Name: Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a rastrear canales iónicos individuales mediante microscopía TIRF en bicapas lipídicas sin necesidad de marcado fluorescente. Este método revela la relación entre la difusión lateral y la función del canal en neurociencia y biofísica.

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Agradecemos a Beate Nitschke por su ayuda con la preparación de proteínas y a Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) y Maximilan Ulbrich (Friburgo) por sus perspicaces discusiones. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación de Biología de Sistemas de Stuttgart (SRCSB) y una subvención de la Fundación Baden Württemberg (BiofMO-6 a SN).

No declaramos ningún conflicto de intereses.

El protocolo presentado aquí proporciona una introducción al uso de membranas DIB para estudiar la interacción entre el movimiento del canal iónico lateral y la función del canal utilizando microscopía TIRF de molécula única. Para obtener los mejores datos posibles, la preparación de membranas DIB estables con tantos canales bien separados como sea posible es crucial para obtener series temporales de partículas individuales, que puedan analizarse satisfactoriamente.
Los parámetros críticos que deben optimizarse incluyen la elección de lípidos, la concentración de lípidos en la fase oleosa y las concentraciones de proteínas y detergentes en las gotas acuosas. Los lípidos empleados son inusuales, ya que no muestran una transición de fase clara a bajas temperaturas. DPhPC es un lípido comúnmente utilizado para producir sistemas de membrana estables40. En principio, cualquier lípido que mantenga su ambiente fluido a bajas temperaturas puede ser adecuado para esta aplicación. Además, el lípido no debe ser sensible a la oxidación. La concentración de detergente en las gotitas debe ser lo más baja posible para evitar la ruptura de la membrana. Las membranas estables y las buenas tasas de incorporación de proteínas generalmente se logran con concentraciones de detergente por debajo de la concentración crítica de micelas (cmc), dado que la proteína de membrana no precipita.
Si las membranas DIB no toleran detergentes específicos21,41, o si las proteínas no se integran de la solución detergente baja en las membranas DIB, los canales de proteínas pueden reconstituirse primero en pequeñas vesículas lipídicas unilamelares (SUV), que luego se fusionan a las membranas DIB desde el lado de las gotas, como se ha demostrado con éxito para E. coli MscL 42 . A veces, las membranas DIB no se forman porque la concentración de lípidos en la fase oleosa es demasiado baja. Para evitar que las membranas DIB se rompan, también se debe tener en cuenta que la presión osmótica entre el hidrogel y la gota debe equilibrarse con precisión sin afectar excesivamente el flujo de Ca 2+ de cis a trans. El grosor optimizado de agarosa y el tamaño de la malla parecen ser cruciales para observar la difusión de proteínas de membrana. Debe evitarse cualquier secado de la capa de agarosa. El espesor puede determinarse mediante microscopía de fuerza atómica17. Al variar la concentración, el volumen y la velocidad de rotación de agarosa durante el recubrimiento de centrifugado, se puede optimizar el tamaño de la malla y el grosor del hidrogel. Tenga en cuenta, sin embargo, que el grosor de la capa de hidrogel afecta el contraste de la imagen. Para capturar proteínas de membrana en DIB, el hidrogel de agarosa puede ser reemplazado por agarosa sintetizada, no reticulada, modificada con Ni-NTA y de bajo punto de fusión para atraparlas a través de una etiqueta His17. Un fondo de fluorescencia excesivamente alto a menudo es causado por la ruptura de las membranas DIB. Esto es particularmente un problema con las cámaras de pocillos múltiples, ya que el tinte sensible al Ca2+ se difunde en el hidrogel. En este caso, se deben evitar los pozos adyacentes. El blanqueamiento por fluorescencia del colorante sensible al Ca2+ por encima de la membrana no debe ser un factor limitante significativo, ya que es intercambiado por colorantes no excitados en la mayor parte de la gota (Figura 3A) fuera del campo evanescente TIRF. La precisión de localización de la proteína viene dada por la precisión del ajuste de las manchas y el tamaño de los píxeles.
Las señales de fluorescencia débiles pueden ser causadas por un bajo flujo de Ca2+ a través del canal. Las posibles razones incluyen: (i) ajustes inexactos de TIRF (por ejemplo, intensidad del láser), (ii) la presión osmótica de Ca 2+ a través de la membrana, o (iii) la permeabilidad intrínseca de Ca2+ de los canales es demasiado baja. Para hacer frente al primer problema, la intensidad del láser, el ángulo TIRF y la ganancia de la cámara deben optimizarse. Los dos últimos problemas pueden ser superados por la aplicación de un potencial eléctrico a través de la membrana 2,43. Sin embargo, la aplicación de voltajes externos puede distorsionar el resultado, ya que los efectos eléctricos pueden influir en la apertura del canal de los canales iónicos dependientes de ligandos o mecanosensibles que en realidad no están controlados por voltaje. Ejemplos de tales canales son la proteína mitocondrial translocasa TOM-CC27, y su subunidad formadora de canales Tom40 26,44,45,46. Finalmente, cabe señalar que, insertar proteínas de membrana en membranas DIB en una orientación específica para lograr una funcionalidad deseada es complicado, y los estudios cuantitativos son raros47,48. En algunos casos, la orientación de las proteínas integradas es aleatoria. Este es un problema grave para el estudio de las proteínas de membrana, porque ciertas proteínas de membrana se activan en un solo lado de la membrana.
La microscopía TIRF es un método poderoso para abordar eventos de moléculas individuales en membranas planas soportadas49. Los ejemplos incluyen el ensamblaje y la elucidación de la vía de plegamiento de proteínas del canal como α-hemolisina50, perfringolisina O 51 y OmpG52. Estos estudios incluyeron FRET como una técnica adicional. Además, la activación del canal iónico mecanosensible MscL se ha estudiado previamente mediante estimulación mecánica de bicapas DIB42 soportadas utilizando mediciones de corriente. Sobre la base de este trabajo, los estudios futuros podrían combinar la plataforma descrita aquí con experimentos FRET de molécula única para abordar canales mecanosensibles a nivel de molécula única de manera óptica17. La inyección de tampón en la gota, el estiramiento de la monocapa DIB interna o la unión dirigida de canales individuales al hidrogel subyacente se pueden usar para estudiar más a fondo no solo el mecanismo físico de los canales activados mecánicamente, que responden a la tensión y / o curvatura de la membrana como se muestra para MscL y MscS, el dominio de dos poros K + canales, TREK-1, TREK-2, y TRAAK, y PIEZO (para revisión, ver53), pero también unión local al citoesqueleto celular, como se muestra para el canal iónico sensible al tacto NOMPC54,55.

El presente protocolo tiene como objetivo describir cómo estudiar la correlación entre la movilidad de la membrana y la permeabilidad del canal iónico de las proteínas de membrana en membranas de bicapa de interfaz de gotas (DIB) soportadas por polímeros 1,2,3.
La presente técnica complementa una impresionante variedad de herramientas analíticas ópticas y de superficie avanzadas, como el seguimiento de partículas individuales4,5, la espectroscopia de correlación de fluorescencia 6,7 y la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad 8,9,10. Estos proporcionan información valiosa sobre la composición dinámica y la estructura de las membranas que influyen en las reacciones basadas en la membrana11,12,13. Mientras que el movimiento y la difusión lateral de las proteínas dependen de la densidad local de las proteínas en la membrana, las moléculas de proteínas individuales también pueden quedar atrapadas en balsas lipídicas14 y por interacciones proteína-proteína15,16. Dependiendo de los dominios proteicos que sobresalen de la membrana hacia el entorno extracelular o citosol, la movilidad de las proteínas puede variar de altamente móvil a completamente inmóvil. Sin embargo, debido a la complejidad de la membrana y sus estructuras periféricas, a menudo es difícil descifrar la interacción entre la naturaleza de la movilidad lateral y la función de la proteína17.
Las membranas DIB han demostrado ser una plataforma eficiente para el análisis biofísico de moléculas individuales de proteínas de membrana 18,19,20,21,22. Se forman por autoensamblaje lipídico a través del contacto de gotitas acuosas con sustratos soportados por hidrogel en una fase lípido/aceite. Similar a las bicapas lipídicas soportadas (SLBs) comúnmente utilizadas1,23,24,25, las DIB permiten el ajuste local de la movilidad lateral mediante la unión temporal o permanente de proteínas a la matriz polimérica cuando se funcionalizan con ligandos adecuados17. Este último puede servir como sistema modelo para procesos bioquímicos en membranas celulares con una distribución heterogéneade proteínas 10.
El enfoque experimental descrito aquí se basa en la fluorescencia de colorantes sensibles a Ca 2+ para medir el flujo de iones Ca 2+ a través de canales individuales muy cerca de la membrana 2,22 utilizando microscopía TIRF. Este enfoque óptico limita la iluminación de la muestra a una distancia cercana a la membrana, lo que, debido a las propiedades físicas de la luz de excitación evanescente, conduce a una reducción significativa del fondo de fluorescencia. Este último es un requisito previo si se requiere una alta resolución espacial y temporal para la detección de moléculas individuales. A diferencia de los métodos electrofisiológicos clásicos26,27, no se requieren voltajes de membrana para estudiar el flujo de iones a través de canales individuales. Además, el método no requiere marcado con colorantes fluorescentes o moléculas que podrían interferir con el movimiento lateral de los canales en la membrana.
El método es particularmente útil para estudiar los canales de proteínas incrustados en la membrana a nivel de molécula única sin utilizar la electrofisiología clásica. Utilizando el canal conductor de proteínas mitocondriales TOM-CC de Neurospora crassa28,29,30 y OmpF, que apoya la difusión de pequeñas moléculas hidrófilas a través de la membrana externa de Escherichia coli17,31, ilustramos cómo se pueden estudiar y correlacionar las movilidades de membrana y las actividades de canal de las dos proteínas. Sugerimos que este enfoque, aunque optimizado para TOM-CC y OmpF, se puede aplicar fácilmente a otros canales de proteínas.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x Objetivo de aceite Apocromático N.A. 1.49</td><td></td><td>Microscopio Nikon MRD01991 TIRF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10x objetivo de contraste de modulación Hoffmann NA 0.25&nbsp;</td>Microscopio <td>Nikon</td><td></td><td>para evaluar la formación de membranas DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Objetivo 10x N.A. 0.25</td><td></td><td>Microscopio Nikon MRL00102 TIRF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40x Objetivo de contraste de modulación Hoffmann NA 0.55</td><td>Microscopio Nikon</td><td></td><td>para evaluar la formación de membrana DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Láser de 488 nm, 100 mW&nbsp; &nbsp;</td><td>Microscopio Visitron</td><td></td><td>TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>Cinta</td><td></td><td></td><td></td> adhesiva</tr><tr><td>&Auml; KTA PURO&nbsp; &nbsp;</td><td>Sistema de purificación de proteínas</td> <td>Cytiva</td><td></td> Kit</tr> de <tr><td>ensayo Bradford, Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Chelax 100 resina</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>Cámara DIB&nbsp;</td><td>Cámara de</td> PMMA hecha <td></td><td>a medida para membranas DIB Medidor</td></tr><tr>de<td>potencia digital y consola de energía</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Medidor de potencia láser&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Roth</td><td>&nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de modulación Hoffmann H2O de doble destilación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100&nbsp;</td>Microscopio <td>Nikon</td><td></td><td>para evaluar la formación de membranas DIB&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>Cámara EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>Microscopio TIRF&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo Ti70</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluorTM</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-362561</td><td>Ca2+ sensible al colorante</td></tr><tr><td>Prensa francesa homogeneizador de disrupción de celdas</td><td>Igneus</td><td>Igneus 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>Filtro GFP</td><td>AHF</td><td></td><td>Filtro seeting utilizado para la excitación de membranas DIB por epifluorescencia con fuente de luz blanca&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio 40 mm x 24 mm x 0,13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 10 mL</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 100 mL</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 500 mL</td><td>Roth</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Minitube&nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth&nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>Hexadcane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>su trampa HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>Columna de Ni-NTA</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>10314243</td><td></td></tr><tr><td>KLM spin coater&nbsp;</td><td>Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>Lista médica L/M-3P-A extractor de pipetas vertical</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto</td><td>de fusión Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8 Microscopio estereoscópico</td><td>Wild</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>N2 gas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanolitro 2010 inyector&nbsp;</td><td>Nanolitro de World Precision</td><td>Instruments 2010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecil-b-D-maltósido</td><td>Glycon Biochemicals</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarosa, no reticulado</td><td>Cubo Biotech</td><td>124115393</td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td>NIS-Elements Software AR</td><td>Nikon</td><td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>Software de imagen</td></tr><tr><td>n-octil-polioxietileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O2 gas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td><td>Roth&nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de fotodiodo&nbsp; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td> Sensor <td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>para medidor de potencia láser&nbsp;</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener Electronics</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga preparativa Optima</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro TIRF cuatribanda 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>Ajuste de filtro utilizado para la excitación de membranas DIB con láser de 488 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Recurso Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>Columna de intercambio aniónico</td></tr><tr><td>Aceite de silicio AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Cámara Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Super LoLux</td><td>JVC</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Microscopio de fluorescencia&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico&nbsp;</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Vacuubrand</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz blanca para iluminación de epifluorescencia (100 W)</td><td>Microscopio Nikon MBF72655 TIRF&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (tirf)

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Las técnicas de imagen de alta resolución han demostrado que muchos canales iónicos no son estáticos, sino que están sujetos a procesos altamente dinámicos, incluida la asociación transitoria de subunidades auxiliares y formadoras de poros, difusión lateral y agrupamiento con otras proteínas. Sin embargo, la relación entre la difusión lateral y la función es poco conocida. Para abordar este problema, describimos cómo la movilidad lateral y la actividad de los canales individuales en las membranas lipídicas soportadas pueden ser monitoreadas y correlacionadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Las membranas se fabrican sobre un sustrato de hidrogel ultrafino utilizando la técnica de bicapa de interfaz de gotas (DIB). En comparación con otros tipos de membranas modelo, estas membranas tienen la ventaja de ser mecánicamente robustas y adecuadas para técnicas analíticas altamente sensibles. Este protocolo mide el flujo de iones Ca 2+ a través de canales individuales observando la emisión de fluorescencia de un colorante sensible a Ca2+ muy cerca de la membrana. A diferencia de los enfoques clásicos de seguimiento de moléculas individuales, no se requieren proteínas de fusión fluorescentes o etiquetas, que pueden interferir con el movimiento lateral y la función en la membrana. Los posibles cambios en el flujo iónico asociados con cambios conformacionales de la proteína solo se deben al movimiento lateral de la proteína en la membrana. Los resultados representativos se muestran utilizando el canal de translocación de proteínas mitocondriales TOM-CC y el canal bacteriano OmpF. A diferencia de OmpF, la compuerta de TOM-CC es muy sensible al confinamiento molecular y a la naturaleza de la difusión lateral. Por lo tanto, las bicapas de interfaz de gotas compatibles son una herramienta poderosa para caracterizar el vínculo entre la difusión lateral y la función de los canales iónicos.

La grabación óptica de un solo canal sin electrodos en tiempo real revela la interacción entre el movimiento lateral de proteínas y la función de los canales iónicos individuales en las membranas DIB. La reconstitución del complejo del núcleo TOM mitocondrial (Figura 1A) en una membrana DIB (Figura 4D) ilustra una fuerte correlación temporal entre la movilidad lateral y la permeabilidad iónica (Figura 5A). La compuerta TOM-CC parece ser sensible al modo de movimiento lateral17. Los canales móviles muestran flujo de Ca2+ a través de sus poros y altas intensidades de puntos de fluorescencia. Las moléculas atrapadas que no se mueven muestran intensidades de fluorescencia bajas y medias. Para el poro general de importación de proteínas de las mitocondrias TOM-CC, este enfoque de molécula única reveló una fuerte correlación temporal entre la movilidad lateral y la permeabilidad a los iones, lo que sugiere que el canal TOM-CC tiene propiedades mecanosensibles17. Una parada lateral de moléculas TOM-CC que se mueven libremente se acompaña de un cierre parcial o completo del canal TOM-CC. Las imágenes de membranas DIB con OmpF (Figura 1E y Figura 4F), que está casi completamente incrustada en la membrana, no muestran efectos de parada y arranque (Figura 5B). Las paradas aleatorias de OmpF no están asociadas con un cambio en la intensidad y, por lo tanto, con el cierre de sus poros. Sobre la base de las señales de fluorescencia38, la precisión posicional de los canales individuales puede estimarse en el rango entre 5 y 10 nm. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta precisión no se puede lograr si los canales se tambalean ligeramente debido al anclaje móvil con el hidrogel de agarosa, como se muestra, por ejemplo, para las moléculas TOM-CC en un estado intermedio con un desplazamiento medio de la raíz de 120 nm (Figura 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> Figura 1: Aislamiento de TOM-CC. (A) Estructura crioEM de N. crassa TOM-CC30,39. Las mitocondrias de una cepa de N. crassa que contenía un Tom22 con una etiqueta 6xHis se solubilizaron en DDM y se sometieron a cromatografía de afinidad Ni-NTA (B) y cromatografía de intercambio aniónico (C). (D) SDS-PAGE de TOM-CC aislado. (E) Estructura cristalina (PDB, 1OPF) y (F) SDS-PAGE de E. coli OmpF purificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo del conjunto de la cámara de PMMA. Paso 1: Un cubreobjetos de vidrio se recubre con un hidrogel de agarosa. Paso 2: El cubreobjetos recubierto por centrifugado se monta en una cámara de microscopía de PMMA hecha a medida. Paso 3: Se agrega agarosa de bajo punto de fusión adicional en el puerto de entrada de la cámara de PMMA en una placa caliente de 35 ° C. Paso 4: Las monocapas lipídicas se forman alrededor de gotitas acuosas en una interfaz tampón/aceite (izquierda) y en la interfaz hidrogel/aceite de agarosa (derecha). Paso 5: Las gotitas acuosas individuales se pipetean en los pocillos de la cámara de PMMA para formar una bicapa lipídica al contacto de las dos monocapas lipídicas. Paso 6: La formación de las membranas DIB se valida mediante microscopía de contraste de modulación de Hofmann. Paso 7: Las imágenes de áreas seleccionadas de las membranas DIB con canales iónicos insertados se adquieren mediante microscopía TIRF. Verde: 0,75% de agarosa; amarillo: 2.5% de agarosa que contiene iones Ca2+ ; magenta: fase lípida/oleosa; azul oscuro: tampón de gotas acuosas que contienen colorante sensible al Ca2+ y proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> Figura 3: Configuración experimental. (A) Representación esquemática de una membrana DIB en un pozo de PMMA. La bicapa descansa sobre una película ultrafina de agarosa al 0,75% para permitir la obtención de imágenes TIRF del flujo de Ca 2+ a través de un canal iónico a lo largo del tiempo utilizando un colorante de fluorescencia sensible al Ca 2+ (Fluo-8) en trans. (B) El flujo de Ca2+ está controlado exclusivamente por la presión osmótica de cis a trans. Esto permite tanto la determinación de la posición en la membrana como el estado abierto-cerrado del canal. El canal que se muestra aquí es el canal conductor de proteínas TOM-CC de las mitocondrias30 de N. crassa. (C) Trayectoria de un solo canal TOM-CC. Verde: canal móvil; Amarillo: canal inmóvil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> Figura 4: Obtención de imágenes de TOM-CC y OmpF en membranas DIB. (A) Membrana DIB fotografiada por microscopía de contraste de modulación de Hoffmann que muestra el área de contacto bicapa entre el hidrogel y la gota. (B) Membrana DIB rota fotografiada como en (A). Flecha, borde de la cámara de PMMA. (C) Membrana DIB fotografiada por microscopía TIRF sin canales de proteínas. (D) Membrana DIB con TOM-CC reconstituido, fotografiada por microscopía TIRF. Los cuadrados blancos marcan manchas de intensidad alta (SH), intermedia (SI) y baja (SL). (E) El ajuste del perfil de intensidad de fluorescencia de los tres puntos marcados en (A) a funciones gaussianas bidimensionales revela la posición de los TOM-CC individuales y el flujo de Ca2+ a través del canal. (F) Membrana DIB con OmpF reconstituido. (G) Ajuste gaussiano de la mancha fluorescente marcada en (F). En contraste con el complejo proteico de dos poros β barriles TOM-CC, el OmpF de tres poros β barriles revela solo un estado de permeabilidad. Tamaño de píxel, 0,16 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> Figura 5: La actividad del canal se correlaciona con la movilidad lateral de TOM-CC. (A) La traza de amplitud fluorescente (arriba) y la trayectoria correspondiente (abajo) de TOM-CC indican que la actividad del canal abierto-cerrado de TOM-CC se correlaciona con la movilidad de la membrana lateral del complejo. La trayectoria muestra tres estados de permeabilidad. Verde: estado totalmente abierto; amarillo: estado de permeabilidad intermedio; rojo: estado de canal cerrado; estrella roja: TOM-CC en el estado intermedio se tambalea alrededor de su posición media en aproximadamente ±60 nm. Las precisiones posicionales37 basadas en las señales de fluorescencia en los estados totalmente abierto e intermedio oscilan entre 5 nm y 10 nm. (B) Traza de amplitud fluorescente (arriba) y trayectoria correspondiente (abajo) de OmpF. OmpF revela solo un nivel de intensidad, independientemente de si está en movimiento o atrapado. Los segmentos de trayectoria correspondientes a los períodos de tiempo de las moléculas atrapadas están marcados en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Búfer </td>
			<td colspan="3">Concentraciones de reactivos</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 % (p/v) n-dodecil-β-D-maltósido (DDM), 10% (v/v) glicerol, 300 mM NaCl y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (p/v) DDM, 10% (v/v) glicerol, 1 M Imidazol y 1 mM PMSF</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (p/v) DDM, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (p/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO)</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Desgasificarse y pasar a través de un filtro de 0,22 μm antes de su uso.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Soluciones tampón para el aislamiento TOM-CC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Búfer </td>
			<td colspan="3">Concentraciones de reactivos</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>LB*</td>
			<td colspan="3">1% (p/v) de triptona, 1% (p/v) de NaCl y 0,5% (p/v) de extracto de levadura</td>
			<td>1100 ml</td>
		</tr><tr><td>C1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2, y ~750 unidades de DNAsa y 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr><tr><td>C2</td>
			<td colspan="3">50 mM Tris-HCl, pH 7.5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C3</td>
			<td colspan="3">4% (p/v) dodecil sulfato de sodio (SDS), 2 mM β-mercaptoetanol y 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C4</td>
			<td colspan="3">2% (p/v) SDS, 500 mM NaCl y 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>C5</td>
			<td colspan="3">0,5% (p/v) de polioxietileno octilo (octilo POE), 1 mM EDTA y 20 mM Tris pH 8,5</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* Esterilizar antes de usar.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Soluciones tampón para el aislamiento de OmpF.

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía TIRF para rastrear canales iónicos individuales y determinar su actividad en las membranas lipídicas soportadas, definiendo así la interacción entre el movimiento de la membrana lateral y la función del canal. Describe cómo preparar las membranas, registrar los datos y analizar los resultados.

Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Los canales iónicos no son estáticos en las membranas biológicas. Aquí presentamos un enfoque óptico de una sola molécula para desentrañar el vínculo entre la difusión de la membrana lateral y la función del canal iónico. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos es que no se requiere el marcado fluorescente de proteínas que podrían interferir con su movimiento lateral y función.El método se puede aplicar a cualquier canal de proteína de membrana donde la difusión libre o restringida es importante para la organización y la función. Para comenzar, transfiera 380 microlitros de la solución madre de DPhPC a un vial de vidrio y cubra la solución de reserva de lípidos con argón o gas nitrógeno para evitar la oxidación de lípidos. Utilice el flujo de gas más bajo posible para evitar la evaporación del disolvente orgánico en el que se disuelven los lípidos, o salpicaduras de los aerosoles de disolvente del vial.Seque la muestra de lípidos bajo una corriente de nitrógeno y retire el disolvente orgánico restante de la muestra de lípidos al vacío utilizando una bomba de vacío exenta de aceite durante la noche. Disuelva la película lipídica en una solución de aceite de silicona hexadecano agregando volúmenes iguales de hexadecano y aceite de silicona usando una pipeta de un mililitro a una concentración lipídica final de 9.5 miligramos por mililitro. Coloque algunos cubreobjetos de vidrio en un soporte de cubreobjetos de acero inoxidable y límpielos en un vaso de precipitados de vidrio durante unos 10 minutos con acetona en un limpiador ultrasónico.Enjuague los cubreobjetos con agua desionizada doble y séquelos bajo una corriente de nitrógeno. Además, limpie e hidrofilice un cubreobjetos en un limpiador de plasma con oxígeno durante cinco minutos. Monte un cubreobjetos tratados con plasma en una recubridora de centrifugado y cubra el cubreobjetos con una película de espesor submicrométrico de agarosa agregando lentamente 140 microlitros de agarosa calentada al 0,75% de bajo punto de fusión con una pipeta de 200 microlitros a 3.000 RPM durante 30 segundos.Fije inmediatamente el cubreobjetos recubierto de centrifugado con la capa delgada del hidrogel de agarosa a la parte inferior de la cámara de PMMA. Asegúrese de que el hidrogel de agarosa apunte hacia arriba. Fije los bordes del cubreobjetos al dispositivo micromecanizado de PMMA con cinta adhesiva transparente y coloque el dispositivo en una placa caliente calentada a 35 grados centígrados.Vierta cuidadosamente 200 microlitros de solución de agarosa al 2,5% en la entrada de la cámara sin crear burbujas de aire. Cubra inmediatamente los pocillos de la cámara de PMMA con alrededor de 60 microlitros de la solución de aceite lipídico para iniciar la formación de monocapa lipídica en la interfaz del aceite de agarosa para evitar la deshidratación de la agarosa recubierta de espín en los pocillos de la cámara de PMMA. Coloque el dispositivo en una placa caliente a 35 grados centígrados durante aproximadamente dos horas.Coloque alrededor de 20 microlitros de solución de aceite de silicona hexadecano lipídico en cada uno de los varios pocillos microfabricados en una cámara de incubación de gotas. Prepare una aguja de vidrio microcapilar con un diámetro de abertura de punta de alrededor de 20 micrómetros utilizando un extractor de micropipetas vertical u horizontal. Llene la aguja con alrededor de cinco microlitros de solución inyectable acuosa que contenga 8,8 milimolares de HEPES, siete micromolares de un colorante fluorescente, Fluo-8, 400 EDTA micromolares, 1,32 cloruro de potasio molar y 30 nanomolares TOM core complex o, alternativamente, 20 nanomolares OMPF.Monte la aguja con la solución de inyección acuosa en un nanoinyector piezoaccionado e inyecte de 100 a 200 nanolitros de gotitas acuosas en los pocillos de la cámara de incubación de gotas llena de solución de aceite de silicona hexadecano lipídico utilizando el nanoinyector. Permita la formación de una monocapa lipídica en la interfaz del aceite de gotas durante aproximadamente dos horas manteniendo las cámaras de incubación de PMMA y gotas en una placa caliente calentada a 35 grados centígrados. Transfiera manualmente gotitas acuosas individuales desde los pocillos de la cámara de incubación de gotas a los pocillos de la cámara de PMMA utilizando una pipeta de microlitro de un solo canal con una punta de polipropileno desechable de 10 microlitros.Permita que las gotitas se hundan en las monocapas lipídicas en las interfaces hidrogel-aceite para formar una bicapa lipídica entre las gotitas y el hidrogel de agarosa. Monte la cámara de PMMA con la bicapa de interfaz de gotas o membranas DIB en el soporte de muestra de un microscopio de luz invertida, y evalúe la formación de la membrana utilizando un objetivo de contraste de modulación Hoffman 10x. Si se han formado membranas DIB, monte la cámara de PMMA en el portamuestras de un microscopio TIRF equipado con una fuente de luz convencional para la iluminación de epifluorescencia, un láser de 488 nanómetros y una cámara CCD multiplicadora de electrones retroiluminada para lograr un tamaño de píxel de alrededor de 0,16 micrómetros.Enfoque el borde de una membrana DIB con un objetivo de aumento de 10x bajo iluminación de epifluorescencia con una fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP. Enfoque fino del mismo borde de la membrana DIB a gran aumento con un objetivo TIRF de aceite apocromático 100x NA 1.49, nuevamente bajo iluminación de epifluorescencia con una fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP. Cambie la configuración del filtro de GFP al conjunto de filtros TIRF de banda cuádruple, encienda el láser de 488 nanómetros y establezca la intensidad del láser en la lente del objetivo.Para visualizar canales iónicos individuales, ajuste el ángulo TIRF y la ganancia de la cámara CCD EM para que los canales iónicos abiertos en la membrana DIB aparezcan como puntos fluorescentes de alto contraste sobre un fondo oscuro, y la relación señal/fondo alcance un máximo. Asegúrese de que los puntos correspondientes al flujo de iones de calcio a través de canales iónicos individuales permanezcan enfocados y tengan una forma redonda con alta intensidad en el centro y disminuyendo gradualmente hacia la periferia. Compruebe que los puntos fluorescentes están enfocados para asegurarse de que los canales iónicos se han reconstituido en las membranas DIB y se mueven lateralmente en el plano de la membrana.Finalmente, registre una serie de imágenes de membrana que permitan un seguimiento adecuado de la posición y el monitoreo del estado abierto-cerrado de los canales iónicos individuales. Para determinar el tipo de movilidad lateral y el estado de actividad del canal, adquirir trayectorias suficientemente largas y bien muestreadas. La estructura crioEM de Neurospora crassa TOM-CC se muestra aquí.Las mitocondrias de una tinción de N.crassa que contenía un TOM 22 con una etiqueta 6-His se solubilizaron en DDM y se sometieron a cromatografía de afinidad NTA de níquel y cromatografía de intercambio aniónico. SDS-PAGE de la estructura cristalina aislada de TOM-CC y SDS-PAGE de E. coli OMPF purificada utilizada para la comparación se muestran aquí. La traza de amplitud fluorescente en la trayectoria correspondiente de TOM-CC indica que la actividad del canal abierto-cerrado de TOM-CC se correlaciona con la movilidad de la membrana lateral del complejo.La traza de amplitud muestra tres estados de permeabilidad: estado completamente abierto correspondiente a canales móviles, estado de permeabilidad intermedio y estado de canal cerrado correspondiente a canales no móviles. TOM-CC en el estado intermedio se tambalea alrededor de su posición media en aproximadamente más/menos 60 nanómetros. La traza de amplitud fluorescente en la trayectoria correspondiente de OMPF se muestra aquí.OMPF revela solo un nivel de intensidad en comparación con TOM-CC, independientemente de si está en movimiento o atrapado. Los segmentos de trayectoria correspondientes a los períodos de tiempo de las moléculas atrapadas están marcados en gris. Una cosa importante a tener en cuenta es que este método analiza proteínas de membrana única en un entorno de membrana intacto.La dinámica de las proteínas de membrana seguirá siendo un horizonte para los estudios científicos en el futuro previsible. Esperamos que nuestro método contribuya significativamente a este campo.

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Bioquímica

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Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

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