Name: Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a generar y mantener células madre pluripotentes inducidas de primates a partir de células urinarias mediante un protocolo no invasivo con virus Sendai. Este método facilita la investigación en biología de células madre y medicina regenerativa.

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Este trabajo fue apoyado por DFG EN 1093/5-1 (proyecto número 458247426). M.O. fue apoyado por JSPS Overseas Research Fellowship. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com. La citometría de flujo se realizó con la ayuda de la citometría de flujo de la instalación central en el Centro Biomédico de Munich. Nos gustaría agradecer a Makoto Shida y Tomoyo Muto de ASHBi, Universidad de Kyoto, por el apoyo a la videografía.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las iPSC son tipos de células valiosas, ya que permiten la generación de tipos de células in vitro que de otro modo serían inaccesibles. Como los materiales de partida para la reprogramación, por ejemplo, los fibroblastos no están fácilmente disponibles de todas las especies de primates, este artículo presenta un protocolo para la generación de iPSCs a partir de células derivadas de la orina. Estas células se pueden obtener de manera no invasiva, incluso a partir de muestras de orina de primates no estériles, co...

Las comparaciones genómicas de primates humanos y no humanos (NHP) son cruciales para comprender nuestra historia evolutiva y la evolución de los rasgos específicos de los humanos1. Además, estas comparaciones permiten inferir la función mediante la identificación de secuencias de ADN conservadas2, por ejemplo, para priorizar las variantes asociadas a la enfermedad3. Las comparaciones de fenotipos moleculares, como los niveles de expresión génica, son cruciales para interpretar mejor las comparaciones genómicas y descubrir, por ejemplo, las diferencias fenotípicas celulares. Además, tienen, similar a las comparaciones a nivel de ADN, el potencial de inferir relevancia funcional y, por lo tanto, de interpretar mejor la variación médicamente relevante dentro de los humanos4. La incorporación de datos fenotípicos moleculares completos en estos estudios comparativos requiere recursos biológicos apropiados (es decir, células ortólogas en todas las especies). Sin embargo, razones éticas y prácticas hacen que sea difícil o imposible acceder a tales células comparables, especialmente durante el desarrollo. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) permiten la generación de tales tipos de células inaccesibles in vitro5,6, son experimentalmente accesibles y se han utilizado para comparaciones de primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Para generar iPSCs, uno necesita adquirir las células primarias para ser reprogramadas. Las células aisladas de la orina tienen la ventaja de que pueden ser muestreadas de forma no invasiva de primates, y que pueden ser fácilmente reprogramadas, probablemente debido a sus perfiles moleculares similares a las células madre15. Las condiciones de cultivo para mantener las iPSCs de primates son tan importantes como la reprogramación; Clásicamente, el cultivo de células madre pluripotentes humanas requería un medio no definido, basado en suero y cocultivo de fibroblastos embrionarios de ratón - las llamadas células de alimentación - que proporcionan nutrientes esenciales y un andamio para las células madre embrionarias (ESC)16. Desde el desarrollo de sistemas de cultivo químicamente definidos y sin alimentadores17,18, ahora hay varias opciones de medios de cultivo y matrices iPSC disponibles comercialmente. Sin embargo, la mayoría de estas condiciones de cultivo se han optimizado para ESC e iPSC humanas y, por lo tanto, podrían funcionar menos bien en la cultura NHP iPSC. En este protocolo de video, proporcionamos instrucciones para generar y mantener iPSCs humanas y NHP derivadas del cultivo de células urinarias.
Desde el primer informe de generación de iPSC por la expresión forzada de factores definidos en fibroblastos en 2006, este método se ha aplicado a muchos tipos celulares diferentes de diversos orígenes 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Entre ellos, solo se pueden obtener células derivadas de la orina de una manera completamente no invasiva. Con base en el protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, se pueden aislar y expandir células de orina de primates, incluso de muestras no estériles, complementando antibióticos de amplio espectro15. En particular, las células derivadas de orina muestreadas por este protocolo exhiben un alto potencial para producir iPSCs, en un período de tiempo más corto (las colonias se hacen visibles en 5-15 días) que la reprogramación convencional de fibroblastos (20-30 días, en nuestra experiencia), y con una tasa de éxito suficientemente alta. Estas células derivadas de la orina fueron clasificadas como la población mixta de células madre mesenquimales similares a células madre y células epiteliales de la vejiga, causando la alta eficiencia de reprogramación15.
Además de la variación en las celdas primarias, los métodos de reprogramación para generar iPSC también varían según el propósito del uso. Los procedimientos convencionales de reprogramación para células somáticas humanas se llevaron a cabo mediante la sobreexpresión de factores de reprogramación con vectores de retrovirus o lentivirus, lo que permitió la integración de ADN exógeno en el genoma 5,34,35. Para mantener las iPSC generadas genómicamente intactas, los investigadores han desarrollado una amplia variedad de sistemas de no integración: vector PiggyBac36,37 extirpable, vector episomal38,39, vectores de virus no integradores como el virus Sendai 40 y el adenovirus 41, transfección de ARNm42, transfección de proteínas 43,44 y tratamiento con compuestos químicos 45. Debido a la eficiencia y facilidad en el manejo, los vectores de reprogramación basados en virus Sendai se utilizan en este protocolo. La infección de las células primarias se realiza en un cultivo en suspensión de 1 h de células y virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 antes del recubrimiento. Este paso modificado podría aumentar la probabilidad de contacto entre las superficies celulares y los virus, en comparación con el método convencional en el que los virus se agregan directamente al cultivo celular adherente, y así producir más colonias de iPSC15.
El paso de células madre pluripotentes humanas y NHP se puede hacer mediante el paso de grupos y el paso de células individuales. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es un agente quelante rentable que se une a los iones de calcio y magnesio y, por lo tanto, impide la actividad adherente de la cadherina y la integrina. El EDTA también se utiliza como un reactivo de disociación selectiva suave, ya que las células indiferenciadas se desprenden antes que las células diferenciadas debido a sus diferentes moléculas de adhesión. La disociación completa induce la muerte celular masiva de las iPSC de primates a través de la hiperactivación de la miosina mediada por la bobina enrollada asociada a Rho/Rho (Rho/Rock). Por lo tanto, la suplementación del medio de cultivo con un inhibidor de Rho/Rock es esencial para experimentos que requieren células individuales en suspensión46,47. En este protocolo, recomendamos el paso por grupos como el método de paso de rutina y recomendamos el paso de una sola célula solo cuando sea necesario, por ejemplo, cuando se requiere la siembra de números de células definidos o durante la subclonación.

<table><tbody><tr><td>Accumax&trade; solución de desprendimiento de células (Solución de desprendimiento)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B-Solution</td><td>Merck</td><td>A2941-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de ratón antihumano TRA-1-60&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60064</td><td>Dilución: 1/200</td></tr><tr><td>Anticuerpo conjugado TRA-1-60 PE antihumano &nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-122-965</td><td>Dilución: 1/50</td></tr><tr><td>Bambanker&trade; (Medio de congelación de células)</td><td>Nippon Genetics</td><td>BB01</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Placa multipocillo para cultivo celular, 12 pocillos CELLSTAR</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Countess&trade; II contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific AMQAX1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoKing&1.5 mL Tubos con código de barras 2D (Cryotubes)</td><td>Sued-Laborbedarf</td><td>52 95-0213</td><td>Se pueden utilizar diferentes tipos de criotubos para la congelación. Los tubos de código de barras 2D tienen la ventaja de que la información de la muestra se puede almacenar en una base de datos con información única del tubo.</td></tr><tr><td>CytoTune&trade; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16519</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune&trade;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenilindol diclorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucosa</td><td>TH. Geyer</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15373541</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor&trade; 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor&trade; 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21207</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td>DPBS sin Calcio sin Magnesio</td><td>TH. Geyer</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM Anticuerpo policlonal recombinante para conejos (22 HCLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>710524</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA)</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL fondo cónico</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 mL fondo cónico</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor, Brasil (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10.8.2</td><td>FlowJo&nbsp;</td><td></td><td></td>663441</tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&trade; Matriz de membrana basal sin LDEV, con calificación hESC, factor de crecimiento reducido Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade; Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 240i incubadora de CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>16416639</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus HeraSafe armario de seguridad</td><td>Kendro</td><td>51017905</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF, de primera calidad</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-749</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>Fiji</td><td>Versión 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific 11140035</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrifugación PP, 1,5 mL</td><td>Microscopio Nerbe Plus</td><td>04-212-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-alfa-fetoproteína de ratón</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>Anticuerpo de actina anti-alfa-músculo liso de ratón</td><td>R& D Systems</td><td></td><td>MAB1420 Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>Anticuerpo de tubulina anti-beta-III de ratón</td><td>R& D Systems</td><td></td><td>MAB1195 Dilución: 1/100</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1</td><td>STEMCELL Technolgies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4903S</td><td>Dilución: 1/400</td></tr><tr><td>normocure&trade; (Reactivo antimicrobiano)</td><td>Invivogen</td><td>ant-noc</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Anticuerpo de conejo &nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2750S</td><td>Dilución: 1/400</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml) (PS)</td>La mezcla de penicilina-estreptomicina <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>contiene 100 U/mL de penicilina y 100 &micro; g/mL de estreptomicina.</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-básico</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa refrigerada</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>4-16KS</td> Medio basal de células epiteliales renales ATCC PCS-400-030 Kit de crecimiento de células epiteliales <td></td></tr><tr><td>renales</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-040</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 (L1D6A2) mAb de ratón #4900</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4900S</td><td>Dilución: 1/400</td></tr><tr><td>SSEA4 (MC813) mAb de ratón</td><td>NEB</td><td>4755S</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> StemFit&reg;<td></td></tr><tr><td> Basic02</td><td>Nippon Genetics</td><td>3821.00</td><td>La producción de este medio se suspendió, utilizando StemFit Basic04CT para líneas celulares humanas o StemFit Basic03 para primates no humanos en su lugar.</td></tr><tr><td>Tritón X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade; Seleccione Enzima (1x), sin rojo de fenol (Enzima de disociación)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath Precision GP 05</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, Sal de diclorhidrato (Inhibidor de roca)</td><td>Biozol</td><td>BYT-ORB153635</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de dilución de anticuerpos <td>Para la composición, consulte el suplemento tabla S1</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de bloqueo <td>Para la composición, véase la tabla complementaria S1</td></tr> Medio <tr><td>REMC</td><td></td><td></td><td>Para la composición, véase la tabla complementaria S1</td></tr><tr><td>Medio urinario primario</td><td>Para la composición, véase la tabla complementaria S1</td>Medio de <td></td><td></td></tr><tr><td>cultivo</td><td></td><td></td> PSC <td>Para la composición, véase la tabla complementaria S1</td></tr> Medio de <tr><td>generación PSC</td><td></td><td></td><td>Para la composición, véase la tabla complementaria S1</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lavado <td>de orina Para conocer la composición, véase la tabla complementaria S1</td></tr></tbody></table>

generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Los enfoques entre especies que estudian las células madre pluripotentes de los primates y sus derivados son cruciales para comprender mejor los mecanismos moleculares y celulares de la enfermedad, el desarrollo y la evolución. Para hacer que las células madre pluripotentes inducidas por primates (iPSC) sean más accesibles, este documento presenta un método no invasivo para generar iPSC de primates humanos y no humanos a partir de células derivadas de la orina, y su mantenimiento utilizando un método de cultivo sin alimentador.
La orina puede ser muestreada de un ambiente no estéril (por ejemplo, la jaula del animal) y tratada con un cóctel antibiótico de amplio espectro durante el cultivo celular primario para reducir la contaminación de manera eficiente. Después de la propagación de las células derivadas de la orina, las iPSC se generan mediante un método de transducción modificado de un sistema vectorial del virus Sendai disponible comercialmente. Las primeras colonias de iPSC ya pueden ser visibles después de 5 días, y se pueden recoger después de 10 días como muy pronto. El paso de grumos de rutina con tampón de disociación libre de enzimas apoya la pluripotencia de las iPSC generadas durante más de 50 pasajes.

Al aislar células de la orina humana y NHP, se pueden identificar diferentes tipos de células directamente después del aislamiento. Las células escamosas, así como varias células redondas más pequeñas, se excretan con la orina; la orina femenina contiene muchas más células escamosas que la orina masculina (Figura 1B - Día 0; Figura suplementaria S1). Después de 5 días de cultivo en medio urinario primario, se pueden ver las primeras células adherentes en proliferación (<stro...

El presente protocolo describe un método para aislar, expandir y reprogramar células derivadas de orina de primates humanos y no humanos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC), así como instrucciones para el mantenimiento sin alimentador de las iPSC recién generadas.

Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Las IPSC de primates son útiles pero a menudo difíciles de obtener debido a cuestiones éticas y técnicas. Este protocolo proporciona una ruta más accesible para la generación y el mantenimiento de IPSC de primates. El uso de células urinarias como fuente primaria de IPSC tiene una gran ventaja, ya que se pueden obtener de una manera completamente no invasiva sin ninguna técnica especial.Demostrando el procedimiento estará Jessica Radmer, estudiante de doctorado de Wolfgang M.S.Laboratory. Para comenzar, centrifugar el tubo que contiene orina a 400 G durante 10 minutos. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro en el tubo y vuelva a suspender el pellet en él.Lave las células agregando 10 mililitros de tampón de lavado de orina que contenga anfotericina y mezcle cuidadosamente la suspensión con una pipeta serológica. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente menos de 0,2 mililitros en el tubo. Resuspender el pellet celular en un mililitro de medio urinario primario que contenga anfotericina por 50 mililitros de orina procesada inicialmente.Retire la gelatina y agregue un mililitro de la suspensión en un pocillo de gelatina recubierto de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Para preparar una matriz de membrana basal recubierta de 12 pocillos, agregue 500 microlitros de matriz de membrana basal por pozo.Mueva la placa para distribuir el líquido e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, reemplace la matriz de la membrana basal con 900 microlitros de medio REMC y guárdela a 37 grados centígrados hasta su uso. Calcule el volumen de virus Sendai necesarios para una multiplicidad de infección de cinco usando la ecuación.Descongele rápidamente los componentes del kit de reprogramación Sendai en el baño de agua templado a 37 grados centígrados. Agregue el medio REMC para un total de 100 microlitros a un tubo antes de agregar el volumen calculado de virus Sendai y mezclar. Después de la disociación de las células urinarias como se describe en el manuscrito, cuente las células usando el contador de células y transfiera el número deseado de células a un tubo de 1,5 mililitros.Obtener el pellet por centrifugación y resuspenderlo en 100 microlitros de la mezcla preparada del virus Sendai. Incubar el tubo durante una hora a 37 grados centígrados para la infección de la suspensión. Después de la incubación, agregue REMC a un total de un mililitro antes de sembrar la suspensión celular en la matriz de membrana basal recubierta con la placa de 12 pocillos.Después de la transducción, cambie el medio cada dos días hasta el desarrollo de colonias de células madre pluripotentes inducidas, o IPSC, con el cambio al medio de generación de PSC en el quinto día. Cuando las colonias de IPSC crezcan lo suficientemente grandes como para el paso de grumos, aspire el medio de las células cultivadas y lave cuidadosamente las células con 500 microlitros de DPBS. Después de retirar el DPBS, agregue 500 microlitros de EDTA 0.5 milimolar al pozo e incube durante dos a cinco minutos.Observe cuidadosamente las células bajo el microscopio hasta que las colonias comiencen a desprenderse. Cuando los bordes de las colonias comiencen a desprenderse y los espacios entre las células se hagan visibles, retire el EDTA y agregue cuidadosamente 500 microlitros de DPBS. Aspirar el DPBS y enjuagar el pozo con 500 microlitros de medio de cultivo PSC utilizando una pipeta P-1000.Pipetear hacia arriba y hacia abajo para dispersar las colonias en grupos de tamaño apropiado. Dependiendo de la confluencia, la densidad deseada de las células sembradas y la preferencia clonal IPSC, transfiera 1/10 a 1/50 de la suspensión del grupo celular a los nuevos pocillos. Mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás varias veces para distribuir los grupos uniformemente en el pozo.Incubar la placa durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados para dejar que los grupos se adhieran. Cambie el medio cada dos o tres días hasta que las colonias crezcan lo suficiente como para pasar. Después del aislamiento, se pueden ver células escamosas y varias células redondas más pequeñas que se excretaron con la orina.Se pueden ver las primeras células adherentes en proliferación, y estas células se convierten en grandes colonias que pueden pasar. Se pueden ver dos tipos de células distintas, una con un fenotipo epitelial y la otra que muestra un fenotipo más mesenquimal con forma alargada. Después del primer paso, las células urinarias crecen como una monocapa.Durante la generación de IPSC, se pueden ver algunas células adherentes y estas células comienzan a mostrar cambios morfológicos, lo que indica la reprogramación de las células. Además, las células que forman colonias muestran la morfología típica de células madre embrionarias. Todas las IPSC generadas comparten la morfología típica de colonia similar a una célula madre embrionaria, caracterizada por células apretadas con bordes claramente definidos.Se utilizó inmunocitoquímica para probar la expresión de marcadores asociados a la pluripotencia en IPSC de gorila. Además, el análisis de citometría de flujo mostró que las IPSC de orangutanes analizadas son positivas para TRA-1-60. Además, los IPSC de gorila son capaces de diferenciarse en linajes de endodermo, mesodermo y ectodermo.Un mayor número de celdas diferenciadas y una pérdida de integridad y uniformidad de los límites indican una mala calidad del IPSC. Por el contrario, los bordes definidos, el empaquetamiento celular hermético y los nucléolos prominentes significan IPSC de alta calidad. Debido a la variabilidad coronal, es necesario optimizar las condiciones específicas del clon, como la relación de división, el tiempo de paso y el tamaño del grupo para mantener las IPSC de primates creciendo sanas.Como controles de calidad de las IPSC establecidas, se puede verificar la prepotencia mediante la inducción de diferenciación directa o indirecta, como la diferenciación de EV in vitro, además de verificar la expresión génica marcadora.

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Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

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Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

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Para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la próstata primeros sistemas innovadores modelos humanos y enfoques cáncer de iniciación, la novela y se necesitan desesperadamente. El potencial de pre-prostática seno urogenital mesénquima (UGSM) para inducir a las poblaciones de células madre pluripotentes para formar el epitelio de próstata humano es una poderosa herramienta experimental en la investigación de próstata.

La formación del epitelio prostático humano utilizando tejido recombinación de roedores Urogenital mesénquima seno y células madre humanas

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

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En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Este manuscrito describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos a través de la reprogramación episomal en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y la posterior diferenciación en podocitos.

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