Name: Aislamiento y purificación del β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende el aislamiento y purificación de β-glucanos fúngicos para inmunoterapia contra el glioblastoma usando células BV2 y técnicas analíticas avanzadas. Este protocolo demuestra su potencial inmunomodulador.

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Nos gustaría agradecer a la Dra. Vasiliki Economopoulos por su guión interno para medir la señal de fuluorescencia en ImageJ. También queremos agradecer al CITIUS (Universidad de Sevilla) y a todo su personal por su apoyo durante la demostración. Este trabajo ha contado con el apoyo de la empresa española FEDER I+D+i-USE, US-1264152 de la Universidad de Sevilla, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

Las cuatro variantes diferentes de hongos descritas en este protocolo se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).
1. Aislamiento de β-glucanos fúngicos
<ol><li>Extracción y aislamiento de polisacáridos solubles de hongos NOTA: Los polisacáridos solubles de hongos (SMP) se obtuvieron de acuerdo con el procedimiento esquemáticamente mostrado en la Figura 1.<ol><li>Enjuague suavemente los cuerpos fructíferos frescos de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum (aproximadamente 2,000 g / hongo) en agua destilada cinco veces.</li>
		<li>Secar los cuerpos frutales a 50 ± 2 °C en un horno de secado al aire convencional hasta alcanzar un peso constante (~24 h).</li>
		<li>Moler los champiñones secos en un molino de cuchillas, obteniendo unos 200 g de polvo de cada hongo.</li>
		<li>Suspender 100 g de hongos en polvo (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus y G. lucidum) en 1.000 mL deH2Od. A continuación, autoclave a 121 °C durante 15 min, y finalmente dejar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión resultante a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Secar el precipitado que contiene polisacáridos de setas insolubles (IMP) a 50 ± 2 °C en un horno de secado al aire durante 24 h.</li>
		<li>Deseche el precipitado y conserve el sobrenadante. Concentrar el sobrenadante 10 veces en un evaporador rotativo.</li>
		<li>Precipitar el concentrado que contiene SMP con etanol (80% de concentración final) a 4 °C durante la noche.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión de etanol a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C, retener el pellet (precipitado) y desechar el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Lavar el precipitado tres veces con etanol al 80% antes de disolverlo enH2Od(10% p/v). Ajustar el pH a 6.5/7 y la temperatura a 37 °C, y tratar con 2 u y 4 U de α-amilasa y glucoamilasa, respectivamente, para solubilizar α-glucanos siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Después del tratamiento con α-amilasa/glucoamilasa, ajustar el pH y la temperatura a 8,0 y 50 °C, respectivamente, y tratar con alcalasa (2,5 U/g de proteína) (ver Tabla de materiales) para solubilizar las proteínas. NOTA: Este tratamiento enzimático secuencial elimina la mayoría de los α-glucanos y proteínas que coprecipitan con β-glucanos en la precipitación de etanol.</li>
		<li>Después de la hidrólisis, centrifugar el hidrolizado a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C, y el sobrenadante limpio concentrar cinco veces en un evaporador rotativo. Precipitar de nuevo con etanol al 80%.</li>
		<li>Solubilizar el precipitado resultante enH2ODy dializar en agua destilada durante 24 h utilizando membranas de tubos de celulosa (membranas de corte de 12.000 Da; ver Tabla de materiales) para eliminar moléculas de bajo peso molecular. Recupere la porción soluble en agua y liofilifíquela para producir β-glucanos solubles (SβGs).</li>
	</ol></li>
	<li>Medición de azúcar y proteínas<ol><li>Medir el contenido total de azúcar de cada fracción por el método de ácido fenol-sulfúrico, utilizando la glucosa como estándar8. NOTA: La cuantificación del contenido de β-glucano también se puede hacer utilizando el kit de ensayo de β-glucano (hongos y levadura; ver Tabla de materiales), basado en la hidrólisis enzimática y la actividad de las oxidorreductasas: a saber, exo-1,3-β-glucanasa, glucosa oxidasa, β-glucosidasa y peroxidasa, con la posterior formación de la quinoneimina. Siga las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones.</li>
		<li>Utilice 18 MH 2 SO4 en lugar de 12 MH2SO4.</li>
		<li>Evalúe el contenido de los glucanos totales y α-glucanos por separado.</li>
		<li>Mida los valores de β-glucano resultantes como la diferencia entre los valores de glucano total y α-glucano (triplicado) siguiendo el protocolo Kjeldahl. En ciertos casos, el contenido de proteína puede determinarse por el método de Lowry, utilizando albúmina para trazar la curva de calibración11,12.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de espectroscopia de absorción ultravioleta<ol><li>Obtenga los espectros ultravioleta (UV) SβG utilizando un espectrofotómetro UV-visible (ver Tabla de materiales) escaneando las muestras en la región de 200-400 nm (Figura 2).</li>
		<li>Preparar 1,0 mg/ml de cada SβG enH2OD, transferir la solución a una cubeta de cuarzo y escanear a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de distribución de peso molecular<ol><li>Estimar la homoegeneidad de SβGs y el peso molecular de los polímeros por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (ver Tabla de materiales) equipado con un detector de índice de refracción y una columna lineal de filtración de gel ultrahidrogel (300 mm x 7,8 mm; Figura 3).</li>
		<li>Realizar el ensayo a 40 °C utilizando agua desionizada como eluyente a un caudal de 0,5 ml/min-1 y dextranos (110, 80 y 50 kDa) como patrones (ver Tabla de materiales). Recoja una fracción de 5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR)<ol><li>Registre los espectros infrarrojos (Figura 4) en un espectrómetro FTIR en el rango de 4000-500 cm-1. Las muestras deben mezclarse previamente con KBr para formar películas (procedimiento FTIR estándar; consulte las instrucciones del fabricante y la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de composición molecular<ol><li>Estimar las composiciones moleculares de SβGs mediante cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), siguiendo procedimientos estándar12.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estudio in vitro de la estimulación de la microglía inducida por β-glucano
<ol><li>Cultivo celular de células de glioblastoma y microglía de ratón en portaobjetos de cámara de 8 pocillos NOTA: Este protocolo es específico para las líneas celulares GL261 (glioblastoma) y BV2 (microglia). Sin embargo, con ligeras modificaciones, estos pasos podrían usarse potencialmente para estudiar otras líneas celulares cancerosas e inmunitarias.<ol><li>Prepare el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco modificado con L-glutamina, 4,5 g/L de D-glucosa y sin piruvato. Agregue 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabla de materiales). Precaliente el material en un baño maría a 37 °C durante 15 min.</li>
		<li>Descongele las alícuotas BV2 y GL261 congeladas en un baño maría (37 °C) durante 2 min, y justo antes de descongelarlas por completo, llévelas a una campana de flujo laminar y coloque las células en dos matraces T25 estériles diferentes (uno para cada línea celular).</li>
		<li>Incubar los matraces T25 a 37 °C, 5%CO2 hasta que el cultivo sea confluente. NOTA: Dependiendo de las condiciones de congelación y el tiempo bajo criopreservación, el tiempo hasta la confluencia puede variar. Estas líneas celulares suelen requerir entre 3 y 5 días para alcanzar la confluencia en un matraz T75.</li>
		<li>Después de que el cultivo celular BV2 se vuelva confluente, transfiéralo a portaobjetos de cámara de 8 pocillos 0.6 x 106 células/pocillo. Mantenga los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos en la incubadora durante 24 h.</li>
		<li>Una vez que las células microgliales estén colocadas en los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos, repita el mismo protocolo con las células GL261.</li>
	</ol></li>
	<li>Activación de la microglía con β-glucanos<ol><li>Cubra las células BV2 con cuatro β-glucanos diferentes (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus) a una concentración de 0,2 mg/ml durante 72 h. Una condición experimental debe permanecer sin tratar (medio normal), actuando como el grupo de control.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante con una pipeta después de 72 h y pasar el volumen restante a través de un filtro de jeringa de 0,20 μm. A continuación, congelar el sobrenadante a -80 °C durante al menos 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de GL261 con medio preactivado condicionado por microglía<ol><li>Una vez que el GL261 esté 80% confluente dentro de los portaobjetos de cámara de 8 pocillos, añadir medio microglial tratado con β glucano (paso 2.2.2) a una concentración volumétrica final del 25% durante 72 h (volumen total: 250 μl/pocillo).</li>
		<li>Retirar el medio después de 72 h de incubación y desecharlo.</li>
		<li>Lave las células con solución salina tampón fosfato (PBS; pH 7.4, 0.1 M) tres veces durante 5 minutos.</li>
		<li>Fijar las células añadiendo 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) a 4 °C durante 15 min. NOTA: Dependiendo de los diferentes anticuerpos que podrían usarse para la inmunofluorescencia, los métodos de fijación pueden diferir del PFA típico al 4%. Los fijadores a base de alcohol pueden ser más eficientes para preservar ciertos epítopos.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudio de inmunofluorescencia<ol><li>Lave las muestras con PBS con tritón X (PBST; 0,01%) durante 10 min tres veces.</li>
		<li>Retire el PBST y agregue el tampón de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 10% en PBST (Tabla 1) durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire el tampón de bloqueo y agregue 200 μL por pocillo de PBS que contenga la mezcla primaria de anticuerpos (anticuerpo monoclonal Ki-67 de rata 1:500 y anticuerpo caspasa-3 hendido de conejo 1:500; ver Tabla de materiales). Incubar durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Después de 24 h de incubación a 4 °C, dejar las muestras a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Lave los pocillos tres veces durante 10 minutos con PBS en un agitador (baja velocidad).</li>
		<li>Retire el PBS y reemplácelo con 200 μL por pocillo de PBS que contenga la mezcla de anticuerpos secundarios (1:200 anti-rata IgG (H + L) anticuerpo secundario altamente adsorbido de adsorción, Alexa Fluor 488 y 1:200 burro anti-conejo IgG (H + L) anticuerpo secundario altamente adsorbido de forma cruzada, Alexa Fluor 647; ver Tabla de materiales) durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Lave las muestras con PBS durante 10 minutos en una coctelera multiusos.</li>
		<li>Retirar el PBS y añadir 200 μL por pocillo de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en PBS (1:5.000) durante 1 min.</li>
		<li>Retire DAPI (ver Tabla de materiales) y lave las celdas durante 5 minutos en PBS.</li>
		<li>Retire el marco del pocillo y agregue 50 μL de PBS: glicerol (1: 1) en cada pocillo y cubra con un cubreobjetos.</li>
		<li>Selle los portaobjetos con esmalte de uñas.</li>
		<li>Adquiera imágenes a 20x utilizando un sistema de microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cuantificación y análisis de la proliferación y apoptosis de células tumorales
NOTA: Para medir el efecto potencial de los diferentes β-glucanos sobre la proliferación y apoptosis de células tumorales, se utilizó un script interno en el software ImageJ para cuantificar el número de píxeles positivos de Ki67 (proliferación) y cCasp3 (apoptosis)13.
<ol><li>Abra ImageJ. Haga clic en el botón Plugins . Haga clic en Coloc2, un complemento previamente instalado en la carpeta del complemento, y finalmente seleccione la imagena analizar 11. NOTA: Este plugin estaba disponible después de un contacto previo con el Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). En lugar del script, tanto el software ImageJ como el de Fiji tienen diferentes herramientas para el análisis de colocalización (ver Tabla de materiales), con propiedades similares.</li>
	<li>Establezca umbrales de acuerdo con las condiciones de control (sin tratar, solo DMEM). Haga clic en el botón Aceptar . NOTA: Para evitar discrepancias de fondo e intensidad, todas las imágenes deben tomarse en las mismas condiciones. Preferiblemente, las sesiones de imágenes deben realizarse el mismo día y los parámetros del microscopio no deben alterarse en todas las imágenes.</li>
	<li>Asegúrese de que aparezcan las imágenes resultantes de los píxeles colocalizados y una ventana de resumen que proporcione el porcentaje o el número bruto de píxeles por encima del umbral. Normalizar los resultados con respecto a las condiciones de control (no tratadas). NOTA: Todos los datos se dan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando software de gráficos y análisis (ver Tabla de materiales). Se utilizó un ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los errores se representan como error estándar de la media (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

<ol><li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+curing+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li>
<li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+glioblastoma%3A+current+understanding+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561(2021).</li>
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<li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li>
<li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li>
<li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li>
</ol>

No hay intereses contrapuestos que declarar.

Este trabajo describe el uso de técnicas bien establecidas para aislar, purificar y caracterizar con éxito el contenido de SβGs de cuatro hongos diferentes. Los resultados mostraron cómo después de la extracción con agua caliente de SMP, obtenida de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus, seguida de un tratamiento hidrolítico con α-amilasa, glucosidasa y proteasa, el contenido de α-glucano y proteína se redujo, enriqueciendo significativamente la cantidad de SβG puros.
...

A pesar del advenimiento de nuevos logros en el campo de la neurooncología, la esperanza de vida de los pacientes con glioblastoma sigue siendo escasa. Las terapias estándar de oro contra los tumores cerebrales se basan en la fusión de cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, en la última década, la inmunoterapia se ha convertido en una poderosa estrategia para tratar diferentes tipos de cáncer1. Por lo tanto, la posibilidad de aprovechar la respuesta inmune del cuerpo contra las células tumorales se ha convertido recientemente en el cuarto pilar de la oncología.
Desde hace tiempo se sabe que uno de los mayores desafíos en el campo es superar la fuerte inmunosupresión que se encuentra dentro del microambiente tumoral2. En particular, en el caso del glioblastoma, una de las formas más comunes y agresivas de cáncer cerebral, desentrañar las vías clave que orquestan tales escenarios protumorales y encontrar nuevos compuestos que podrían contrarrestar la respuesta deprimente del sistema inmunológico podría allanar el camino para futuras terapias contra esta enfermedad incurable.
El cerebro posee sus propias células del sistema inmunológico, y el tipo de célula más relevante es la microglía. Se ha demostrado que estas células tienen un comportamiento bastante complejo en diferentes enfermedades centrales3. En el caso de los tumores cerebrales primarios (por ejemplo, glioblastoma), estas células se desplazan hacia un fenotipo antiinflamatorio que apoya a las células tumorales para colonizar el parénquima cerebral3. Numerosas publicaciones han mejorado el papel principal de estas células durante la progresión tumoral. Una de las principales razones de esto es que la microglía asociada al glioma y los macrófagos infiltrados (GAMs) representan un tercio de la masa tumoral total, lo que sugiere la influencia inequívoca de sus estados de activación durante la progresión del tumor cerebral 4,5.
En ese sentido, los β-glucanos fúngicos han sido descritos como moléculas potentes que desencadenan respuestas inmunes efectivas, incluyendo fagocitosis y producción de factores proinflamatorios, lo que lleva a la eliminación de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Los β-glucanos fúngicos generalmente se han estudiado utilizando extractos de diferentes partes de hongos. Sin embargo, la atribución de efectos específicos requiere su purificación para evitar ambigüedades y poder comprender el mecanismo de acción de tales moléculas como agentes inmunomoduladores8.
En este trabajo, los β-glucanos solubles se purifican del cuerpo fructífero de cuatro hongos diferentes, empleados regularmente como hongos comestibles (Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor) y medicinales (Ganoderma lucidum y Hericium erinaceus). En particular, estos cuatro hongos tienen un gran uso en la industria alimentaria y farmacéutica y se produjeron dentro de una economía circular respetuosa con el medio ambiente en una empresa comercial (ver Tabla de materiales).
Con el fin de sentar las bases para el uso futuro de β-glucanos fúngicos en terapias contra el cáncer cerebral, las estrategias de purificación bien definidas y los estudios preclínicos que profundizan en su supuesta interacción con las células del sistema inmune son esenciales para evaluar su papel potencial como mediadores antitumorales. Este trabajo describe los numerosos pasos de aislamiento y purificación necesarios para recuperar los β-glucanos solubles contenidos dentro de los cuerpos fructíferos del hongo seleccionado. Una vez purificadas con éxito, las células microgliales se activan para mejorar su fenotipo inflamatorio. Las células de glioblastoma de ratón (GL261) se recubren con un medio diferente condicionado por microglía, previamente tratado con estos extractos, y luego se evalúa su efecto sobre el comportamiento de las células tumorales. Curiosamente, los estudios piloto de nuestro laboratorio (datos no mostrados) han descubierto cómo la microglía proinflamatoria puede retrasar la migración de células tumorales y las propiedades de invasión no solo en las células de glioblastoma sino también en otras líneas celulares cancerosas. Este trabajo multidisciplinario puede proporcionar una herramienta útil para que los investigadores oncológicos prueben compuestos prometedores capaces de aumentar la respuesta inmune en muchos tipos diferentes de tumores.

<table><tbody><tr><td>Portaobjetos de cámara de 8 pocillos</td><td>Thermo Fisher, EE. UU</td>. <td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Horno de secado al aire</td><td>J.P. Selecta S.A., España</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Dinamarca</td><td>proteasa</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, Estados Unidos</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, EE. UU.</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Molino de cuchillas</td><td>Retsch, Alemania</td><td>&nbsp; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>MERK, Alemania</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de tubo de celulosa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>MERK, Alemania</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de colocalización</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Alemania</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Dinamarca</td><td>Dextran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Águila modificada & aguda; s medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- Amilasa/Glucoamilasa)</td><td>Novozymes, Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU</td><td>. A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Espectroma FT-IR</td><td>Bruker-Vertex, Suiza</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>de gráficos y análisisPrisma GraphPad (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de <><>HPLC H2</td><td></td><td></td><td></td>SO4/</tr><tr><td>subHPLC</td> Waters Corp<td>, Milford, MA, EE. UU.</td><td>Incubadora de HPLC</td><td></td>Waters 2695</tr><tr><td></td> Espectómetro de masas <td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>MERK</td><td>, Alemania</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Crison, Barcelona, España</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Caspasa-3 (Asp175) escindido de conejo</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Rata Ki-67 Termopescador monoclonal</td><td>, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>B&uuml; chi Ib&eacute; RICA S.L.U., España</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Columna de filtración lineal de gel ultrahidrogel (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, EE. UU</td><td>. WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV-Visible</td><td>Amersham Bioscience, Reino Unido</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, EE. UU</td>. <td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>J.P. Selecta S.A., España</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscopio confocal Zeiss LSM 7 DUO.</td><td>Zeiss, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Kit de ensayo de glucanos</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucanos</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Suministramos las cuatro variantes de hongos</td></tr></tbody></table>

aislamiento y purificación del β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Uno de los mayores desafíos en el desarrollo de terapias efectivas contra el glioblastoma es superar la fuerte supresión inmune dentro del microambiente tumoral. La inmunoterapia se ha convertido en una estrategia eficaz para convertir la respuesta del sistema inmunitario en contra de las células tumorales. Los macrófagos asociados al glioma y la microglía (GAM) son los principales impulsores de tales escenarios antiinflamatorios. Por lo tanto, mejorar la respuesta anticancerosa en los GAM puede representar una posible terapia coadyuvante para tratar a los pacientes con glioblastoma. En ese sentido, las moléculas fúngicas de β-glucano se conocen durante mucho tiempo como potentes moduladores inmunes. Se ha descrito su capacidad para estimular la actividad inmune innata y mejorar la respuesta al tratamiento. Esas características moduladoras se atribuyen en parte a su capacidad para unirse a los receptores de reconocimiento de patrones, que, curiosamente, se expresan en gran medida en los GAM. Por lo tanto, este trabajo se centra en el aislamiento, purificación y posterior uso de β-glucanos fúngicos para mejorar la respuesta tumoricida de la microglía contra las células de glioblastoma. Las líneas celulares de glioblastoma de ratón (GL261) y microglia (BV-2) se utilizan para probar las propiedades inmunomoduladoras de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes extraídos de hongos muy utilizados en la industria biofarmacéutica actual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum. Para probar estos compuestos, se realizaron ensayos de coestimulación para medir el efecto de un medio preactivado condicionado por microglía sobre la proliferación y la activación de la apoptosis en las células de glioblastoma.

Purificación exitosa de β-glucanos La masa de MP, SMPs y SβGs obtenida de cuerpos fructíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus después del proceso de extracción y purificación se resume en la Tabla 1. La composición básica (carbohidratos totales, β-glucanos y proteínas) de MP, SMPs y SβGs obtenidos de los hongos se representa en la Tabla 2. Estos resultados muestran cómo el protocolo permitió la recuperación de ...

El presente protocolo describe los pasos de purificación y los estudios posteriores de cuatro β-glucanos fúngicos diferentes como moléculas inmunomoduladoras potenciales que mejoran las propiedades antitumorales de la microglía contra las células de glioblastoma.

Aislamiento y purificación del β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Los betaglucanos fúngicos son moduladores importantes del sistema inmunológico. Mejorar la pureza y los protocolos de aislamiento es esencial para afirmar su papel potencial como coadyuvantes para la terapia del cáncer. Se logró un alto grado de cuatro beta-glucanos diferentes utilizando varios dispositivos que se encuentran comúnmente en biología molecular y laboratorios proteómicos.Este protocolo se centra en probar los efectos de los beta-glucanos en la microglía, la célula inmune residente más abundante del cerebro. La modulación del fenotipo de microglía en el glioblastoma puede proporcionar información importante. Comience la extracción de polisacáridos solubles de hongos o SMP enjuagando los cuerpos fructíferos frescos de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum con agua destilada cinco veces.Luego seque completamente los cuerpos fructíferos lavados a 50 grados centígrados en un horno de secado al aire convencional durante aproximadamente 24 horas antes de molerlos en un molino de cuchillas obteniendo aproximadamente 200 gramos de polvo de cada hongo. A continuación, suspenda 100 gramos de los cuatro polvos de hongos o MP en 1, 000 milili

isolation-purification-fungal-glucan-as-an-immunotherapy-strategy-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.

El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Este video muestra un ensayo in vitro que utiliza β-glucanos para activar las células microgliales para la producción de radicales superóxido, una especie reactiva de oxígeno. En las células de cáncer cerebral, los oxidantes reactivos generados suprimen activamente la proliferación de células tumorales e inducen la muerte celular.

Un ensayo para analizar el β-glucano de prueba como estrategia de inmunoterapia contra las células de cáncer cerebral

El video muestra el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica infiltrantes de tumores del cerebro de un ratón utilizando disociación mecánica y digestión enzimática. A esto le sigue la centrifugación en gradiente de densidad para recoger las células inmunitarias para su posterior análisis.

Aislamiento de células inmunitarias infiltrantes de tumores de un cerebro murino

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Los efectos linfodepletorios e inmunomoduladores de la quimioterapia y la radiación estándar pueden aprovecharse para mejorar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia con células T. Describimos un método para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas de EGFRvIII y administrarlas en el contexto del tratamiento estándar del glioblastoma.

Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Comprender el comportamiento maligno del cáncer requiere crear modelos precisos de cómo las células tumorales interactúan con los componentes del microambiente tumoral, como los macrófagos. En este trabajo describimos dos métodos para estudiar la interacción de las células del glioblastoma con los macrófagos asociados al tumor y la microglía, donde se evalúa el efecto sobre la invasión del glioblastoma.

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Búsqueda de tumor terapéuticas las células madre mesenquimales (MSCs) muestran promesa como tratamiento para el glioblastoma invasor. El trasplante óptimo consiste en entrega de MSCs en la cavidad de resección de tumor en andamios. Aquí, preclínicas técnicas para estudio de tratamiento de MSC de glioblastoma se proporcionan como: resección tumoral guiada por la imagen; implantación de semillas MSC andamios; y seguimiento de la terapia postoperatoria.

Resección guiada por la imagen de Glioblastoma e implantación intracraneal de andamios sembrado células madre terapéuticas

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Aprende el aislamiento y purificación de β-glucanos fúngicos para inmunoterapia contra el glioblastoma usando células BV2 y técnicas analíticas avanzadas. Este protocolo demuestra su potencial inmunomodulador.

Aislamiento y purificación del β-glucano fúngico como estrategia de inmunoterapia para el glioblastoma

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