 500 mL, agregue 2 mL de EDTA 0.5 M y 1 mL de FBS a 500 mL de PBS 1X</td></tr></tbody></table>

evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Pocas técnicas pueden evaluar el fenotipo y el destino de la misma célula simultáneamente. La mayoría de los protocolos actuales utilizados para caracterizar el fenotipo, aunque capaces de generar grandes conjuntos de datos, requieren la destrucción de la célula de interés, lo que hace imposible evaluar su destino funcional. Por lo tanto, los sistemas de diferenciación biológica heterogéneos como la hematopoyesis son difíciles de describir. Sobre la base de los tintes de seguimiento de la división celular, desarrollamos un protocolo para determinar simultáneamente el parentesco, el número de división y el estado de diferenciación para muchos progenitores hematopoyéticos individuales. Este protocolo permite evaluar el potencial de diferenciación ex vivo de progenitores hematopoyéticos murinos y humanos, aislados de diversas fuentes biológicas. Además, como se basa en citometría de flujo y un número limitado de reactivos, puede generar rápidamente una gran cantidad de datos, a nivel de una sola célula, de una manera relativamente económica. También proporcionamos la tubería analítica para el análisis de una sola célula, combinada con un marco estadístico robusto. Como este protocolo permite la vinculación de la división y diferenciación celular a nivel de una sola célula, se puede utilizar para evaluar cuantitativamente el compromiso de destino simétrico y asimétrico, el equilibrio entre la autorrenovación y la diferenciación, y el número de divisiones para un destino de compromiso dado. En conjunto, este protocolo se puede utilizar en diseños experimentales con el objetivo de desentrañar las diferencias biológicas entre los progenitores hematopoyéticos, desde una perspectiva unicelular.

Aquí se presenta una técnica basada en citometría de flujo que permite medir simultáneamente el número de divisiones celulares, el fenotipo celular superficial y el parentesco celular. Esas propiedades se pueden probar estadísticamente utilizando un marco basado en permutaciones.

Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Pocos métodos permiten evaluar rápidamente la funcionalidad de los progenitores hematopoyéticos. Este protocolo mide el impacto de las primeras divisiones celulares en el destino y el compromiso celular. Este protocolo permite medir simultáneamente la división y diferenciación a nivel de una sola célula y con un alto rendimiento sin requerir una manipulación compleja y extensa.Este método es adecuado para cualquier población hematopoyética que pueda mantenerse en cultivo. Por lo tanto, se puede aplicar fácilmente a la biología del cáncer, la inmunología y la biología del desarrollo. Para empezar, alícuota 250 microlitros de la fracción CD34+ igualmente en cuatro tubos de polipropileno de 15 mililitros.Etiquete los tubos como se describe en el texto manuscrito. Alícuota 250 microlitros de la fracción CD34 en otros cuatro tubos de polipropileno de 15 mililitros y etiquete los tubos. Prepare soluciones CFSE altas y CSFE bajas como se describe en el texto manuscrito.Agregue 250 microlitros de la solución CFSE alta al tubo CF y CV, 250 microlitros de la solución baja CFSE al tubo VC y 250 microlitros del Medio Águila Modificada de Dulbecco, o DMEM, sin suero bovino fetal, o FBS, al tubo VI. Para garantizar una mezcla eficiente de suspensión celular en tinte celular, incline el tubo 90 grados y deposite las soluciones CFSE en la pared del tubo. Luego, sostenga el tubo verticalmente y mezcle tres o cuatro veces para garantizar una mezcla rápida de las soluciones CFSE con las celdas resuspendidas.Incubar la suspensión a 37 grados centígrados durante ocho minutos. Después de la incubación, agregue cinco mililitros de DMEM que contengan 10% FBS y coloque los tubos a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Gire los tubos a 300 G durante cinco minutos.Retire el sobrenadante por aspiración sin alterar el pellet y lave el pellet con cinco mililitros de PBS, ETDA. Gire los tubos de nuevo y deseche el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 40 microlitros de PBS, ETDA. Para teñir las células CD34+, prepare una mezcla maestra de anticuerpos en un solo tubo de 0,5 mililitros.Agregue siete microlitros de la mezcla maestra de anticuerpos a cada una de las cuatro condiciones CD34 +. Resuspender las células en tampón de tinción utilizando aproximadamente 500 microlitros cada uno para las perlas en células CD34 + y un mililitro para los tubos CD34. Para la ordenación de celdas, establezca la estrategia de compuerta creando diagramas de puntos.Primero, visualice las celdas en un diagrama de puntos FSCA versus SSCA y haga doble clic en la herramienta de activación de polígonos para seleccionar la población con dispersión lateral baja. Etiquete esta puerta recién creada como Celdas. En el siguiente diagrama de puntos, FSCA versus FSCH, haga clic derecho en el gráfico y seleccione las celdas de la puerta en el menú desplegable haciendo clic en él.Utilice la misma herramienta de compuerta para seleccionar una población estrecha en la diagonal entre los dos ejes. Etiquete esta puerta como celdas individuales. En el tercer diagrama de puntos, APC versus FSH-H, muestra las células individuales de la población y las celdas son negativas para la expresión del linaje de APC.Etiquete a esta población recién creada como linaje negativo. En la cuarta gráfica, CFSE versus CTV, muestra la población Linaje Negativo y crea cuatro puertas separadas, una para cada combinación de tinte. La puerta VI se muestra aquí como ejemplo.Utilice la quinta y sexta gráficas para identificar los progenitores de interés. Generosamente la puerta CD34+CD38-población y CD34+CD38+en la quinta gráfica. Luego, seleccione la población CD34 + CD38 en la sexta gráfica y dibuje tres puertas para LMPP, HSC y MPP.Ejecute las fracciones CD34+, registrando al menos 5.000 eventos en la puerta de celda única. Ajuste la puerta para cada combinación de tinte, estableciendo una puerta apretada para seleccionar una población homogénea. Prepare la plantilla de clasificación de placas mediante el diseño Ordenación experimental.Los pozos llamados CD34- contienen 5, 000 a 10, 000 células clasificadas en la puerta CF, CV, VC, VI. Los pocillos a granel contienen 500 células clasificadas en la puerta CD34 + CD38: los pocillos de una sola célula contienen solo un evento por combinación de colorante de división celular por pozo, por lo que cuatro eventos por pozo en total. A continuación, comience clasificando el CD34-CF en modo de pureza de rendimiento.Haga clic en el botón Adquirir y luego en el botón Ordenar. Haga clic en Adquirir y, a continuación, en el botón Ordenar, asegurándose de haber marcado 0160 como grado de pureza. Finalmente, ordene las celdas de interés, una celda por pocillo, en pureza de celda única, asegurándose de haber marcado la opción Clasificación de índice.Centrifugar la placa a 300 G durante cinco minutos y retirar el sobrenadante invirtiendo rápidamente la placa debajo de la capucha sobre una toalla de papel. Agregue ocho microlitros de tampón de pie a los pozos A1 a A4, seguido de agregar ocho microlitros de la mezcla a los otros pocillos. Lave las células agregando 100 microlitros de tampón de tinción por pocillo usando una pipeta multicanal.Centrifugar y retirar el sobrenadante antes de resuspender las células en 85 microlitros de tampón de tinción. Inicie el análisis en el citómetro de flujo en modo de adquisición utilizando la plantilla dedicada y haciendo clic en Personalizado. Después de seleccionar los fluoróforos de interés de la lista, establezca la configuración de la placa siguiendo la plantilla de placa corregida para el número de pocillos que contienen al menos una celda.Marque la opción Agitación y seleccione 100 microlitros como límite de volumen de adquisición. Luego, establezca la tasa de adquisición no superior a un microlitro por segundo, ya que una velocidad más baja mejora el volumen total analizado por pozo. Para un gating representativo, concatenar los diferentes pozos a granel en un solo archivo.Después de hacer clic en la opción Concatenar poblaciones, seleccione Todos los parámetros no compensados en el menú Parámetros, luego haga clic en Concatenar. Cargue el archivo concatenado en el espacio de trabajo y, a continuación, aplique la matriz de compensación mediante arrastrar y soltar. Las etiquetas de celdas con CV y VC necesitan un valor transformado.Haga clic en Herramientas y Derivar parámetro para obtener el valor transformado. Pegue la fórmula indicada en el cuadro de fórmula. Aplique el gating a cada color individualmente como un diagrama de histograma.Para CF y VI, establezca CFSE-A y CTV-A en el eje X, respectivamente. Para CV y VC, establezca el parámetro recién derivado en el eje X y, a continuación, establezca las puertas correspondientes a cada pico. Aplique el gating a cada célula individual bien.Asegúrese de agregar el parámetro derivado a cada pozo analizado. Verifique manualmente cada puerta de color para cada pocillo para detectar eventos que se asignan incorrectamente a un pico determinado. El análisis de citometría de flujo después del cultivo celular requiere una activación precisa para establecer el parentesco de cada célula individual junto con el fenotipado celular.La definición y asignación de picos son aspectos cruciales del análisis de citometría de flujo. Los histogramas muestran dos ejemplos de familias distribuidas en múltiples picos, uno de dos picos de intensidad similares y otro con dos picos de intensidad diferentes. Aquí se muestran diferentes tipos de representación de datos y pruebas estadísticas para dos experimentos separados realizados después de 72 horas para HSC y MPP.El mapa de calor para la condición de diferenciación HSC representa diferentes familias celulares, tanto en destinos celulares como en divisiones celulares. Aquí se muestra el histograma que compara las familias de células derivadas de HSC y MPP de destino. Para ambos tipos de células, la comparación entre la condición GT y la diferenciación de la condición se muestra junto con las pruebas estadísticas realizadas para los MPP.Aquí se muestran histogramas que comparan el porcentaje de familias celulares por generación y el tipo de simetría o asimetría en el destino para la primera división. La distribución de destinos por generación para MPP y la diferenciación de condiciones se muestran aquí. Este procedimiento requiere aislar las células a granel para establecer la estrategia de acceso adecuada.Por lo tanto, es mejor comenzar la tinción con al menos 10, 000 células. La combinación de este método con la medición continua, como la imaginación de células vivas, puede ser muy poderosa, ya que los dos juntos pueden proporcionar una descripción detallada de los primeros progenitores de la dinámica celular. Este enfoque fue desarrollado por primera vez para la biología de células T por los Laboratorios Hopkins.Esta versión, adaptada para las células madre sanguíneas, ahora se está expandiendo al cáncer y la biología de las células madre.

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Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

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