Name: Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a realizar grabaciones de pinza de parche de células enteras en neuronas de kisspeptina hipotalámicas para estudiar sus propiedades electrofisiológicas. Este método permite medir corrientes iónicas y comprender la regulación neuroendocrina reproductiva.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo [números de subvención FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); y por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código de Finanzas 001" (HRV).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo y fueron realizados de acuerdo con las directrices éticas adoptadas por el Colegio Brasileño de Experimentación Animal.
1. Preparación de soluciones
<ol><li>Preparación de solución interna NOTA: La solución interna llena la micropipeta de la abrazadera de parche y entrará en contacto con el interior de la célula (ver un ejemplo en la Figura 2). Las soluciones internas pueden variar dependiendo del tipo de actividad a medir33.<ol><li>Elija la solución interna teniendo en cuenta su propósito experimental y el tipo de registro apropiado. Para registrar el potencial de membrana en el modo de pinza de corriente, utilice la solución interna compuesta de 120 mM de K-gluconato, 1 mM de NaCl, 5 mM de EGTA, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de CaCl2, 3 mM de KOH, 10 mM de KCl y 4 mM (Mg)-ATP. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, como se indica en la Tabla 1.</li>
		<li>Use suficiente agua desionizada para alcanzar el 90% del volumen final de la solución. Este volumen asegurará suficiente espacio para ajustar el pH y la osmolaridad.</li>
		<li>Después de agregar y mezclar bien todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.2-7.3 con 5 M KOH usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de alrededor de 275-280 mOsm (ajuste, si es necesario, solo hacia abajo).</li>
		<li>Preparar la solución interna con antelación y conservar a 8 °C. Agregue el ATP el día del experimento. Conservar la solución interna que contiene ATP a -20 °C (1 ml de alícuotas) durante 3-4 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la solución de corte<ol><li>Prepare una solución de corte que contenga 238 mM de sacarosa, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,0 mM de NaH 2 PO4, 10 mM de glucosa, 1,0 mM de CaCl 2 y 5,0 mM de MgCl2. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, como se muestra en la Tabla 2. El volumen exacto de esta solución a preparar dependerá del tamaño de la cámara de corte.</li>
		<li>Mientras se mezclan todas las sales en agua desionizada, saturar constantemente con carbógeno (95% O2 y 5%CO2). Conecte un tubo de polietileno (diámetro exterior [OD] de 1,57 mm x diámetro interior [ID] de 1,14 mm) a un cilindro de carbogen para suministrar carbogen a la solución de corte. Sostenga el extremo abierto del tubo dentro del vaso de precipitados que contiene la solución de corte.</li>
		<li>Después de mezclar bien todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.3 con ácido nítrico al 10% usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de 290-295 mOsm (ajuste, si es necesario, solo hacia abajo). Después, enfriar la solución a 0-2 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar la solución aCSF para grabaciones<ol><li>Preparar una solución artificial de líquido cefalorraquídeo (LCR) para grabaciones que contengan 124 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,25 mM deNaH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 5 mM de glucosa y 2,5 mM de CaCl2. Pesar todas las sales de acuerdo con el volumen final deseado, dado en la Tabla 3.</li>
		<li>Mientras se mezclan todas las sales en agua desionizada, saturar constantemente con carbógeno (95% O2 y 5%CO2), como se describe en el paso 1.2.2.</li>
		<li>Después de agregar y mezclar todos los ingredientes, ajuste el pH a 7.3 (se puede usar ácido nítrico al 10%) usando un medidor de pH. Use un osmómetro para verificar la osmolaridad, que debe ser de 290-300 mOsm. Después, vierta el aCSF en un vaso de precipitados y mantenga en un baño de agua a 30 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Disección cerebral y corte
NOTA: Dado que diferentes estructuras cerebrales pueden requerir cortes en diferentes planos (cortes coronales, sagitales u horizontales), el enfoque exacto para obtener los cortes depende de la región del cerebro de interés. Típicamente, para estudiar las células que expresan Kiss1 en las neuronas AVPV / PeN y ARH (aquí denominadas neuronasKisspeptina AVPV / PeN y neuronaskisspeptina ARH; Figura 2A,B), los cortes cerebrales coronales (200-300 μm) se hacen generalmente 17,19,20,21,34. Las neuronas AVPV/PeNKisspeptina se encuentran aproximadamente a 0,5 a -0,22 mm del bregma, mientras que las neuronas ARHkisspeptina están en -1,22 a -2,70 mm. La ubicación de los núcleos se puede determinar mediante el uso de un atlas cerebral de ratón estereotáxico35 o el Atlas de referencia del cerebro del ratón Allen (http://mouse.brain-map.org/). En este estudio se utilizaron ratones adultos Kiss1-Cre/GFP hembra (etapa diestral) y machos36.
<ol><li>Extirpación del cerebro<ol><li>Prepare el sitio de disección y las herramientas necesarias para extraer el cerebro: tijeras de decapitación, tijeras de iris, tijeras curvas Castroviejo, osteotomo, pinzas, espátula, papel de filtro, placa de Petri, cuchilla de afeitar y pegamento de cianoacrilato.</li>
		<li>Antes de hacer las rodajas, prepare el banco en el que se realizará la disección, ya que todos los procedimientos posteriores deben realizarse rápidamente. Asegúrese de tener acceso a un dispositivo de corte como un vibratome.</li>
		<li>Prepare una cámara de grabación para mantener las rebanadas de cerebro antes de cortar el tejido. Adquiera una cámara de grabación, dimensiones de baño de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x W x H), de una marca comercial (Tabla de materiales) o haga una internamente. NOTA: Una cámara de recuperación interna se puede fabricar de la siguiente manera: corte una placa de 24 pocillos para que haya nueve pozos disponibles. Pegue una pantalla de nylon a la base de los nueve pocillos. Con el resto de la placa del pozo, haz una base para que la parte inferior del nylon quede libre. Esta base adaptada se puede colocar dentro de un vaso de precipitados de 500 ml que contiene el aCSF (Figura complementaria 1).</li>
		<li>Después de preparar todo, anestesiar al animal con anestésico inhalado usando 4% -5% de isoflurano. La anestesia debe estar de acuerdo con un protocolo aprobado por el comité de ética. Poco después de que el animal esté inmóvil, realice pruebas de pellizco de cola y pata para asegurarse de que el animal esté profundamente anestesiado.</li>
		<li>Decapitar rápidamente a los ratones mientras el corazón todavía está activo para aumentar la viabilidad celular. Cosecha el cerebro rápidamente después de la decapitación.</li>
		<li>Con tijeras quirúrgicas, haga una incisión en la piel en la parte superior del cráneo del animal, desde caudal hasta rostral, y retire el cuero cabelludo de la cabeza del animal. A continuación, corte la placa interparietal a lo largo de la sutura sagital con las tijeras del iris y retire el hueso occipital. Deslice el osteotomo debajo del hueso parietal y sáquelo suavemente hasta que el cerebro esté expuesto.</li>
		<li>Después de exponer el cerebro, gire la cabeza boca abajo, baje suavemente el cerebro para visualizar el nervio trigémino a cada lado, luego corte el nervio trigémino con tijeras curvas Castroviejo. Después de visualizar el hipotálamo, identifique el nervio óptico y córtelo suavemente. NOTA: Tenga cuidado al cortar el nervio óptico, ya que tirar de él desgarrará el área hipotalámica adyacente que contiene el núcleo AVPV / PeN.</li>
		<li>Cortar la porción más anterior del lóbulo frontal y extirpar el cerebro por completo. Inmediatamente sumerja el cerebro en la solución de corte hasta adquirir las rodajas.</li>
	</ol></li>
	<li>Cortar muestras de cerebro<ol><li>Coloque el cerebro en papel de filtro (apoyado en una placa de Petri) para secar el exceso de solución. Luego, con una cuchilla de afeitar de corte afilado, realice un corte coronal que separa el tronco encefálico con el cerebelo del resto del tejido.</li>
		<li>A continuación, pegue la porción caudal del cerebro a la base del vibratomo y llene la cámara del dispositivo de corte con la solución de corte / aCSF enfriada a 0-2 ° C. Durante el procedimiento, empaque hielo seco alrededor de la cámara de vibratomo para mantener fría la solución de corte.</li>
		<li>Inserte la cuchilla de afeitar en el vibratomo y ajuste los parámetros de corte apropiados del dispositivo: velocidad = 3, frecuencia = 9 y alimentación = 250 μm. Utilice una pipeta de transferencia de acrílico (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas a la cámara de recuperación (descrita en el paso 2.1.3) durante el procedimiento de corte de tejido. Espere 60 minutos para la recuperación del tejido después de la adquisición del corte.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sellado de celdas para grabación
<ol><li>Asegúrese de que todos los equipos (microscopio, amplificador, digitalizador, micromanipulador y otros) estén encendidos antes de comenzar la grabación.</li>
	<li>Llene la cámara de grabación, de una marca comercial (Tabla de materiales), unida al microscopio con la solución aCSF para grabaciones. Use una bomba de perfusión para perfundir constantemente el aCSF a una velocidad de 2 ml / min.</li>
	<li>Transfiera una porción cerebral de interés (una a la vez) a la cámara de grabación. Utilice una pipeta de transferencia de acrílico (pipeta de vidrio Pasteur invertida unida a una tetina de silicona) para transferir las rodajas hipotalámicas a la cámara. Use un anclaje de corte (Tabla de materiales) para sostener el corte de modo que no se mueva durante la perfusión de aCSF.</li>
	<li>Coloque una rebanada en el centro de la cámara de grabación conectada al microscopio. La posición del corte es crítica para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto de la micropipeta de registro.</li>
	<li>Utilice la lente de objetivo de baja potencia de un microscopio de inmersión (10x o 20x) para ayudar a posicionar la rebanada y localizar la región de interés.</li>
	<li>Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia (63x) y enfoque en el nivel del tejido, observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para localizar las células de kisspeptina en la superficie del corte cerebral20.</li>
	<li>Cuando se encuentre una posible celda de destino, márquela en la pantalla del ordenador con el cursor del ratón o dibujando un formato, como un cuadrado, sobre el área de interés. La marca de la pantalla de la computadora ayuda a guiar la posición de la micropipeta de grabación a la célula.</li>
	<li>Después de determinar la ubicación exacta de la célula diana, levante el objetivo e introduzca la micropipeta registradora llena con la solución interna. Al colocar la micropipeta en el soporte del electrodo, asegúrese de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata. NOTA: Para la preparación, colocación y posicionamiento de micropipetas en el soporte del electrodo, consulte33.</li>
	<li>Aplique presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF, para evitar que los residuos entren en la micropipeta, utilizando una jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de micropipeta a través de un tubo de polietileno (≈130 cm más); aplicar casi 100-200 μL de aire.</li>
	<li>Usando el micromanipulador, guíe la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar la micropipeta del eje X-Y-Z hacia la celda de interés.</li>
	<li>Ajuste el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acerque el enfoque, pero no demasiado, a la rodaja. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta hasta el plano de enfoque. Asegúrese de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en el corte, sino que descienda lentamente hasta que toque la superficie de la célula/región objetivo.</li>
	<li>Aplique una ligera presión positiva (≈100 μL) con la jeringa llena de aire de 1-3 ml conectada al soporte de micropipeta para eliminar cualquier residuo de la trayectoria de aproximación.</li>
	<li>Concéntrese en la célula diana y mueva lentamente el micromanipulador en el eje X-Y-Z para acercar la micropipeta a la célula diana. Al tocar la micropipeta con la célula, se observará un hoyuelo causado por la presión aplicada a través de la punta de la micropipeta (Figura 2C).</li>
	<li>Después de formar el hoyuelo, debido a la proximidad de la micropipeta a la célula, aplique una succión débil y breve por vía oral (1-2 s) a través del tubo conectado al soporte de micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la célula (sello gigaohm o gigasello >1 GΩ; Figura 2D). Para formar el sello, utilice el modo de abrazadera de voltaje en el software. Para obtener detalles sobre la formación de focas, consulte33.</li>
	<li>Si el sello permanece estable (el sello gigaohm debe ser mecánicamente estable y sin interferencia de ruido, determinado por observación durante aproximadamente 1 min), ajuste el voltaje de retención en el potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés. Para las neuronas hipotalámicas de kisspeptina, se recomienda -50 mV.</li>
	<li>Aplicar una breve succión por vía oral (presión negativa) con la micropipeta sellada a la célula para romper la membrana plasmática (Figura 2E). La configuración adecuada de toda la célula se logra cuando la succión se realiza con suficiente fuerza para que la membrana rota no obstruya la micropipeta y no atraiga una porción considerable de la membrana o incluso de la célula.</li>
	<li>Consulte el manual de configuración del sistema utilizado. Utilice el software (consulte la Tabla de materiales) para verificar y calcular digitalmente la resistencia en serie (SR) y la capacitancia de celda completa (wcc).</li>
	<li>En el modo de abrazadera de voltaje, después de romper la membrana celular, habilite la opción de celda completa y haga clic en el comando Auto que se refiere a la pestaña de toda la celda. El SR y el wcc de la célula se calcularán automáticamente y el software los mostrará instantáneamente. Estos parámetros también se pueden verificar realizando la prueba de membrana con el amplificador mencionado en la Tabla de materiales33.</li>
	<li>Asegúrese de verificar los parámetros de viabilidad celular. Para las neuronas kisspeptina, compruebe que las mediciones electrofisiológicas son: SR < 25 mΩ, resistencia de entrada > 0,3 GΩ y manteniendo el valor absoluto actual < 30 pA (observaciones personales y referencia21). El valor medio del wcc de las neuronas AVPV/PeN kisspeptina oARH kisspeptina es ≈ 10-12 pF en ratones con gónadas intactas20.</li>
	<li>Monitoree la RS y la capacitancia de estado estacionario de la celda durante los experimentos. Asegúrese de que el SR no cambie más del 20% durante una grabación y que la capacitancia de la membrana sea estable.</li>
	<li>Compruebe la configuración del software. Crear protocolos específicos para las grabaciones según el tipo de experimento. Para registrar el potencial de membrana en el modo de abrazadera de corriente, con el equipo mencionado en la Tabla de materiales, el filtro de paso bajo filtra las señales electrofisiológicas a 2-4 kHz y analiza los resultados fuera de línea en un software (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el software).</li>
	<li>Una vez que la configuración de toda la celda se haya logrado correctamente, mida las corrientes sinápticas en modo de abrazadera de voltaje (Figura 2G). Registrar los cambios en el potencial de membrana en reposo (RMP) y las variaciones de RMP inducidas en el modo de pinza de corriente (Figura 2H). Los cambios en la PMR, como la despolarización de la membrana celular, pueden ser inducidos mediante la administración de un fármaco/neurotransmisor conocido al baño (descrito en el paso 3.2), como se ilustra en la Figura 1. NOTA: En el modo de abrazadera de corriente, se puede inyectar corriente positiva o negativa para mantener el voltaje de la membrana a un voltaje deseado. Para las neuronas kisspeptina, generalmente establecemos una inyección de corriente cero (I = 0) para registrar la variación espontánea del potencial de membrana.</li>
</ol>

No se declararán conflictos de intereses.

El desarrollo de la técnica de patch-clamp de células enteras tuvo un impacto significativo en la comunidad científica, siendo considerado de suma importancia para desarrollar la investigación científica y permitir varios descubrimientos. Su impacto en la ciencia fue suficiente para culminar en el Premio Nobel de Medicina en 1991, ya que este descubrimiento abrió la puerta a una mejor comprensión de cómo funcionan los canales iónicos en condiciones fisiológicas y patológicas, así como a la identif...

Hodgkin y Huxley hicieron el primer registro intracelular de un potencial de acción descrito en varios estudios científicos. Este registro se realizó en el axón del calamar, que tiene un gran diámetro (~ 500 μm), lo que permite colocar un microelectrodo dentro del axón. Este trabajo proporcionó grandes posibilidades para la investigación científica, culminando más tarde en la creación del modo de pinza de voltaje, que se utilizó para estudiar la base iónica de la generación de potencial de acción 1,2,3,4,5,6,7,8. A lo largo de los años, la técnica ha sido mejorada y se ha aplicado ampliamente en la investigación científica 6,9. La invención de la técnica patch-clamp, que tuvo lugar a finales de la década de 1970 a través de estudios iniciados por Erwin Neher y Bert Sakmann, permitió a los investigadores registrar canales iónicos individuales y potenciales o corrientes de membrana intracelular en prácticamente todos los tipos de células utilizando un solo electrodo 9,10,11,12 . Las grabaciones de patch-clamp pueden realizarse en una variedad de preparaciones tisulares, como células cultivadas o cortes de tejido, ya sea en modo de pinza de voltaje (sosteniendo la membrana celular a una tensión establecida que permita el registro de, por ejemplo, corrientes dependientes de voltaje y corrientes sinápticas) o en modo de abrazadera de corriente (que permite registrar, por ejemplo, cambios en el potencial de membrana en reposo inducidos por corrientes de iones, potenciales de acción, y frecuencia de potencial postsináptico).
El uso de la técnica patch-clamp hizo posible varios descubrimientos notables. De hecho, los hallazgos seminales sobre las propiedades electrofisiológicas de las neuronas kisspeptina hipotalámicas localizadas en los núcleos periventricular anteroventral y periventricular rostral (AVPV/PeNKisspeptin), también conocida como área periventricular rostral del tercer ventrículo (RP3V), y el núcleo arqueado del hipotálamo (ARHkisspeptina)13,14,15 son de particular interés. En 2010, Ducret et al. realizaron las primeras grabaciones de neuronas AVPV / PeNKisspeptinen ratones utilizando otra herramienta electrofisiológica, la técnica de pinza de parche de células sueltas. Estos estudios proporcionaron una descripción eléctrica de las neuronas AVPV/PeNKisspeptina y demostraron que sus patrones de disparo dependen del ciclo estral16. En 2011, Qiu et al. utilizaron la técnica de patch-clamp de células enteras para demostrar que las neuronas ARHkisspeptina expresan corrientes endógenas de marcapasos17. Posteriormente, Gottsch et al. demostraron que las neuronas kisspeptina exhiben actividad espontánea y expresan corrientes de calcio tipo h (marcapasos) y tipo T, sugiriendo que las neuronas dekisspeptina ARH comparten propiedades electrofisiológicas con otras neuronas marcapasos del sistema nervioso central18. Además, se ha demostrado que las neuronas dekisspeptina ARH exhiben tasas de disparo sexualmente dimórficas y que las neuronas AVPV/PeNKisspeptina exhiben un potencial de membrana en reposo bimodal (RMP) influenciado por canales de potasio sensibles al ATP (K ATP)19,20. Además, se estableció que los esteroides gonadales afectan positivamente la actividad eléctrica espontánea de las neuronas kisspeptina en ratones 19,20,21. Los primeros trabajos que estudian las propiedades electrofisiológicas de las neuronas kisspeptina se mencionan 16,17,18,19,20. Desde entonces, muchos estudios han utilizado la técnica de patch-clamp de células enteras para demostrar qué factores/neuromoduladores son suficientes para modular la actividad eléctrica de las neuronas kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Dada la importancia de esta técnica para el estudio de las neuronas que se requieren para la reproducción, entre otros tipos de células no cubiertas aquí, este artículo describe los pasos básicos para el desarrollo de la técnica de pinza de parche de células completas, como preparar las soluciones, diseccionar y cortar el cerebro y realizar el sello de la membrana celular para las grabaciones. Además, se discuten cuestiones relevantes sobre la técnica, como sus ventajas, limitaciones técnicas y variables importantes que deben controlarse para un rendimiento experimental óptimo.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Compuestos para aCSF, soluciones internas y de corte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td></td><td>KCL Sigma Aldrich/varios</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ácido nítrico</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>225711</td><td>PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air table</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador</td><td>varios-DIGIDATA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1440 SISTEMA DE ADQUISICIÓN DE DATOS DE BAJO RUIDO</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica digital</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de imagen</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>Osteotomo</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/varios</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuperación</td><td>Warner Instruments/Harvard aparato-se</td><td></td> <td>puede hacer internamente Cámara de</td></tr><tr><td>grabación</td><td>Warner Instruments</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Fisher Scientific /varios</td><td>FISH-14-375-10; FISH-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo&nbsp;</td>Baño de agua <td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific/varios</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Software y sistemas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10</td><td>Software Molecular</td> <td>Devices-Commander</td><td></td></tr> <tr><td>Sistema de campo amplio LAS X</td><td>Leica-Adquisición</td> <td>y</td> <td>análisis de imágenes</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commander Software</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 SOFTWARE PARA WINDOWS</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp 10 Standard</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrodo, pellet, 1,0 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>Pinza hemostática curvada</td><td>varios-pegamento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de cianoacrilato</td><td>LOCTITE/varios</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de decapitación</td><td></td> <td>varias-Papel</td><td></td> de</tr> <tr><td>filtro</td><td>varios-Capilares</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de vidrio (micropipeta)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/varios</td><td>Pipeta de vidrio 65-66</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/varios</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>varios-Tubos</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>polietileno&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar para disección cerebral</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar para el vibratomo</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Bonther equipamentos & Tecnología/varios</td><td>71-72, 48,49; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tetina de silicona</td> <td>varias-Anclaje de</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rebanadas&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0.22 &mu; m</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/varios</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Las kisspeptinas son esenciales para la maduración del eje hipotalámico-pituitario-gonadal (HPG) y la fertilidad. Las neuronas kisspeptina hipotalámicas ubicadas en el núcleo periventricular anteroventral y el núcleo periventricular rostral, así como el núcleo arqueado del hipotálamo, se proyectan a las neuronas de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH), entre otras células. Estudios previos han demostrado que la señalización de kisspeptina se produce a través del receptor Kiss1 (Kiss1r), lo que en última instancia excita la actividad neuronal GnRH. En humanos y modelos animales experimentales, las kisspeptinas son suficientes para inducir la secreción de GnRH y, en consecuencia, la liberación de la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH). Dado que las kisspeptinas desempeñan un papel esencial en las funciones reproductivas, los investigadores están trabajando para evaluar cómo la actividad intrínseca de las neuronas hipotalámicas de kisspeptina contribuye a las acciones relacionadas con la reproducción e identificar los neurotransmisores / neuromoduladores primarios capaces de cambiar estas propiedades. La técnica de pinza de parche de células enteras se ha convertido en una herramienta valiosa para investigar la actividad de la neurona kisspeptina en células de roedores. Esta técnica experimental permite a los investigadores registrar y medir las corrientes iónicas excitatorias e inhibitorias espontáneas, el potencial de membrana en reposo, el disparo del potencial de acción y otras propiedades electrofisiológicas de las membranas celulares. En el presente estudio, se revisan aspectos cruciales de la técnica de pinza de parche de células enteras, conocidas como mediciones electrofisiológicas que definen las neuronas kisspeptina hipotalámicas, y una discusión de temas relevantes sobre la técnica.

Para estudiar los posibles efectos de la hormona de crecimiento recombinante humana (hGH) sobre la actividad de las neuronas kisspeptina hipotalámicas, realizamos registros de pinza de parche de células enteras en cortes cerebrales y evaluamos si esta hormona causa cambios agudos en la actividad de las neuronas AVPV / PeN kisspeptina y ARHkisspeptina. En este estudio se utilizaron ratones adultos Kiss1-Cre/GFP hembra (etapa diestral) y machos36. Se seleccionaron animales con ...

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un parche de pinza de células enteras en cortes cerebrales que contienen neuronas kisspeptina, el modulador principal de las células de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH). Al agregar conocimiento sobre la actividad neuronal kisspeptina, esta herramienta electrofisiológica ha servido como base para avances significativos en el campo de la neuroendocrinología en los últimos 20 años.

Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Al medir las propiedades electrofisiológicas de las membranas celulares, la cuestión de lo principal demuestra que se puede resolver la modulación de la actividad eléctrica de una célula. El registro de pinza de parche de células enteras es una técnica periférica para estudiar las corrientes iónicas en células individuales e interrogar la respuesta celular a diferentes estímulos. El mejor rendimiento en las pregrabaciones de pinzas de parche de células enteras se logrará después de practicar y estudiar mucho.Para comenzar la disección cerebral, haga una incisión con tijeras quirúrgicas en la piel en la parte superior del cráneo del animal decapitado desde el caudle hasta el rostral y retire el cuero cabelludo. A continuación, corte la placa interparietal a lo largo de la sutura sagital con las tijeras del iris y retire el hueso occipital. Deslice el osteotomo debajo del hueso parietal y sáquelo suavemente hasta que el cerebro esté expuesto.Después de exponer el cerebro, voltee la cabeza boca abajo. Baje suavemente el cerebro para visualizar el nervio trigémino en cada lado. Luego corte el nervio trigémino usando tijeras curvas Castroviejo.Después de visualizar el hipotálamo identificar el nervio óptico y cortarlo suavemente. A continuación, corte la porción anterior lejana del lóbulo frontal. Retire el cerebro e inmediatamente sumérjalo en la solución de corte hasta adquirir las rodajas.Para cortar las muestras de cerebro, coloque el cerebro en un papel de filtro para secar el exceso de solución. Luego, con una hoja de afeitar de corte afilado, realice un corte coronal que separa el tronco encefálico con el cerebelo del resto del tejido. A continuación, pegue la porción del caudle del cerebro a la base de un vibratomo y llene la cámara del dispositivo de corte con la solución de corte o la solución de aCSF enfriada de cero a dos grados centígrados.Empaque hielo seco alrededor de la cámara de vibratomo para mantener fría la solución de corte durante el procedimiento. Inserte la cuchilla de afeitar en el vibratomo y establezca los parámetros de corte del dispositivo, como la velocidad a tres, la frecuencia a nueve y la alimentación a 250 micrómetros. Durante el procedimiento de corte de tejido, transfiera las rodajas con una pipeta de transferencia de acrílico a la cámara de recuperación y espere 60 minutos para la recuperación del tejido después de la adquisición de la rebanada.Antes de comenzar el sellado y la grabación celular, encienda el microscopio, el amplificador, el digitalizador y el micromanipulador. Construya la cámara de grabación conectada al microscopio con la solución aCSF. Use una bomba de perfusión para perfundir constantemente el aCSF a dos mililitros por minuto.Compruebe la configuración del software y cree protocolos específicos para las grabaciones según el tipo de experimento. Transfiera una rebanada de cerebro de interés de una en una a la cámara de grabación utilizando una pipeta de transferencia de acrílico. Sujete la rebanada con un anclaje de rebanada para que no se mueva durante la perfusión del LCR.Coloque la rebanada en el centro de la cámara de grabación utilizando la lente de objetivo de baja potencia del microscopio de inmersión, 10X o 20X. La posición del corte es crítica para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto para la micropipeta de grabación. Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia, 63X y concéntrese en el nivel del tejido observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para localizar las células kisspeptina en la superficie del corte cerebral.Cuando se encuentre una posible celda objetivo, márquela en la pantalla de la computadora con el cursor del mouse o dibujando un formato como un cuadrado sobre el área de interés. La marca de pantalla del ordenador ayuda a guiar la posición de la pipeta de grabación hasta la celda. Después de determinar la ubicación exacta de la célula objetivo, levante el objetivo e introduzca la micropipeta de registro llena con la solución interna en el soporte del electrodo, asegurándose de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata.Aplique una presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF utilizando una jeringa llena de aire de uno a tres mililitros conectada al soporte de micropipeta a través de un tubo de polietileno para evitar que entren residuos en la micropipeta. Usando el micromanipulador guía la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar el eje XYZ de la micropipeta hacia la celda de interés.Ajusta el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acercar el enfoque, pero no demasiado cerca de la rebanada. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta hasta el plano de foco, asegurándose de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en el corte, sino que descienda lentamente hasta que toque la superficie de la célula o la región objetivo. Aplicar una ligera presión positiva con una jeringa llena de aire de uno a tres mililitros para eliminar cualquier residuo de la trayectoria de aproximación.Mueva lentamente el micromanipulador en el eje XYZ para acercar la punta de la micropipeta y toque la célula objetivo, lo que provoca un hoyuelo por la presión aplicada. Después de establecer el hoyuelo con la ayuda del modo de abrazadera de voltaje en el software, aplique una breve succión débil por la boca durante uno o dos segundos a través del tubo conectado al soporte de micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la celda. Si el sello permanece mecánicamente estable sin interferencia de ruido durante aproximadamente un minuto, ajuste el voltaje de retención en el potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés.Para las neuronas hipotalámicas kisspeptina se recomienda menos 50 milivoltios. A continuación, aplique una breve succión por vía oral para romper la membrana plasmática en la punta de micropipeta sellada colocada a la célula para que la membrana rota no obstruya la micropipeta o atraiga una porción considerable de la membrana o la célula. Se puede lograr una configuración adecuada de toda la celda realizando succión con suficiente fuerza.Consulte el manual de configuración del sistema utilizado. Después de romper la membrana celular, habilite la opción de celda completa en el modo de abrazadera de voltaje y haga clic en el comando automático que se refiere a la pestaña de toda la celda. La resistencia en serie de la celda y la capacitancia de toda la celda se calculan automáticamente y el software muestra instantáneamente.A continuación, verifique los parámetros de viabilidad celular en el software como se describe en el manuscrito de texto. Monitoree la resistencia en serie y la capacitancia del estado estacionario de la celda durante los experimentos. Una vez que toda la configuración de la celda se logra correctamente, mida las corrientes sinápticas en el modo de abrazadera de voltaje.Registre los cambios en el potencial de membrana en reposo y las variaciones inducidas del potencial de membrana en reposo en el modo de abrazadera actual. Los posibles efectos de la hormona de crecimiento recombinante humana sobre la actividad de las neuronas kisspeptina hipotalámicas se estudiaron con la ayuda de registros de pinza de parche de células enteras. La administración de hormona de crecimiento recombinante humana, HGH a 20 microgramos por gramo indujo una hiperpolarización significativa del potencial de membrana en reposo en 5 de 12 neuronas de kisspeptina AVPV / PeN y 9 de 14 neuronas de kisspeptina ARH registradas.Las neuronas hiperpolarizadas AVPV/PeN kisspeptina y ARH kisspeptina cambiaron significativamente el potencial de membrana en reposo en comparación con las células que no responden. Los efectos sobre el potencial de membrana en reposo durante la aplicación de HGH siguieron a una reducción significativa de la resistencia de entrada de células enteras de aproximadamente 0.9 a 0.7 gigaohmios en neuronas de kisspeptina AVPV / PeN y 1.7 a 1.0 gigaohmios en neuronas de kisspeptina ARH. Durante las líneas cerebrales perfectas realizadas a través de gigaseal cuidadoso y el área en la célula a través de parámetros de playa son necesarios para lograr las mejores grabaciones de células completas.La solución de micropipeta de la célula registrada se puede recolectar y utilizar para RTPCR de una sola célula permitiendo la caracterización molecular de una célula aislada. La técnica de pinza de parche de células enteras combinada con el uso de animales modificados genéticamente representa un gran avance en la comprensión de la reproducción que permite la definición de las propiedades aumentadas de las neuronas kisspeptina, y son los principales moduladores.

hypothalamic-kisspeptin-neurons-as-target-for-whole-cell-patch-clamp

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

El video muestra un método para estudiar la excitabilidad de las células neuronales que expresan proteínas fluorescentes utilizando una pinza amperimétrica de parche de célula completa. En el modo de pinza de corriente, se generan potenciales de acción indicativos de excitabilidad neuronal.

Estudio de la excitabilidad de las neuronas fluorescentes utilizando una pinza de parche de célula completa

El video muestra un protocolo para estudiar las interacciones sinápticas y las respuestas neuronales en un corte de cerebro de hipocampo de ratón transfectado. Consiste en iluminar neuronas sensoriales de largo alcance para desencadenar potenciales de acción y registrar los potenciales postsinápticos excitatorios resultantes en la neurona registrada mediante la técnica de patch-clamp de célula completa.

Fotoestimulación y registros de pinza de parche de células enteras de neuronas en cortes de hipocampo de ratón

Este video demuestra el uso de la técnica de patch-clamp de células enteras para medir las respuestas en las neuronas kisspeptina de cortes hipotalámicos de ratón transfectados. El proceso consiste en lograr la configuración de toda la célula y registrar los cambios de potencial de membrana inducidos por la hormona de prueba utilizando el modo de pinza de corriente.

Determinación de un efecto de la hormona de crecimiento de prueba en las neuronas de kisspeptina utilizando una pinza de parche de célula completa

Este video muestra el procedimiento para realizar registros electrofisiológicos en neuronas de sustancia gelatinosa (SG) de cortes de médula espinal, utilizando técnicas de patch-clamp de células enteras para analizar los patrones de disparo de las neuronas. Este método permite el estudio de las respuestas neuronales a estímulos en las neuronas SG de la médula espinal.

Registro de pinza de parche de célula entera en una neurona gelatinosa de una sustancia de un corte de médula espinal

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación de la multiplicidad sináptica funcional utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo.

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Aprende a realizar grabaciones de pinza de parche de células enteras en neuronas de kisspeptina hipotalámicas para estudiar sus propiedades electrofisiológicas. Este método permite medir corrientes iónicas y comprender la regulación neuroendocrina reproductiva.

Neuronas de kisspeptina hipotalámicas como objetivo para grabaciones de pinza de parche de células enteras

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