Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Este protocolo es el primero en describir cómo procesar y evaluar el tamaño del ratón para patologías de RP utilizando microscopía confocal y electrónica de transmisión de luz. La principal ventaja de este protocolo es la inclusión de evaluaciones cuantitativas de las patologías de RP, utilizando estas tres técnicas de imagen para las comparaciones estadísticas. Las técnicas descritas en este protocolo también pueden ayudar a ampliar nuestro conocimiento de las vías moleculares importantes para la salud del EPR.

Las personas que no han diseccionado previamente el tamaño del ratón pueden tener dificultades con este protocolo. Sugerimos que estos individuos practiquen con algunos ratones para dominar las técnicas descritas en este protocolo. Para comenzar, prepare un sistema de perfusión de alimentación por gravedad en una almohadilla absorbente para la perfusión cardíaca en una campana extractora.

Vierta 40 mililitros de tampón fijador recién preparado en el cilindro de la jeringa del sistema de perfusión. Gire la válvula paralela a la línea de tubería para permitir que el amortiguador fluya a través de la línea de tubería. Enjuague la línea hasta que se eliminen todas las burbujas de aire de la línea.

Luego gire la válvula perpendicular a la línea de tubería para evitar que el amortiguador fluya hacia la línea de tubería. Para realizar la perfusión cardíaca, transfiera el ratón sacrificado a una bandeja poco profunda cerca del sistema de perfusión. Con el abdomen hacia arriba.

Rocíe el abdomen con etanol al 70%, luego cree un corte inferior de cinco centímetros usando tijeras curvas y pinzas a través de la piel y la pared abdominal en el lado izquierdo del ratón debajo de la caja torácica. Proceder a realizar un corte medial de tres centímetros a través de la piel y la pared abdominal en la parte superior del corte inferior. Haga otro corte inferior de cinco centímetros al final del corte medial a través de la piel y la pared abdominal en el lado derecho más alejado del ratón debajo de la caja torácica.

Haga otra incisión medial de tres centímetros para extraer el colgajo de piel abdominal con fórceps curvos. Luego, corte a través del diafragma y el esternón para exponer el corazón. Inserte la aguja de calibre en el ventrículo izquierdo del corazón y gire la válvula.

Corte la aurícula derecha con tijeras curvas para permitir que la sangre y el fijador salgan del corazón. Permita 10 mililitros de tampón fijador para perfundir el ratón durante uno o dos minutos, o hasta que el hígado se vuelva de color pálido y no salga sangre de la aurícula derecha. Una vez que se complete la perfusión, gire la válvula perpendicular a la línea de tubería para detener el flujo amortiguador.

Para nuclear los ojos, retire el ratón de la bandeja poco profunda y colóquelo en la almohadilla inferior absorbente en una campana extractora. Luego oriente la cabeza del ratón con el ojo izquierdo mirando hacia el experimentador y el ojo derecho fuera de la vista. Anote el lado superior del ojo con un tinte de marcado de tejido.

Empuje suavemente hacia abajo alrededor de la cuenca del ojo con el pulgar y el índice para la protuberancia del ojo de la cuenca del ojo. Luego, usando tijeras curvas, sostenga el ojo con la cuchilla en un ángulo de 30 grados desde la cuenca del ojo y corte alrededor del ojo. Retire el globo ocular de la cabeza con pinzas curvas y colóquelo en una almohadilla absorbente.

Corte la córnea con una hoja de bisturí número 11 y coloque el ojo con pinzas curvas en un microtubo de dos mililitros que contenga dos mililitros de tampón fijador. Después de nuclear ambos ojos, incubarlos en un tampón fijador durante la noche en un agitador en una habitación de cuatro grados a una velocidad de 75 rpm. Al día siguiente, reemplace el tampón fijador con dos mililitros de PBS e incube durante 10 minutos en un agitador a temperatura ambiente y 75 rpm.

A continuación, para generar segmentos posteriores, coloque el ojo en una placa de Petri llena de PBS bajo un microscopio de disección. Levante suavemente cualquier grasa y músculo lejos del globo ocular con pinzas de punta fina. Recorte cuidadosamente la grasa y el músculo con tijeras de micro disección en una dirección paralela al globo ocular hasta que el globo ocular tenga un color negro azulado uniforme Coloque pinzas de punta fina en el sitio de punción corneal y corte alrededor del perímetro de la córnea comenzando en el sitio de punción con tijeras de micro disección para extraer la córnea y el iris del globo ocular.

Luego, con pinzas de punta fina, retire suavemente la lente del globo ocular para obtener el segmento posterior. Coloque el segmento posterior en un tubo que contenga dos mililitros de PBS y guárdelo a cuatro grados centígrados en un refrigerador hasta que lo use. Transfiera el ojo a una placa de Petri que contenga PBS y retire la córnea y el iris como se demuestra.

Saque la lente con pinzas de punta fina. Luego, con dos pinzas de punta fina, separe suavemente la retina neural del segmento posterior. Corte con cuidado la retina neural en la cabeza del nervio óptico para extraerla de la copa ocular posterior.

Coloque la copa ocular en un microtubo de dos mililitros que contenga cinco microlitros de PBS. Para fijar las copas oculares posteriores, agregue 500 microlitros de metanol al tejido e incube en una coctelera a 75 rpm, durante cinco minutos. Repita la fijación de metanol tres veces con la incubación final durante dos horas.

Después de la fijación, lavar el tejido tres veces con PBS, antes de proceder a la tinción de inmunofluorescencia y la visualización a través de microscopía confocal. Los ratones TMEM 135 TG de cuatro meses de edad, mostraron una reducción significativa en el epitelio pigmentado de la retina o el grosor del EPR a 600 y 900 micrómetros del nervio óptico, en relación con los ratones de tipo salvaje de la misma edad. Se calcularon incidentes de patologías del EPR que incluyen microvascuolización, macrovacuolización y migración de ratones WT y TMEM 135 TG de 325 días de edad.

La frecuencia promedio de microvacuolización del EPR fue menor en el tipo salvaje en comparación con los ratones TMEM 135 TG. No se detectó macrovacuolización y migración de EPR en el tipo salvaje en comparación con los valores promedio observados en ratones TMEM 135 TG. En microscopía electrónica de transmisión, se observaron depósitos laminares basales en retinas de 24 meses de edad que estaban ausentes en retinas de dos meses de edad.

El análisis de las frecuencias acumuladas de las alturas de los depósitos laminares basales, indicó un desplazamiento a la derecha de la línea para el de 24 meses de edad, en comparación con el de dos meses de edad, lo que demuestra un aumento en los depósitos en ratones de 24 meses de edad. Esta observación fue apoyada por estaturas promedio más grandes en retinas de 24 meses de edad. El EPR en ratones TMEM 135 TG de cuatro meses de edad fue dismórfico.

El EPR en las retinas TMEM 135 TG es más grande y menos denso que las retinas de tipo salvaje de la misma edad. Además, se observaron más células RPE multinucleadas en las retinas TG, en comparación con los controles. Siguiendo este protocolo, los investigadores podrían evaluar vías específicas utilizando técnicas de biología molecular en ratones, lo que podría contribuir a nuestra comprensión de cómo se desarrollan estas patologías de RP en ratones.

Este protocolo ayudará a estandarizar el fenotipado de RP en ratones, lo que traducirá los hallazgos de los estudios con ratones a otros modelos de DMAE y ayudará a comprender la patobiología de la DMAE.