Name: Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprende a utilizar zSpRY-ABE8e para edición de bases sin restricciones PAM en Danio rerio. Este método computacional permite modelar enfermedades genéticas humanas como la anemia de Diamond-Blackfan con alta precisión.

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Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación y Desarrollo del Área Clave de la Provincia de Guangdong (2019B030335001), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2019YFE0106700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070819, 31970782) y el Programa del Fondo de Investigación del Laboratorio Provincial Clave de Biología Patogénica y Epidemiología para Animales Acuáticos Económicos de Guangdong (PBEA2020YB05).

Este estudio se realizó en estricto cumplimiento de las directrices del Comité de Cuidado y Uso de la Universidad Normal del Sur de China.
1. Preparación de ARNg modificado sintéticamente y ARNm de zSpRY-ABE8e
<ol><li>Diseñar el ARNg según publicaciones anteriores37,38.<ol><li>Seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM (donde R es A o G, e Y es C o T)18. Asegúrese de que el nucleótido de adenina objetivo esté en la ventana de edición altamente activa (tercer a noveno nucleótido a lo largo del protoespaciador).</li>
	</ol></li>
	<li>Solicite EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificado con 2′-O-metil-3′-fosforotioato (MS) en ambos extremos (Figura 1). NOTA: El ARNg EE debe disolverse en agua libre de RNasa y almacenarse a -80 °C.</li>
	<li>Linealizar el plásmido zSpRY-ABE8e18.<ol><li>Linealizar 6 μg del plásmido con la enzima XbaI (Tabla de materiales) en un baño metálico a 37 °C durante 3 h.</li>
		<li>Purificar el plásmido linealizado utilizando el kit de purificación de ADN (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcribir el ARNm utilizando el kit de transcripción in vitro (Tabla de materiales).<ol><li>Transcribir el ARNm zSpRY-ABE8e con el plásmido linealizado como plantilla de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Todas las operaciones que involucran ARNm y ARNg requieren el uso de suministros de laboratorio libres de RNasa.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice el kit de purificación de ARN (Tabla de materiales) para purificar el ARNm de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Antes de eluir, el etanol debe secarse para evitar la citotoxicidad, y el ARNm debe almacenarse a -80 °C si no se usa inmediatamente.</li>
</ol>2. Preparación de capilares de vidrio de microinyección
<ol><li>Configure el sistema de extracción de micropipetas y precaliente durante al menos 30 minutos.</li>
	<li>Realice una prueba de rampa para determinar el valor calorífico necesario para fundir los capilares de vidrio de borosilicato (con 1 mm de diámetro exterior y 0,58 mm de diámetro interior) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Seleccione un programa y haga clic en el número del teclado para introducir los valores de los parámetros. Establezca los siguientes parámetros para tirar de los capilares de vidrio: calor = valor de prueba de rampa, tracción = 50, velocidad = 100, tiempo = 50 y presión = 30.</li>
	<li>Instale el tubo capilar, asegurándose de que esté en la ranura. Presione PULL START/STOP para ejecutar el programa.</li>
	<li>Conserve los capilares tirados insertándolos en espuma que contenga huecos, manteniendo la aguja suspendida.</li>
</ol>3. Microinyección de la mezcla de ARNm de zSpRY-ABE8e y ARNg de EE en embriones de pez cebra
<ol><li>Instale tanques de cría la noche antes de la inyección. Inserte un divisor, coloque dos hembras y un macho de pez cebra de cepa AB (3-18 meses de edad) en cada tanque y cubra con la tapa. Consulte las publicaciones anteriores para las distinciones de género39. NOTA: Para obtener más embriones, seleccione peces que no hayan estado criando durante al menos 1 semana.</li>
	<li>A la mañana siguiente antes de la inyección, descongele el ARNm de zSpRY-ABE8e y el ARNg de EE en hielo. Mezclar el ARNm y el ARNg hasta concentraciones finales de 400 ng/μL y 200 ng/μL, respectivamente.<ol><li>Realice todo el procedimiento en hielo utilizando puntas y tubos sin RNasa, y manéjelo con guantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure el microinyector neumático. Cierre la válvula de presión parcial de la bomba de aire y abra primero la válvula principal, desenrosque el cilindro de gas y ajuste la presión de la válvula de presión parcial a 0.2 MPa / 29 psi.<ol><li>Encienda el microinyector neumático, ajuste el modo a TIMER y ajuste el valor de presión del parámetro inicial a 20,0 psi y el valor del TIMER a 0,040 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Use pinzas finas para romper cuidadosamente las agujas de los capilares de vidrio tirado bajo un microscopio estereoscópico, asegurándose de que las agujas se corten en ángulo para facilitar la perforación del corion y el óvulo. NOTA: El punto de rotura de la aguja debe estar en el lugar correcto y ser lo suficientemente fuerte como para perforar el huevo, pero lo suficientemente delgado como para minimizar el daño al huevo.</li>
	<li>Añadir la mezcla de zSpRY-ABE8e mRNA y gRNA a la punta de un capilar de vidrio utilizando una punta de pipeta microloader, evitando burbujas en el capilar. Conecte la aguja al micromanipulador y configure la presión y el valor de TEMPORIZADOR del inyector para garantizar que se produzcan 2 nL de mezcla por inyección utilizando una microtapa.</li>
	<li>Desenchufe los divisores de los tanques de reproducción y permita que los peces se reproduzcan durante 10-15 minutos. Recoja los óvulos usando un colador y examine la etapa celular y la calidad de los huevos bajo un microscopio estereoscópico. Seleccione los huevos en el estado de celda única para la inyección para mejorar la eficiencia de edición.</li>
	<li>Forre los huevos en una placa de inyección de agarosa al 1,5% e inyecte 2 nL de la mezcla en la célula, no en la yema, de los embriones bajo un microscopio para mejorar la eficiencia de edición. Retener al menos 15 huevos como grupo de control.</li>
	<li>Use 1x tampón E3 para recolectar los huevos en placas de Petri y colóquelos en una incubadora a 28 ° C. Retire los huevos muertos y cambie el tampón de cultivo cada 12 h hasta 48 horas después de la fertilización (hpf).</li>
</ol>4. Análisis de eficiencia de la edición base con EditR
<ol><li>A 48 hpf, recolecte tres grupos de seis embriones inyectados seleccionados al azar y seis embriones de control seleccionados al azar en tubos de PCR, respectivamente. Utilice una pipeta para aspirar el tampón E3 residual.</li>
	<li>Añadir 40 μL de NaOH de 50 mM en los tubos de PCR. Poner los tubos en un baño metálico a 95 °C durante 20 min, y luego vórtice durante 15 s.</li>
	<li>Añadir 4 μL de 1 M Tris· HCl (pH 8.0) en cada tubo para neutralizar el NaOH. Centrifugar brevemente a 2.000 x g durante 10 s a temperatura ambiente para eliminar las gotas de la pared del tubo. Recoger el sobrenadante en nuevos tubos de PCR y almacenarlos a -20 °C.</li>
	<li>Diseñar cebadores apropiados aguas arriba y aguas abajo de los sitios objetivo de ARNg. Utilice 1 μL del sobrenadante anterior como plantilla para las reacciones de PCR de volumen de 50 μL. Los cebadores utilizados para la PCR en este estudio se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.</li>
	<li>Realizar una electroforesis en gel de agarosa de ADN para asegurar bandas correctas y específicas, seguida de la secuenciación de Sanger como se describió anteriormente40.</li>
	<li>Analizar los datos de secuenciación de Sanger con el programa EditR (1.0.10)41.<ol><li>Cargue el archivo de secuenciación (formato ab1) en el cuadro "Cargar archivo .ab1".</li>
		<li>Introduzca la secuencia de ARNg de 20 pb en orientación 5′-3′ en el cuadro "Introducir secuencia de ARNg".</li>
		<li>Abra el archivo de secuenciación (formato ab1) y confirme las posiciones base donde comienza y termina la secuencia de ARNg de 20 pb. Introduzca la posición base correspondiente en los cuadros "5′ inicio" y "3′ final".</li>
		<li>Haga clic en Edición prevista para obtener la eficiencia de edición base. Compruebe la calidad de los datos de secuenciación cerca de la secuencia diana de ARNg para evitar picos o indeles desordenados. NOTA: En general, los picos desordenados se pueden eliminar eficazmente ajustando la temperatura de recocido de PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
<li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C%3AG+to+T%3AA+base+pairs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li>
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<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435(2022).</li>
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<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este protocolo describe la construcción de un modelo de enfermedad del pez cebra utilizando el editor base zSpRY-ABE8e. En comparación con la vía HDR tradicional para la sustitución de bases, este protocolo puede lograr una edición de base más eficiente y reducir la aparición de indeles. Al mismo tiempo, este protocolo implica la implementación de la estrategia de eliminación de genes i-Silence recientemente propuesta en el pez cebra. En conjunto, zSpRY-ABE8e mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en la investiga...

Las variantes de un solo nucleótido (SNV) que causan mutaciones sin sentido o sin sentido son la fuente más común de mutaciones en el genoma humano1. Para determinar si un SNV en particular es patógeno y para arrojar luz sobre su patogénesis, se requieren modelos animales precisos2. El pez cebra son buenos modelos de enfermedades humanas, exhibiendo un alto grado de homología fisiológica y genética con los humanos, un ciclo de desarrollo corto y una fuerte capacidad reproductiva, lo que es ventajoso para la investigación de características y mecanismos patogénicos, así como para el cribado de drogas3.
El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9 se ha aplicado ampliamente en la edición del genoma de varias especies, incluido el pez cebra4. Con la guía de ARNg, el sistema CRISPR / Cas9 puede generar roturas de doble cadena de ADN (DSB) en el sitio objetivo, lo que luego permite la sustitución de base única a través de la recombinación del sitio objetivo con plantillas de ADN del donante a través de la vía de reparación dirigida por homología (HDR). Sin embargo, la eficiencia de este método de reemplazo de bases es bastante baja, ya que el proceso de reparación del ADN celular se lleva a cabo principalmente por la vía de unión final no homóloga (NHEJ), que generalmente se acompaña de mutaciones de inserción y deleción (indel)5. Afortunadamente, la tecnología de edición de base única basada en CRISPR / Cas9 alivia significativamente este problema mediante el uso de editores de base, que permiten una edición de base única más eficiente sin inducir DSB. Se han desarrollado dos clases principales de editores de base, los editores de base de adenina (ABE) y los editores de base de citosina (CBE), para implementar la edición de sustitución de bases para A· T a G· C y C·G a T· A, respectivamente 6,7,8,9,10,11. Estos cuatro tipos de sustituciones de bases cubren el 30% de las variantes patogénicas humanas12. Se ha informado que ambas clases de editores base, incluidos PmCDA1, BE system, CBE4max, ABE7.10 y ABE8e, funcionan en peces cebra, con BE4max y ABE8e especialmente reportados para lograr una alta actividad de edición 13,14,15,16,17,18,19.
Las proteínas Cas9 de diferentes especies, incluyendo Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y S. canis, se han implementado en la edición de genes de pez cebra, con el Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) siendo el más ampliamente utilizado20,21,22,23. Sin embargo, SpCas9 sólo puede reconocer sitios objetivo con un motivo adyacente al protoespaciador NGG (PAM), lo que limita su rango editable y puede resultar en que no se encuentre una secuencia adecuada cerca del sitio patógeno de interés24. Para ampliar el rango objetivo, se han diseñado una variedad de variantes de SpCas9 para reconocer diferentes PAM a través de la evolución dirigida y el diseño guiado por la estructura. Sin embargo, pocas variantes son efectivas en animales, especialmente en el pez cebra, lo que limita la aplicación del pez cebra en la investigación de enfermedades relacionadas con SNV25,26,27,28. Recientemente, se ha informado que dos variantes de SpCas9, SpG y SpRY, con restricciones de PAM menos estrictas (NGN para SpG y NNN para SpRY con una mayor preferencia por NRN que NYN) exhiben una alta actividad de edición en células y plantas humanas 29,30,31,32. Posteriormente, también se ha informado que SpG y SpRY, así como varios de sus editores de base mediados, como los CBE mediados por SpRY y los ABE mediados por SpRY, trabajan en peces cebra, lo que mejorará la aplicación de modelos de pez cebra en el estudio mecanicista y la detección farmacológica de enfermedades relacionadas con SNV 18,33,34,35. Además, i-Silence se propuso como una estrategia efectiva y precisa de eliminación de genes a través de la conversión de codones de inicio mediada por ABE de ATG a GTG o ACG36. La combinación de la estrategia i-Silence y el editor base mediado por SpRY zSpRY-ABE8e proporciona un nuevo método para el modelado de enfermedades18. Este protocolo demuestra cómo realizar la edición de genes usando zSpRY-ABE8e en pez cebra para construir un modelo tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. Se evaluó y analizó la eficiencia de edición y los fenotipos que aparecen en los modelos de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1.5% Agarosa utilizada para hacer una placa de inyección</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra Kit de clonación de un solo paso</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>Kit para clon de infusión&nbsp;</td></tr><tr><td>Servicio de optimización de codones</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Longitud:32 mm, capacidad:0.5 &mu; L</td></tr><tr><td>Servicio de ARNg EasyEdit</td><td></td> Pinzas finas GenScript <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumento científico fino</td><td>11254-20</td><td>Se utiliza para romper meedle</td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas flameado/marrón&nbsp;</td><td>Instrumento de tartamudez</td><td>P-97</td><td>Se utiliza para extraer los capilares de vidrio</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>Se utiliza para la reacción de PCR</td></tr><tr><td>Caja de clima artificial inteligente</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Se utiliza para cultivar embriones de pez cebra</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Se utiliza para fijar el pez cebra al fotografiar</td></tr><tr><td>las puntas de pipeta del microcargador nbsp;</td><td>Kit Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II Kit de mutagénesis rápida V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Kit para mutagénesis dirigida al sitio</td></tr><tr><td>Microinyector neumático</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>Kit para purificación de ARN</td></tr><tr><td>Sanger Servicio de secuenciación Sangon</td><td>Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, granular</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH utilizado para la extracción del genoma</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>Utilizado para la fotografía del fenotipo</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom de la serie SZ</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>mMESSAGE Ambion</td><td>AM1348</td><td>Kit para transcripción in vitro&nbsp;</td></tr><tr><td>TIANprep Mini Kit de Plásmidos</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Kit para extracción de plásmidos</td></tr><tr><td>TIANquick Mini Kit de Purificación TIANGEN</td><td></td><td>DP203-02</td><td>Kit para la purificación de plásmido linealizado</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Utilizado para anestesiar el pez cebra</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Componente de Tris&middot; HCl utilizado para la extracción del genoma</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Endonucleasa de restricción utilizada para la linealización de plásmidos</td></tr></tbody></table>

edición de base eficiente sin pam para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

La tecnología CRISPR / Cas9 ha aumentado el valor del pez cebra para modelar enfermedades genéticas humanas, estudiar la patogénesis de enfermedades y la detección de fármacos, pero las limitaciones del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos de trastornos genéticos humanos causados por variantes de un solo nucleótido (SNV). Hasta ahora, algunas variantes de SpCas9 con amplia compatibilidad con PAM han demostrado eficiencia en el pez cebra. La aplicación del editor de base de adenina (ABE) mediado por SpRY optimizado, zSpRY-ABE8e y el ARNg modificado sintéticamente en el pez cebra ha permitido una conversión eficiente de la base de adenina-guanina sin restricción de PAM. Aquí se describe un protocolo para la edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM en peces cebra que usan zSpRY-ABE8e. Al inyectar una mezcla de ARNm de zSpRY-ABE8e y ARNg modificado sintéticamente en embriones de pez cebra, se construyó un modelo de enfermedad del pez cebra con una mutación precisa que simulaba un sitio patogénico del factor de maduración del ribosoma TSR2 (tsr2). Este método proporciona una herramienta valiosa para el establecimiento de modelos de enfermedad precisos para estudiar los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.

Se ha descrito que la mutación de TSR2 causa anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aquí, se construyó un modelo de pez cebra DBA con una mutación tsr2 (M1V) utilizando la estrategia i-Silence. La adenina del codón de inicio del pez cebra tsr2 se convirtió con éxito en guanina utilizando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
El análisis EditR de los resultados de la secuenciación de Sanger mostró que había una superposición A/G en...

Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Este protocolo permite a los investigadores construir una serie de modelos de pez cebra previamente no disponibles de variantes de un solo nucleótido relevantes para la enfermedad. Las limitaciones de PAM son un obstáculo importante para crear modelos animales precisos, y zSpRY-ABE8e permite una conversión eficiente de adenina a base de guanina con baja intermutación y restricción de PAN relajada. Esta herramienta se puede utilizar para construir modelos precisos de pez cebra para estudiar las características patogénicas de los mecanismos de la enfermedad relacionados con los marinos de un solo nucleótido, así como la detección de fármacos para esta enfermedad.Para empezar, configure el sistema extractor de micropipetas y precaliente durante al menos 30 minutos. Para tirar de los capilares de vidrio, seleccione un programa, establezca el valor de la prueba de rampa como calor, 50 como tracción, la velocidad en 100, el tiempo como 50 y la presión en 30. A continuación, instale el tubo capilar asegurándose de que esté en la ranura.Presione pull start/stop" para ejecutar el programa. Para preservar los capilares extraídos, insértelos en espuma que contenga espacios que mantengan la aguja suspendida. Para la experimentación, use el ARNm zSpRY-ABE8e descrito en el manuscrito, y edite fácilmente el ARNg modificado con fosforotioato de 2'O-metilo en ambos extremos.Para el diseño de ARNg, seleccione preferentemente NRN como la secuencia PAM, ya que zSpRY-ABE8e muestra una mayor preferencia por NRN PAM que NYN PAM. Ingrese el nucleótido de adenina objetivo en la ventana de edición altamente activa del tercer al noveno nucleótido a lo largo del protoespaciador. Instale tanques de cría la noche antes de la inyección.Inserte un divisor, colocando dos peces cebra hembra y uno macho en cada tanque. Coloque una tapa sobre cada tanque. A la mañana siguiente, usando puntas, tubos y guantes libres de RNasa, mezcle el ARNm descongelado y el ARNeg en hielo hasta una concentración final de 400 y 200 nanogramos por microlitro, respectivamente.Para configurar el microinyector neumático, primero, cierre la válvula de presión parcial de la bomba de aire. Luego, abra la válvula principal, desenrosque el cilindro de gas y ajuste la presión de la válvula de presión parcial a 0.2 Megapascales. Ahora, encienda el microinyector y configure el modo en temporizador.Ajuste la válvula de presión del parámetro a 20 libras por pulgada cuadrada y el valor del temporizador a 0.040 segundos. Usando pinzas finas, rompa angularmente las agujas de los capilares de vidrio tirado bajo un microscopio estéreo. Con la punta de una pipeta del microcargador, añada la mezcla de ARNm/ARNg a la punta de un capilar de vidrio y conecte la aguja al micromanipulador.Configure el valor de presión y temporizador para producir dos nanolitros de mezcla por inyección utilizando una microcápsula. Después de criar los peces durante 10 a 15 minutos, recoja los huevos en un colador. Examine la etapa celular y la calidad del huevo bajo el microscopio estéreo.Seleccione huevos unicelulares para inyección para mejorar la eficiencia de edición. Alinee los huevos en una placa de inyección de agarosa al 1,5% e inyecte dos nanolitros de la mezcla de ARN en la célula de los embriones con un microscopio. Recoja los huevos en placas de Petri con E3 Buffer e incubarlos a 28 grados centígrados.Retire los huevos muertos y cambie el tampón de cultivo cada 12 horas durante 48 horas después de la fertilización. Después de 48 horas después de la fertilización, recolecte tres grupos de seis embriones inyectados seleccionados al azar en un tubo de PCR. Una vez que se hayan recolectado seis embriones de control seleccionados al azar, use una pipeta para aspirar el tampón E3 residual.Agregue 40 microlitros de hidróxido de sodio milimolar a los embriones. Coloque los tubos en un baño de metal a 95 grados centígrados durante 20 minutos, y luego vórtice durante 15 segundos. Agregue cuatro microlitros de un clorhidrato de Tris molar a pH ocho en cada tubo.Centrifugar los tubos a 2000g durante 10 segundos a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de PCR. Retire un microlitro del sobrenadante del tubo de PCR y utilícelo para la secuenciación de Sanger.Luego guarde el sobrenadante restante a 20 grados centígrados. Para analizar los datos de secuenciación de Sanger, comience cargando el archivo de secuenciación en el cuadro upload ab1 File". Introduzca la secuencia de ARNg de 20 pares de bases en la orientación de 5' a 3' en el cuadro de secuencia de introducción de ARNg.Introduzca la posición base correspondiente en los cuadros 5'start y 3'ends. Obtenga la eficiencia de edición base haciendo clic en edición predictiva" y verificando la calidad de los datos de secuenciación. Se construyó un modelo de pez cebra con anemia de diamante blackfan convirtiendo la adenina del codón de inicio de Tsr2 en guanina.El análisis EditR de los datos de secuencia demostró una superposición de AG en la base de adenina del codón de inicio Tsr2. El fenotipo de los embriones Tsr2 de dos días de edad mostró ojos más pequeños en comparación con los embriones de control. También se observó un pericardio hinchado en los embriones mutantes.Para lograr una edición de base eficiente, siga estrictamente el principio de diseño de directrices mencionado anteriormente, que es un requisito previo para el éxito del experimento. Los modelos precisos son esenciales para el estudio de enfermedades relacionadas con variantes de un solo nucleótido. El desarrollo del SprY-ABE8e proporciona una herramienta eficaz para el modelado preciso, que ayuda a promover la investigación de los mecanismos y tratamientos de la enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

El pez cebra es un excelente sistema modelo para estudios genéticos y de desarrollo. La implantación de perlas es una valiosa técnica de manipulación de tejidos que puede utilizarse para interrogar los mecanismos de desarrollo mediante la introducción de alteraciones en los entornos celulares locales. Este protocolo describe cómo realizar la implantación de microperlas en el embrión de pez cebra.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para marcar proteínas con una etiqueta de proteína de fluorescencia en larvas de pez cebra, un sistema in vivo recientemente desarrollado y modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baja abundancia en pez cebra.

Marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas de baja expresión en el pez cebra

Las rasopatías son síndromes genéticos multisistémicos causados por la hiperactivación de la vía RAS-MAPK. Las variantes potencialmente patógenas que están a la espera de validación surgen continuamente, mientras que la escasa evidencia preclínica limita el tratamiento. Aquí, describimos nuestro protocolo in vivo para probar y validar los niveles de activación de ERK asociados a RASopatía y su modulación farmacológica durante la embriogénesis mediante imágenes FRET en vivo en pez cebra...

Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Aprende a utilizar zSpRY-ABE8e para edición de bases sin restricciones PAM en Danio rerio. Este método computacional permite modelar enfermedades genéticas humanas como la anemia de Diamond-Blackfan con alta precisión.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

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