Name: Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a evaluar niveles de autofagia en células pancreáticas mediante inmunofluorescencia LC3. Este protocolo utiliza fijación con metanol frío y análisis de imágenes para cuantificar puntos LC3 en cáncer pancreático.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), el Consejo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; y PUE 22920170100033) y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT 2019-01664).

1. Preparación celular
<ol><li>Remoje los cubreobjetos redondos de 12 mm en etanol absoluto y colóquelos verticalmente en los pocillos de una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Retire la cubierta y exponga la placa de pocillos múltiples a la radiación ultravioleta durante 15 minutos.</li>
	<li>Coloque los cubreobjetos horizontalmente y lávelos con el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco.</li>
	<li>Sembrar un número bajo de células pancreáticas. La cantidad debe ajustarse para obtener una confluencia del 50%-75% el día de la fijación16. NOTA: Se recomienda sembrar 2.5 × 10 4 PANC-1 o 4 × 104 células AR42J por pocillo para fijar las células después de 3 días.</li>
	<li>Cultivar las células en DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina en una incubadora a 37 °C bajo una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono (CO2). NOTA: Para las células PANC-1, se recomienda incubar las células durante 2 días entre la siembra celular y los siguientes pasos. Después de este tiempo, las células pueden ser transfectadas, tratadas o fijadas. Este protocolo ejemplifica el tratamiento con gemcitabina en células PANC-1 no transfectadas y la diferenciación y el tratamiento PP242 para células AR42J no transfectadas.</li>
</ol>2. Tratamiento de las células
<ol><li>Tratamiento con gemcitabina para las células PANC-1<ol><li>Preparar una solución de gemcitabina de 1 μg/μL en DMEM 2 días después de la siembra. Tratar cada pocillo con 2,6 μL de la solución de gemcitabina de 1 μg/μL para lograr una dilución final de 20 μM.</li>
		<li>Incubar las células durante 24 h en la incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación AR42J y tratamiento PP242<ol><li>Preparar una solución de 4 μg/ml de dexametasona en DMEM.</li>
		<li>Tratar cada pocillo con 4,9 μL de solución de dexametasona de 4 μg/ml para obtener una dilución final de 100 nM.</li>
		<li>Incubar las células durante 48 h en la incubadora.</li>
		<li>Retirar el medio, y tratar cada pocillo con 0,5 μL de 1 mM PP242 para obtener una dilución final de 1 μM.</li>
		<li>Incubar las células durante 2 h en la incubadora.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fijación y permeabilización de las células
<ol><li>Prepare una placa de 24 pocillos con metanol frío y una placa de 6 pocillos con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4,2 mM KH2PO4). Manténgalos en hielo.</li>
	<li>Tome cada cubreobjetos con pinzas, lávelos dos veces en PBS e incube durante 6 minutos en metanol.</li>
</ol>4. Bloqueo de las células
<ol><li>Lave cada cubreobjetos dos veces en PBS e incube durante 1 h en suero bovino fetal al 10% en PBS (solución de bloqueo). Nota : en este paso, el protocolo podría estar en pausa. Los cubreobjetos se pueden almacenar durante la noche en la nevera en la solución de bloqueo, y el protocolo se puede continuar al día siguiente.</li>
</ol>5. Incubación de los cubobjetos con el anticuerpo primario
<ol><li>Prepare una solución 1:1.000 de anti-LC3 en la solución de bloqueo y manténgala en hielo.</li>
	<li>Coloque un trozo de película de sellado de laboratorio sobre la tapa de varios pocillos.</li>
	<li>Coloque una gota (25 μL) por cubreobjetos de solución anti-LC3 sobre la película de sellado.</li>
	<li>Tome cada cubreobjetos con pinzas y colóquelo sobre la gota de anticuerpos primarios, teniendo cuidado de que el lado celular esté en contacto con la solución.</li>
	<li>Prepare una cámara húmeda colocando un pedazo de papel húmedo en una caja de plástico de fondo plano.</li>
	<li>Coloque la placa de pocillos múltiples en la cámara de humedad, cúbrala con papel de aluminio e incube durante la noche en el refrigerador.</li>
</ol>6. Incubación de los cubobjetos con el anticuerpo secundario
<ol><li>Retire la placa de pocillos múltiples de la cámara de humedad y vuelva a colocar los cubreobjetos en la placa de pocillos múltiples.</li>
	<li>Realice tres lavados con PBS.</li>
	<li>Prepare una solución de anticonejo marcado con fluorescencia con una dilución de 1:800 en la solución de bloqueo y manténgala en hielo protegido de la luz.</li>
	<li>Coloque una pieza de película de sellado sobre la tapa de varios pocillos.</li>
	<li>Coloque una gota (25 μL) por cubreobjetos de solución anticonejo sobre la película de sellado.</li>
	<li>Tome cada cubreobjetos con pinzas y colóquelo sobre la gota de anticuerpos primarios, teniendo cuidado de que el lado celular esté en contacto con la solución.</li>
	<li>Incubar la placa multipocillo en la cámara de humedad durante 2 h a temperatura ambiente (RT) protegida de la luz.</li>
</ol>7. Teñir las células con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
<ol><li>Retire la placa de pocillos múltiples de la cámara de humedad y vuelva a colocar los cubreobjetos en la placa de pocillos múltiples.</li>
	<li>Realice tres lavados con PBS.</li>
	<li>Prepare una solución de 300 nM de DAPI en PBS (protegido de la luz).</li>
	<li>Incubar cada cubador con la solución DAPI durante 10 minutos.</li>
	<li>Realice tres lavados con PBS. Mantenga la placa de pocillos múltiples protegida de la luz.</li>
</ol>8. Montaje
<ol><li>Prepara dos vasos de precipitados con agua y un pedazo de papel.</li>
	<li>Colocar una gota (10 μL) por cubreobjetos de una solución de aducto de polivinílico alcohol-Bis(trimetilaluminio)-1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (PVA-DABCO) sobre un portaobjetos. NOTA: PVA-DABCO se prepara combinando 0,25 M DABCO, 10% p/v PVA, 20% de glicerol y 50% de Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) en agua ultrapura.</li>
	<li>Tome cada cubreobjetos con pinzas, lávelos en cada vaso de precipitados de agua, séquelo en el papel y colóquelo sobre la gota de PVA-DABCO (con las células en contacto con la solución).</li>
	<li>Dejar secar toda la noche, protegido de la luz.</li>
</ol>9. Visualización por microscopía confocal y captura de imágenes
<ol><li>Visualice los cubreobjetos en un microscopio confocal invertido utilizando un objetivo de alrededor de 63x17.</li>
	<li>Capture imágenes representativas de las celdas etiquetadas.</li>
</ol>10. Cuantificación de los puntos LC3
<ol><li>Arrastre y suelte cada archivo de imagen que contenga los canales capturados, como ".czi", en la pantalla ImageJ (FIJI) para abrirlo. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo y cierre la ventana Consola .</li>
	<li>En la pestaña Imagen , seleccione Color &gt; Canales divididos.</li>
	<li>Cierre las imágenes correspondientes a los canales que no sean la imagen LC3.</li>
	<li>En la pestaña Imagen , seleccione Ajustar &gt; balance de color</li>
	<li>Mueva el control deslizante Máximo hacia la izquierda hasta que la imagen esté saturada para visualizar los contornos de las celdas.</li>
	<li>Dibuje el contorno de la celda con la herramienta Selección a mano alzada .</li>
	<li>Haga clic en el botón Restablecer para restablecer el ajuste de color.</li>
	<li>En la ficha Editar , seleccione Cortar para cortar el elemento seleccionado.</li>
	<li>Cierre la imagen sin guardarla.</li>
	<li>En la pestaña Editar , seleccione Pegar.</li>
	<li>En el menú Analizar , elija la herramienta Contador de objetos 3D.</li>
	<li>Establezca el umbral. En el ejemplo proporcionado en este estudio, el umbral se establece en 2.000.</li>
	<li>Establezca el filtro de tamaño. En este estudio, se establece entre 50 y 500.</li>
	<li>Asegúrese de que las casillas Objetos y Resumen estén marcadas.</li>
	<li>Haga clic en Aceptar. El número de puntos se describirá como Objetos detectados en el Resumen.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático del protocolo de inmunofluorescencia LC3. Diagrama esquemático que representa el protocolo general proporcionado para la inmunofluorescencia LC3. Figura creada con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

El método descrito en este protocolo permite visualizar la distribución endógena de CL3 en la célula y cuantificar los niveles autofágicos en diferentes condiciones. Otro método similar utilizado para analizar la distribución de CL3 y determinar la activación de la autofagia implica la transfección de LC3 marcada con fluorescencia (como RFP-LC3)19. La transfección RFP-LC3 tiene las ventajas de no necesitar fijación (lo que permite aplicar este método en imágenes de células vivas2...

La macroautofagia (comúnmente conocida como autofagia) es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados 1,2. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, así, mantener la homeostasis celular3. Durante la autofagia, se forma una vesícula de doble membrana: el autofagosoma. El autofagosoma contiene las moléculas de carga y las conduce al lisosoma para su degradación 1,4.
Los autofagosomas están decorados por la proteína autofágica de la cadena ligera 3 (CL3)5. Cuando no se induce la autofagia, la CL3 se difunde en el citoplasma y el núcleo en la conformación LC3-I. Por otro lado, cuando se induce la autofagia, la CL3 se conjuga con una fosfatidiletanolamina en la membrana de las estructuras autofágicas6. Esta nueva conformación LC3 se conoce como LC3-II1. El cambio de conformación de LC3 provoca cambios en su localización celular y su migración de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), que puede ser detectada por técnicas como la inmunofluorescencia y el western blot 5,7. De esta manera, la conjugación de CL3 es un evento clave en el proceso autofágico que se puede utilizar para medir la actividad autofágica.
La célula acinar pancreática es una célula altamente diferenciada que, en condiciones saludables, tiene una baja tasa de autofagia. Sin embargo, en diferentes condiciones fisiológicas o bajo estimulación farmacológica, pueden activar la autofagia. Por lo tanto, la determinación de los niveles autofágicos en esta línea celular es útil para estudiar los posibles efectos directos o indirectos de diferentes agentes farmacológicos o biológicos sobre la autofagia 8,9.
El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales, dado su diagnóstico tardío y su alta resistencia a la quimioterapia10. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de proteínas relacionadas con la autofagia11. Las células de cáncer de páncreas pueden ajustar sus niveles de autofagia en respuesta a condiciones desfavorables como hipoxia, privación de nutrientes o daño inducido por la quimioterapia11. Por lo tanto, analizar los niveles de autofagia en las células de cáncer de páncreas puede ayudar a comprender cómo se adaptan a diferentes entornos y evaluar la efectividad de los tratamientos moduladores de la autofagia.
Este estudio muestra un método para realizar la inmunofluorescencia de LC3 en dos modelos celulares pancreáticos distintos. El primer modelo, las células PANC-1, sirvió como modelo para el adenocarcinoma ductal pancreático. Estas células fueron tratadas con gemcitabina, un agente quimioterápico que previamente ha demostrado inducir autofagia, específicamente en células de cáncer de páncreas portadoras del gen oncogénico del virus del sarcoma de rata Kirsten (KRAS)12,13. El segundo modelo, las células AR42J, sirvió como un modelo más fisiológico de las células pancreáticas exocrinas. Estas células fueron diferenciadas con dexametasona para volverse más similares a las células pancreáticas acinares14. En estas células, la autofagia fue inducida farmacológicamente mediante el uso de PP242, que es un potente inhibidor de mTOR15. En este estudio, demostramos la aplicabilidad del protocolo descrito con dos modelos pancreáticos diferentes y su capacidad para discriminar entre estados de baja y alta autofagia.

<table><tbody><tr><td>10x solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos redondos de 12 mm</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos placa de cultivo celular</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Burro anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>NATOCOR&nbsp;</td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>Gemcitabina</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP Rabbit mAb</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Anedra</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" (película de sellado de laboratorio)</td><td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia lc3

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

La autofagia es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, por lo tanto, mantener la homeostasis celular. Las células cancerosas pueden modular sus niveles de autofagia para adaptarse a condiciones adversas como hipoxia, deficiencia de nutrientes o daño causado por la quimioterapia. El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de las proteínas de autofagia.
Aquí, la línea celular PANC-1 se utilizó como modelo de células de cáncer de páncreas humano, y la línea celular acinar pancreática AR42J se utilizó como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudio utilizó la inmunofluorescencia de la cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos (CL3) como un indicador del estado de activación de la autofagia. La CL3 es una proteína de autofagia que, en condiciones basales, muestra un patrón difuso de distribución en el citoplasma (conocido como LC3-I en esta condición). La inducción de autofagia desencadena la conjugación de CL3 a fosfatidiletanolamina en la superficie de los autofagosomas recién formados para formar LC3-II, una proteína unida a la membrana que ayuda en la formación y expansión de autofagosomas. Para cuantificar el número de estructuras autofágicas etiquetadas, se utilizó el software de código abierto FIJI con la ayuda de la herramienta "3D Objects Counter".
La medida de los niveles autofágicos tanto en condiciones fisiológicas como en células cancerosas nos permite estudiar la modulación de la autofagia en diversas condiciones como la hipoxia, el tratamiento de quimioterapia o el derribo de ciertas proteínas.

Este protocolo realiza inmunofluorescencia de CL3 en líneas celulares pancreáticas para determinar los niveles de autofagia en diferentes condiciones. El resultado de este experimento fue la obtención de imágenes celulares de los canales rojo y azul, correspondientes a LC3 y DAPI. Las imágenes de LC3 indican la distribución celular de esta proteína, mientras que la DAPI muestra la localización nuclear. La Figura 2A muestra una imagen representativa de la inmunofluorescencia de LC3 y su fusió...

El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.

Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

La inmunofluorescencia CL3 permite la determinación de los niveles de autofagia en las células pancreáticas. Permite estudiar los efectos potenciales de diferentes agentes sobre la autofagia de las células pancreáticas. La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para detectar la proteína CL3 endógena, que evita los problemas causados por la sobreexpresión de CL3, como la formación de agregados de proteínas no relacionados con la autofagia.Demostrando el procedimiento estarán Felipe Renna, graduado de doctorado, y Malena Herrera López, estudiante de doctorado del laboratorio de María Inés Vaccaro. Para comenzar la preparación de la celda, remoje los resbalones de cubierta redonda de 12 milímetros en etanol absoluto. Después de quitar la cubierta, coloque el deslizamiento de la cubierta empapado verticalmente en la placa de 24 pocillos.Exponga la placa de pocillos múltiples a la radiación ultravioleta durante 15 minutos. Luego coloque el cubreobjetos horizontalmente y lávelo con DMEM. Ahora vea el bajo número de paso de células pancreáticas, resuspendidas en DMEM, que contienen 10% FBS, penicilina y estreptomicina, e incube las células durante dos días.Dos días después de la sie

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Mitofagia, el proceso de claro dañaado las mitocondrias, es necesario para el mantenimiento de la homeostasis y salud mitocondrial. Este artículo presenta algunas de la mitofagia últimos métodos de detección en células humanas, Caenorhabditis elegansy los ratones.

In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

Aquí, presentamos un protocolo para la microscopía correlativa de luz-electrónica optimizada en sección basada en el marcaje endógeno y fluorescente como herramienta para investigar la localización de proteínas raras en relación con la ultraestructura celular. El poder de este enfoque se demuestra mediante la localización ultraestructural de LC3 endógena en células hambrientas sin tratamiento con bafilomycina.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

Este protocolo describe dos métodos para el análisis cuantitativo de la mitofagia en las células β pancreáticas: en primer lugar, una combinación de colorantes específicos de mitocondrias permeables a las células y, en segundo lugar, un indicador de mitofagia codificado genéticamente. Estas dos técnicas son complementarias y pueden implementarse en función de necesidades específicas, lo que permite flexibilidad y precisión para abordar cuantitativamente el control de calidad mitocondrial.

Enfoques complementarios para interrogar el flujo de mitofagia en las células β pancreáticas

En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Aprende a evaluar niveles de autofagia en células pancreáticas mediante inmunofluorescencia LC3. Este protocolo utiliza fijación con metanol frío y análisis de imágenes para cuantificar puntos LC3 en cáncer pancreático.

Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3

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