Name: Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a medir la respiración mitocondrial en neutrófilos de ratón y humanos, y células HL60, utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico. Este método permite cuantificar la función mitocondrial en condiciones normales y de enfermedad.

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Agradecemos al Dr. Anthony T. Vella y a la Dra. Federica Aglianoin del Departamento de Inmunología de UConn Health por su capacitación en el uso del analizador de flujo extracelular metabólico, y a la Dra. Lynn Puddington en el Departamento de Inmunología de UConn Health por su apoyo a los instrumentos. Agradecemos a la Dra. Geneva Hargis de la Facultad de Medicina de UConn por su ayuda con la redacción científica y la edición de este manuscrito. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R01HL145454), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R35GM147713 y P20GM139763), un fondo inicial de UConn Health y una beca de reingreso profesional de la Asociación Americana de Inmunólogos.

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

El procedimiento estándar que mide la respiración mitocondrial de los neutrófilos utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico está limitado por muchos factores, incluido el número de células, el crecimiento celular y la viabilidad. Cada concentración de compuesto varía entre el tipo y la fuente de células en este ensayo. La oligomicina y la rotenona/antimicina A se utilizan principalmente en una concentración similar entre la mayoría de los tipos de células. Sin embargo, como la frecuencia respiratoria máxi...

Las mitocondrias juegan un papel importante en la bioenergética celular, que genera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilación oxidativa (OXPHOS). Además de esto, el papel de las mitocondrias se extiende a la generación y desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, la regulación del calcio de la matriz citoplasmática y mitocondrial, la síntesis celular, el catabolismo y el transporte de metabolitos dentro de la célula1. La respiración mitocondrial es esencial en todas las células, ya que su disfunción puede dar lugar a problemas metabólicos 2, incluyendo enfermedades cardiovasculares3 y una amplia variedad de enfermedades neurodegenerativas, como la degeneración macular relacionada con la edad4, las enfermedades de Parkinson y Alzheimer5, y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Los estudios microscópicos electrónicos sobre neutrófilos revelaron que hay relativamente pocas mitocondrias7, y dependen en gran medida de la glucólisis para su producción de energía, ya que las tasas de respiración mitocondrial son muy bajas8. Sin embargo, las mitocondrias son cruciales para las funciones de los neutrófilos, como la quimiotaxis9 y la apoptosis10,11,12. Un estudio previo reveló una compleja red mitocondrial en neutrófilos humanos con alto potencial de membrana. La pérdida de potencial de la membrana mitocondrial es un indicador temprano de apoptosis de neutrófilos10. El tratamiento con cianuro de carbonilo mitocondrial con cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostró inhibición significativa en la quimiotaxis, junto con un cambio en la morfología mitocondrial 9,10.
Aunque la principal fuente de energía para los neutrófilos es la glucólisis, las mitocondrias proporcionan el ATP que inicia la activación de los neutrófilos al alimentar la primera fase de la señalización purinérgica, lo que aumenta la señalización de Ca2+, amplifica la producción de ATP mitocondrial e inicia las respuestas funcionales de los neutrófilos13. La disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial resulta en una producción excesiva de especies tóxicas reactivas de oxígeno (ROS) y conduce a daños patógenos14,15,16. La NETosis, que es el proceso de formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE), es una propiedad crítica de los neutrófilos que les ayuda a luchar contra los patógenos17 y contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, trombosis y trastornos autoinmunes18. Las ROS derivadas de mitocondrial contribuyen a NETosis19, el ADN mitocondrial puede ser un componente de NETs18, y la homeostasis mitocondrial alterada afecta NETosis 20,21,22,23,24. Además, durante la diferenciación o maduración normal, la reprogramación metabólica de los neutrófilos se invierte al limitar la actividad glucolítica, y participan en la respiración mitocondrial y movilizan los lípidos intracelulares25,26.
El analizador de flujo extracelular metabólico puede monitorear y cuantificar continuamente la respiración mitocondrial de células vivas y la glucólisis. El analizador utiliza un cartucho sensor de formato placa de 96 pocillos y dos fluoróforos para cuantificar la concentración de oxígeno (O2) y los cambios de pH. El cartucho sensor está por encima de la monocapa celular durante el ensayo y forma una microcámara de ~200 nm de altura. Los haces de fibra óptica en el analizador se utilizan para excitar los fluoróforos y detectar los cambios de intensidad fluorescente. Los cambios en tiempo real en la concentración deO2 y el pH se calculan automáticamente y se muestran como tasa de consumo de oxígeno (OCR) y tasa de acidificación extracelular (ECAR). Hay cuatro puertos en el cartucho del sensor que permiten cargar hasta cuatro compuestos en cada pocillo durante las mediciones del ensayo. Este protocolo se centra en cuantificar la respiración mitocondrial de neutrófilos humanos y de ratón, así como las células HL60 similares a los neutrófilos, utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

<table><tbody><tr><td>37 y s&deg; C no CO2&nbsp; incubadora</td><td></td><td>Economía de precisión Modelo 2EG</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Aplicación de software</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo 5810R</td><td>Instrumento Corning</td></tr><tr><td>&nbsp; Cell-Tak Adhesivo para células y tejidos</td><td>Reactivo Corning</td><td>102416-100</td><td>Imán</td></tr><tr><td>EasySep Imán</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de neutrófilos EasySepMouse</td><td>Reactivos STEMCELL</td><td>19762A</td><td>Aplicación</td></tr><tr><td>de software</td><td>Graphpad Prism 9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de albúmina sérica humana (25%)</td><td>Reactivos</td><td></td><td></td> GeminiBio 800-120</tr><tr><td>Ketamina (VetaKet)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-114-10</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos Cubos de placa</td><td>Eppendorf</td><td>UL155</td><td>Accesorio</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN PROGEN</td><td>1895 (1114683 anterior)</td><td>solución de polisacárido</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD18 antihumano de ratón purificado</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td>Clon TS1/18</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td>Reactivos</td></tr><tr><td>Caballito de mar analizador de flujo extracelular metabólico</td><td>Agilent</td><td>XFe96</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Kit de prueba de esfuerzo</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Kit de prueba de esfuerzo mitocondrial</td></tr><tr><td>Rotor de cuchara oscilante</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Vactrap 2 Vacum Trap</td><td>Fox Lifesciences</td><td>3052101-FLS</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Aplicación de software</td><td>Wave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF 1.0 M Solución de glucosa</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>XF 100 mM Solución de piruvato</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>XF 200 mM Solución de glutamina</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>XF DMEM medio</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Material</td></tr><tr><td>Xilacina (Inyección de AnaSed)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Anestésico</td></tr></tbody></table>

medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Los neutrófilos son la primera línea de defensa y los leucocitos más abundantes en los humanos. Estas células efectoras realizan funciones como la fagocitosis y el estallido oxidativo, y crean trampas extracelulares de neutrófilos (NET) para la eliminación microbiana. Nuevos conocimientos sobre las actividades metabólicas de los neutrófilos desafían el concepto inicial de que se basan principalmente en la glucólisis. La medición precisa de las actividades metabólicas puede desplegar diferentes requisitos metabólicos de los neutrófilos, incluido el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) (también conocido como ciclo de Krebs), la fosforilación oxidativa (OXPHOS), la vía de la pentosa fosfato (PPP) y la oxidación de ácidos grasos (FAO) en condiciones fisiológicas y en estados de enfermedad. Este documento describe un protocolo paso a paso y requisitos previos para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como un indicador de la respiración mitocondrial en neutrófilos derivados de la médula ósea del ratón, neutrófilos derivados de la sangre humana y la línea celular HL60 similar a los neutrófilos, utilizando el análisis de flujo metabólico en un analizador de flujo extracelular metabólico. Este método se puede utilizar para cuantificar las funciones mitocondriales de los neutrófilos en condiciones normales y de enfermedad.

Se muestra una dinámica representativa de OCR que indica los cambios en la respiración mitocondrial en respuesta a la mezcla de oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A de neutrófilos de ratón (Figura 3A), neutrófilos humanos (Figura 3B) y células HL60 indiferenciadas y diferenciadas (Figura 3C). En todas las células, el tratamiento con oligomicina disminuye el valor de OCR al inhibir el canal de protones de la ATP sintasa; El trat...

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Este protocolo se centra en cuantificar la respiración mitocondrial de neutrófilos humanos y de ratón, así como células HL60 similares a neutrófilos utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico. Este método nos permite cuantificar la función mitocondrial en neutrófilos en condiciones normales y de enfermedad. Esta es una técnica sencilla que puede proporcionar información sobre la función mitocondrial de las células en respuesta a medicamentos o cualquier condición de enfermedad.Dado que diferentes células tienen diferente eficiencia respiratoria mitocondrial, la optimización de la densidad de siembra celular y la concentración de reactivos debe realizarse con precisión para obtener resultados de alta calidad. Para comenzar el ensayo de flujo extracelular metabólico, tome un cartucho sensor empaquetado sobre una placa de 96 pocillos especialmente diseñada y transfiera 200 microlitros de medio de calibración a cada pocillo de la placa subyacente. Levante con cuidado el cartucho y la placa con calibrante, y colóquelo en una incubadora humidificada sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante la noche para hidratarse.A continuación, según el tipo de célula, cubra la placa de 96 pocillos con un recubrimiento específico para garantizar la adhesión celular. Después, lave las placas con 200 microlitros de PBS estéril dos veces. Preparar el medio de ensayo en DMEM con un piruvato milimolar, 10 milimolares de glucosa y dos milimolares de glutamina.Obtener las células de ratón y neutrófilos humanos como se describe en el texto manuscrito. Para los neutrófilos obtenidos del ratón, ajuste la densidad celular a 1,1 veces 10 a la sexta células por mililitro agregando medio de ensayo. Luego siembre 180 microlitros de la suspensión de neutrófilos de ratón por pocillo en la placa preparada de 96 pocillos.Del mismo modo, ajuste la densidad de células de neutrófilos humanos a 2,2 veces 10 a la sexta células por mililitro utilizando el medio de ensayo. El día del ensayo, cuente las células HL60 similares a los neutrófilos manualmente con el hemocitómetro. Luego centrifugar las células HL60 diferenciadas o indiferenciadas a 300 G a temperatura ambiente durante cinco minutos.Lave las células con DMEM una vez y vuelva a suspenderlas en el medio de ensayo para lograr una densidad celular de 1,39 veces 10 a la sexta células por mililitro. A continuación, siembre 180 microlitros de células HL60 diferenciadas o indiferenciadas en la placa de 96 pocillos preparada previamente que contiene las muestras de neutrófilos humanos y de ratón. Finalmente, agregue un medio completo a los pocillos de esquina de la placa de cultivo celular desprovisto de células para la corrección de fondo durante la siembra.Centrifugar la placa a 300 G a temperatura ambiente durante tres minutos sin descanso para garantizar la adherencia adecuada de las células en la parte inferior de la placa. Finalmente, incubar la placa durante una hora para preequilibrar las células con el medio de ensayo. Abra el kit de prueba de esfuerzo mitocondrial y prepare los reactivos según las instrucciones del fabricante.A continuación, cargue el cartucho con reactivos, comenzando con la oligomicina preparada en el puerto A, FCCP en el puerto B y la mezcla de rotenona/antimicina A en el puerto C para preparaciones inyectables. Llene los puertos no utilizados con 20 microlitros de medio de ensayo. Equilibre el sistema de ensayo a 37 grados centígrados al menos cinco horas antes del ensayo abriendo el software Wave y haciendo clic en la pestaña Calentador activado.Después de alcanzar la temperatura, la esquina inferior izquierda del software Wave se muestra lista. Abra una plantilla para el kit de ensayo de estrés mitocondrial en el software. Seleccione estrategias de inyección en el lado izquierdo, luego haga clic en Agregar y nombre la condición de inyección como neutrófilos humanos o neutrófilos de ratón o HL60.Seleccione el puerto A a D haciendo clic en cada uno, y haga clic en Agregar compuesto e ingrese oligomicina o FCCP o rotenona/antimicina A con las concentraciones respectivas. Seleccione Pretratamiento en el lado izquierdo, luego haga clic en Agregar y asígneles el nombre CD18 y Cell Tak por separado. Seleccione el Tipo de celda en el lado izquierdo.Luego haga clic en Agregar y asígneles el nombre Neutrófilos humanos, Neutrófilos de ratón y HL60 o DHL60 con una densidad de alimentación según corresponda. Defina los grupos haciendo clic en Agregar grupo. Luego haga clic en la definición subrayada.Haga clic en Mapa de placas en el menú superior para observar todos los grupos con definiciones en el lado izquierdo y el mapa de placas a la derecha. Arrastre y suelte para agregar cada pozo al grupo mientras mantiene los cuatro pozos de esquina como fondo. Para configurar el protocolo, seleccione la pestaña Protocolo en el menú superior y defina tres ciclos de mezcla de línea de base, oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A, estableciendo el tiempo para mezclar como tres minutos, el resto como cero minutos y la medición como siete minutos.Vaya a la página Ejecutar ensayo, proporcione la información de resumen del proyecto como referencia y haga clic en Iniciar ejecución. Proporcione la ubicación para guardar los archivos para que todos los resultados se guarden después de completar el ensayo. Luego haga clic en Iniciar ejecución nuevamente.Después de la carga automática del ensayo, espere a que se abra la bandeja para colocar el cartucho sensor y la placa con 200 microlitros de calibrante. Coloque la dirección del código de barras del cartucho mirando hacia la derecha. Ejecute la calibración haciendo clic en Estoy listo, lo que tarda aproximadamente 20 minutos.Después de la calibración, haga clic en Abrir bandeja, reemplace la placa con la placa sembrada de celdas y haga clic en Estoy listo para continuar el ensayo. Después de completar el ensayo, los datos se guardan automáticamente. Exporte los resultados a una hoja de cálculo u otro archivo de software de análisis.Trazar el gráfico y analizar los datos. La dinámica representativa de la tasa de consumo de oxígeno u OCR indicó cambios en la respiración mitocondrial en neutrófilos humanos y de ratón, así como células HL60 indiferenciadas y diferenciadas en respuesta a oligomicina, FCCP y la mezcla de rotenona y antimicina A. Los valores de OCR disminuyeron en todas las células después del tratamiento con oligomicina debido a la inhibición del canal de protones de la ATP sintasa. El tratamiento FCCP aumentó el flujo de electrones y el consumo de oxígeno para restaurar el valor de OCR y lograr la respiración máxima.Una mezcla de rotenona y antimicina A bloqueó los complejos 1 y 3 de la cadena de transporte de electrones, lo que llevó a la eliminación de la respiración mitocondrial. Se observó una disminución de la respiración mitocondrial en las células HL60 después de la diferenciación dirigida a neutrófilos. Se encontró que las células HL60 diferenciadas tienen una respiración mitocondrial basal significativamente más baja, respiración vinculada a fugas de protones, respiración vinculada a ATP y respiración no mitocondrial.El aumento en la respiración máxima de las células HL60 diferenciadas no fue sustancial, mientras que la capacidad respiratoria de reserva aumentó significativamente. Asegúrese de que las celdas estén en la parte inferior de la placa, ya que el cartucho del sensor no debe tener ningún obstáculo debido a las celdas flotantes mientras lee el valor de OCR. Esta técnica ayudaría a los investigadores a estudiar el efecto de los fármacos o la disfunción mitocondrial en estudios asociados a neutrófilos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

Este video muestra el método para analizar el metabolismo energético en células NK humanas activadas utilizando un analizador de flujo extracelular. Diferentes inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones influyen en la síntesis de ATP, que se mide a través de la tasa de consumo de oxígeno u OCR, lo que proporciona información sobre el metabolismo celular y la bioenergética.

Monitorización en tiempo real del metabolismo energético en células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular

Leucocitos de la sangre y las plaquetas pueden ser utilizados como un marcador bioenergético de la salud general de un individuo y así tienen el potencial para controlar procesos patológicos y el impacto de los tratamientos. Aquí se describe un método para aislar y medir la función mitocondrial y la explosión oxidativa en estas células.

Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo práctico para evaluar la disfunción mitocondrial asociada a fatiga en pacientes con cáncer. Este innovador protocolo está optimizado para uso clínico que implica flebotomía estándar y procedimientos básicos de laboratorio.

Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer

La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

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Monitoreo en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

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La red mitocondrial es extremadamente compleja, lo que hace que sea muy difícil de analizar. Una novedosa herramienta de MATLAB analiza mitocondrias con imágenes confocales en vivo en imágenes timelapse, pero da como resultado un gran volumen de salida que requiere atención manual individual. Para solucionar este problema, se desarrolló una optimización de rutina que permite un análisis rápido de los archivos.

Análisis automatizado optimizado de la modulación de la homeostasis de las mitocondrias neuronales vivas mediante receptores de ácido retinoico específicos de isoformas

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

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Aprende a medir la respiración mitocondrial en neutrófilos de ratón y humanos, y células HL60, utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico. Este método permite cuantificar la función mitocondrial en condiciones normales y de enfermedad.

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