Name: Modelo post-resección de la recaída del glioblastoma para investigaciones terapéuticas de hidrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Aprende a establecer un modelo de recaída de glioblastoma post-resección en ratones para evaluar hidrogeles bioresponsivos inyectables. Este método permite estudiar la recurrencia tumoral y la eficacia del tratamiento local mediante imágenes bioluminiscentes.

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Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones para proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82071767 y 82171781).

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y supervisados por la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Nanjing (IACUC-1904004). Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J, de 6-8 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación animal
<ol><li>Pesar a los ratones y anestesiarlos con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabla de materiales). Administrar meloxicam (5 mg/kg; i.p.) para la analgesia perioperatoria. Aloje a los ratones en una jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, una temperatura ambiente de 24 °C y una humedad relativa del 50%. NOTA: Para el presente estudio, el peso inicial de los ratones fue de aproximadamente 22 g.</li>
	<li>Retire el pelo de la cabeza de un ratón con una máquina de afeitar para animales de laboratorio y fije la cabeza y las extremidades en el aparato estereotáxico (consulte la tabla de materiales). NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo.</li>
	<li>Desinfecte la cabeza del ratón con al menos tres rondas alternas de exfoliante de clorhexidina o povidona yodada seguidas de alcohol, y cubra el ratón con un paño quirúrgico estéril. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se sequen.</li>
	<li>Corta el cuero cabelludo del ratón aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media en la parte superior de la frente derecha con unas tijeras oftálmicas. NOTA: Confirme el plano quirúrgico de la anestesia por la ausencia de reflejo pedal antes de realizar la incisión.</li>
	<li>Ajuste el aparato estereotáxico para asegurarse de que la costura en espiga y la punta de la fontanela frontal estén ubicadas al mismo nivel.</li>
</ol>2. Construcción del modelo ortotópico intracraneal de GBM
<ol><li>Marque el punto 1 mm hacia el lado frontal de la fontanela frontal, 1,8 mm hacia el lado derecho de la fontanela frontal y 3 mm hacia abajo desde la fontanela frontal con un hisopo de algodón humedecido con violeta de genciana2 (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Taladre la punta con un mini taladro craneal de 1 mm de diámetro (consulte la Tabla de materiales) para crear un tamaño de poro de aproximadamente 1 mm de diámetro y 1 mm de profundidad.</li>
	<li>Retire el líquido cefalorraquídeo exudado con un hisopo de algodón estéril.</li>
	<li>Aspirar 5 μL de suspensión de células tumorales (GL261-Luci, 5 × 105 células suspendidas en 5 μL de PBS) con una microjeringa. NOTA: El GL261-Luci se obtuvo de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Alinee la punta de la aguja de la microjeringa verticalmente con el orificio de perforación del cráneo, insértelo hasta que la punta de la aguja entre en el plano del cráneo durante 3 mm y devuelva la aguja 0,5 mm7.</li>
	<li>Abra la microjeringa e inyecte a una velocidad de 1 μL/min.</li>
	<li>Conserve la aguja durante 10 minutos después de la inyección.</li>
	<li>Retire la microjeringa lentamente y presione el punto de inyección con una bola de algodón seca estéril.</li>
	<li>Suturar el cuero cabelludo con una sutura quirúrgica no absorbible (10-0, ver Tabla de materiales) y volver a desinfectar la incisión.</li>
	<li>Vigile la salud del animal y manténgalo en condiciones cálidas.</li>
	<li>Mueva el ratón de vuelta a la jaula de la carcasa después de que el ratón se despierte.</li>
	<li>Obtener imágenes del ratón con un sistema de imágenes bioluminiscentes in vivo (ver Tabla de materiales) para detectar el tumor trasplantado en el décimo día después de la portadora del tumor. NOTA: La luciferasa cargada en las células GBM, GL261, se utilizó para la obtención de imágenes bioluminiscentes.<ol><li>Anestesiar al ratón con isoflurano al 1,5% con un caudal de oxígeno de 0,6L/min. Después de confirmar la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal, inyectar al ratón por vía intraperitoneal fluoresceína de potasio (10 mg/mL, ver Tabla de Materiales) y, 11 s después, realizar la obtención de imágenes bioluminiscentes in vivo . Cuando el valor de fluorescencia alcanza ~5 × 105, el procedimiento es exitoso. NOTA: Anestesiar al animal antes de tomar imágenes. Mantener la anestesia a través del cono de la nariz suministrado con isoflurano vaporizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleccionar los ratones con tumores exitosos para construir el modelo de recaída post-resección de GBM.</li>
</ol>3. Construcción del modelo post-resección de recaída GBM
<ol><li>Cuando el tamaño del tumor en los ratones modelo de GBM intracraneal ortotópico sea de ~6,5 × 105, seleccione los ratones para el modelo de recaída postoperatoria.</li>
	<li>Pesar los ratones modelo GBM intracraneales ortotópicos y anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico. Administrar meloxicam (5 mg/kg; i.p.) para la analgesia perioperatoria.</li>
	<li>Repita el proceso de los pasos 1.2 y 1.5.</li>
	<li>Separe el tejido del cuero cabelludo y el cráneo, y verifique el orificio de perforación utilizado para construir el modelo ortotópico intracraneal de GBM. Si el orificio se ha curado, identifíquelo usando un aparato estereotáxico y siga el procedimiento mencionado en los pasos 2.1-2.3.</li>
	<li>Amplíe el diámetro del orificio a 5 mm con un taladro de cráneo y extraiga el líquido cefalorraquídeo exudado con un hisopo de algodón estéril.</li>
	<li>Enfoca el microscopio en la cabeza del ratón y ajusta la configuración para asegurarte de que el orificio de perforación esté situado en el centro del campo de visión.</li>
	<li>Cortar las meninges con unas tijeras y extirpar parte del tejido tumoral con una microcureta y un microbisturí bajo el microscopio. NOTA: Con respecto a las meninges, cuando se abre el cráneo, la membrana delgada cercana al tejido cerebral son las meninges.</li>
	<li>Detenga el sangrado con una gasa estéril y lave la incisión con solución salina fisiológica estéril.</li>
	<li>Inyectar el hidrogel disponible comercialmente (10 μL, ver Tabla de Materiales) en la cavidad de resección con una jeringa de 1 mL, suturar el cuero cabelludo con una sutura quirúrgica no absorbible (10-0) y desinfectar la incisión nuevamente (Figura 1).</li>
	<li>Controle la salud del animal y mantenga al ratón caliente.</li>
	<li>Mueva el ratón de vuelta a la jaula de la carcasa después de que el ratón se despierte.</li>
	<li>Realizar imágenes bioluminiscentes in vivo para detectar el tumor trasplantado 1 día después para cuantificar el tamaño del tumor residual (Figura 2 y Figura 3).</li>
	<li>Pesar a los ratones cada 2 días hasta el punto final terminal. NOTA: Para el presente estudio, el criterio de valoración terminal fue el día 30, y los ratones fueron sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital sódico con una inyección intraperitoneal.</li>
</ol>

<ol><li>Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+immunotherapy+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Current state of immunotherapy for glioblastoma.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+targeting+nanoparticles-hydrogel+hybrid+system+for+combined+chemo-immunotherapy+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma.</a> Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).</li>
<li>Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+The+current+state+of+biology+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies.</a> Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).</li>
<li>Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+therapeutic+stem+cells+implanted+in+the+tumor+resection+cavity+induce+cell+death+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas.</a> Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+engineered+TRAIL-overexpressing+adipose-derived+stem+cells+target+and+eradicate+glioblastoma+via+intracranial+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironmental+landscape+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The microenvironmental landscape of brain tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostimulant+hydrogel+for+the+inhibition+of+malignant+glioma+relapse+post-resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection.</a> Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).</li>
<li>Ruan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-bioresponsive+drug-delivery+depot+for+combination+of+epigenetic+modulation+and+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade.</a> Advanced Materials. 31 (17), 1806957(2019).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostimulant+in+situ+hydrogel+improves+synergetic+radioimmunotherapy+of+malignant+glioblastoma+relapse+post-resection%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection.</a> Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038(2022).</li>
<li>Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for glioblastoma.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 20 (7), 19(2020).</li>
<li>Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risk+and+efficiency+in+drug+development+for+rare+and+challenging+tumors%3A+A+new+paradigm+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma.</a> Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La cirugía sigue siendo la primera opción para la mayoría de los pacientes con GBM11. Debido a la característica de crecimiento invasivo de GBM, aún queda un pequeño número de células tumorales después de las técnicas microneuroquirúrgicas, lo que resulta en una eventual recurrencia tumoral12. Cómo inhibir la recurrencia de GBM después de la cirugía se ha convertido en el foco de la investigación relacionada con GBM. Sin embargo, debido a la compleja estructura anatómica del tejido cerebral, la construcción de un modelo adecuado de GBM postoperatorio se ha convertido en el principal problema a resolver en este campo.
En este estudio se desarrolló un modelo de recaída posresección de MBG. En el proceso de construcción de este modelo, la construcción del modelo ortotópico intracraneal de GBM es crítica. Una vez que este modelo se ha desarrollado con éxito, la resección debe realizarse en el momento adecuado. El momento recomendado es cuando el valor de fluorescencia del tamaño del tumor es de aproximadamente 6,5 × 105. Para reducir la mortalidad de los ratones, se realizó la resección bajo anestesia con 40 mg/kg de pentobarbital sódico al 1% por inyección intraperitoneal. Sin embargo, la resección fue difícil de realizar, y los ratones a menudo se movían debido a la pequeña dosis del anestésico. Sobre esta base, la dosis del anestésico se incrementó a 50 mg/kg. Después de aumentar la dosis anestésica, las respuestas intraoperatorias de los ratones desaparecieron y la resección se realizó con éxito. El gas isoflurano también se puede utilizar en este protocolo.
En este estudio, se utilizaron células GL261-Luci para desarrollar el modelo; por lo tanto, se deben utilizar más líneas celulares GBM para validar el protocolo en el futuro. Para que el protocolo sea más convincente, es necesario utilizar varios modelos de ratón GBM, como los modelos de ratón GBM modificados genéticamente. Además, la resonancia magnética puede ser el mejor medio para detectar la recurrencia de tumores después de la cirugía.
En resumen, en este trabajo se ha desarrollado un modelo post-resección de recaída de GBM. En este modelo, la recidiva tumoral se monitorea mediante la evaluación del crecimiento del tumor residual después de la resección. Aunque no se puede considerar que este modelo imite completamente la recidiva tumoral, el estilo de resección en este modelo es similar al estándar de cirugía de máxima seguridad en el tratamiento clínico de pacientes con GBM. Este trabajo proporciona un método conveniente y factible para construir el modelo de recaída post-resección de GBM y representa un avance en el campo de la investigación sobre la recaída de GBM post-resección.

El glioblastoma (GBM) es el tumor maligno más frecuente entre todos los cánceres del sistema nervioso central 1,2. La cirugía es el tratamiento de primera línea para los pacientes con GBM, y la quimiorradiación es el principal tratamiento adyuvante después de la cirugía. Sin embargo, la recurrencia tumoral a menudo se desarrolla dentro de los 3-6 meses en la mayoría de los pacientes con GBM con diversos tratamientos 3,4,5. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar estrategias de tratamiento más efectivas para prevenir la recurrencia del GBM.
Los estudios recientes sobre GBM se han centrado principalmente en los tumores primarios más que en los recurrentes6. Sin embargo, el problema más común que debe resolverse en la clínica es cómo inhibir la recurrencia del GBM después de la cirugía. Por lo tanto, la investigación sobre la recurrencia del GBM después de la cirugía necesita más atención. Los hidrogeles terapéuticos biosensibles son el vector más utilizado en los estudios sobre la recurrencia tumoral después de la cirugía 7,8. Sin embargo, debido a la estructura especial del sistema nervioso central, es difícil desarrollar un modelo adecuado de recaída de GBM post-resección9, que es crítico para el estudio de la recurrencia de GBM.
Este estudio ha generado un modelo mejorado de recaída post-resección basado en el modelo ortotópico intracraneal de GBM utilizado en la investigación sobre GBM primaria. En este modelo, la mayoría de los tumores se extirpan mediante cirugía microscópica y el tumor residual se detecta mediante imágenes bioluminiscentes in vivo y tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Este modelo imita el estado de resección de los pacientes con tumores cerebrales y se puede utilizar en varios estudios sobre la recaída de GBM.

<table><tbody><tr><td>Violeta de genciana</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>GL261-Luci</td><td>Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZQ0932</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen bioluminiscente in vivo</td><td>Tanon</td><td>Tanon ABL X6</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora de animales de laboratorio</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>FS600</td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro cureta</td><td>Belevor Medical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro bisturí</td><td>Belevor Medical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd</td><td>JSZ5A/B</td><td></td></tr><tr><td>Microjeringa</td><td>Hamilton</td><td>87943</td><td></td></tr><tr><td>Mini fresa craneal</td><td>RWD</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica no absorbible</td><td>Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>ChemSrc</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>PVA-TSPBA hidrogel&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>Aparato estereotáxico</td><td>RWD</td><td>68043</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo post-resección de la recaída del glioblastoma para investigaciones terapéuticas de hidrogel

Glioblastoma Relapse Post-Resection Model for Therapeutic Hydrogel Investigations

La recidiva tumoral es un factor importante indicativo de un mal pronóstico en el glioblastoma (GBM). Muchos estudios están tratando de identificar estrategias terapéuticas efectivas para prevenir la recurrencia de GBM después de la cirugía. Los hidrogeles terapéuticos biorreactivos capaces de mantener los fármacos liberados localmente se utilizan con frecuencia para el tratamiento local de la GBM después de la cirugía. Sin embargo, la investigación es limitada debido a la falta de un modelo adecuado de recaída de GBM después de la resección. Aquí, se desarrolló un modelo de recaída de GBM post-resección y se aplicó en investigaciones terapéuticas de hidrogeles. Este modelo se construyó con base en el modelo ortotópico intracraneal de GBM, que es ampliamente utilizado en estudios sobre GBM. Se realizó una resección subtotal en el ratón modelo GBM intracraneal ortotópico para imitar el tratamiento clínico. El tumor residual se utilizó para indicar el tamaño del crecimiento tumoral. Este modelo es fácil de construir, puede imitar mejor la situación de la resección quirúrgica de GBM y se puede aplicar en varios estudios sobre el tratamiento local de la recaída de GBM después de la resección. Como resultado, el modelo de recaída posresección de GBM proporciona un modelo único de recurrencia de GBM para estudios de tratamiento local eficaces de la recaída después de la resección.

En la Figura 1 se muestra el proceso de construcción del modelo post-resección de recaída GBM. Se muestra la cavidad de resección después de que el tumor se extirpó parcialmente al microscopio. El hidrogel se inyectó en la cavidad de resección con una jeringa para demostrar el efecto terapéutico. El cronograma del diseño experimental se muestra en la Figura 2A. Después de que las células GBM se implantaron en el cerebro de los ratones, el crecimiento tumoral se probó mediante imágenes bioluminiscentes in vivo el día 10. La resección se realizó el día 11 y luego se inyectó el hidrogel en la cavidad de resección. La prueba de imagen bioluminiscente in vivo se realizó el día 15, el día 20, el día 25 y el día 30 para monitorear el crecimiento tumoral residual. Como se muestra en la Figura 2B,C, el tamaño de los tumores en el modelo de recaída post-resección de GBM fue significativamente menor que el del modelo de GBM intracraneal ortotópico, como lo muestran las pruebas de imágenes bioluminiscentes in vivo. El día 25, los tumores recidivaron significativamente después de la resección (Figura 2D). La tinción de H&amp;E confirmó que el modelo de recaída de GBM después de la resección se construyó con éxito y que los tumores residuales recidivaron significativamente después de la resección (Figura 3A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig01.jpg"> Figura 1: Vista intraoperatoria de la resección tumoral e inyección del hidrogel. Se extirpó parte del tejido tumoral con una microcureta y un microbisturí bajo el microscopio, y se inyectó hidrogel en la cavidad de resección. Barras de escala: 50 μm. Esta figura ha sido modificada a partir de Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig02.jpg"> Figura 2: Cronograma del diseño experimental y de la imagen bioluminiscente in vivo de ratones en el modelo GBM intracraneal y post-resección. (A) El cronograma del diseño experimental que muestra que la resección se realizó el día 11 y que la imagen bioluminiscente (IV) in vivo se realizó el día 10, el día 15, el día 20, el día 25 y el día 30. (B) Los ratones modelo de GBM intracraneal mostraron un tamaño tumoral grande en el día 10, (C) el tamaño del tumor se redujo significativamente después de la resección en el día 11 y (D) el tamaño del tumor aumentó después de la resección en el día 25 en el modelo GBM posterior a la resección. El grupo de control incluyó a los ratones modelo de recaída de GBM después de la resección sin tratamiento. En este estudio se utilizaron un total de 42 ratones. Barras de escala: 100 μm. Esta figura ha sido modificada a partir de Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig03.jpg"> Figura 3: Imagen de tinción de H&amp;E del tejido cerebral del modelo GBM posterior a la resección. (A) Una imagen de tinción de H&amp;E que muestra la cavidad de resección, el tumor residual y el tejido cerebral normal. El tejido cerebral se recolectó 1 día después de la resección. (B) Una imagen de tinción de H&amp;E que demuestre el tumor recidivante y el tejido cerebral normal. El tejido cerebral se recolectó el día 12 después de la resección. Barras de escala: 100 μm. Esta figura ha sido modificada a partir de Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El presente protocolo establece un modelo post-resección de recaída de glioblastoma (GBM) utilizando microscopía para investigar el efecto terapéutico de un hidrogel inyectable y biosensible in vivo.

Modelo post-resección de la recaída del glioblastoma para investigaciones terapéuticas de hidrogel

Tumor recurrence is an important factor indicative of a poor prognosis in glioblastoma (GBM). Many studies are attempting to identify effective ...

La recidiva tumoral es una causa importante de fracaso del régimen de resección quirúrgica de la MBG. Nuestro protocolo proporciona un modelo único de recurrencia de GBM para estudios de tratamiento local efectivos de recaídas, después de la investigación. Esta técnica proporciona un método conveniente y factible para construir el modelo post-resección de la recaída de GBM, y se puede utilizar en varios estudios sobre la recaída de GBM.Comienza preparando al animal. Corta el cuero cabelludo del ratón aproximadamente un centímetro a lo largo de la línea media de la frente derecha con unas tijeras oftálmicas. Ajuste el aparato estereotáxico para asegurarse de que la costura en espiga y la punta de fontanela frontal estén ubicadas al mismo nivel.Con un bastoncillo de algodón humedecido en violeta de genia, marque un punto a un milímetro hacia el frente, 1,8 milímetros hacia la derecha y tres milímetros hacia abajo desde la fontanela delantera. Taladre la punta con un mini taladro craneal de un milímetro de diámetro. Crea un poro de aproximadamente un milímetro de diámetro y un milímetro de profundidad.Retire el líquido cefalorraquídeo exudado con un hisopo de algodón estéril. A continuación, aspire cinco microlitros de suspensión de células tumorales con una microjeringa. Alinee la punta de la aguja de la microjeringa verticalmente con el orificio de perforación del cráneo e insértelo hasta que la punta de la aguja entre en el plano del cráneo durante tres milímetros.A continuación, retraiga la aguja 0,5 milímetros. Abra la microjeringa e inyecte la solución a una velocidad de un microlitro por minuto. Mantenga la aguja durante 10 minutos después de la inyección.Luego, retire la microjeringa lentamente y presione el punto de inyección con una bola de algodón estéril y seca. Suturar el cuero cabelludo con una sutura quirúrgica 10-0 no absorbible y desinfectar la incisión. Vigilar la salud del animal y mantenerlo en condiciones de calor.Después de que el ratón se despierte, muévalo de nuevo a la jaula de la carcasa. 10 días después de la aparición del tumor, detectar el tumor trasplantado. Para ello, inyecte al ratón por vía intraperitoneal fluoresceína de potasio y, 11 segundos después, obtenga imágenes del ratón con un sistema de imágenes bioluminiscentes in vivo.Separe el tejido del cuero cabelludo y el cráneo y verifique el orificio de perforación utilizado para construir el modelo ortotópico intracraneal de GBM. Si el agujero se ha curado, identifíquelo con un aparato estereotáctico y taladre el agujero como se muestra antes. Amplíe todo el diámetro a cinco milímetros con un taladro de cráneo y extraiga el líquido cefalorraquídeo exudado con un hisopo de algodón estéril.Enfoque el microscopio en la cabeza del mouse y ajuste la configuración para asegurarse de que el orificio de perforación esté ubicado en el centro del campo de visión. Corta las meninges con unas tijeras. Luego, extirpe parte del tejido tumoral con una microcureta y un microbisturí bajo el microscopio.Detenga el sangrado con una gasa estéril y lave la inyección con solución salina fisiológica estéril. Con una jeringa de un mililitro, inyecte 10 microlitros del hidrogel disponible comercialmente en la cavidad de resección. Utilizando este protocolo, las células GBM se implantaron en el cerebro de los ratones y el crecimiento tumoral se probó mediante imágenes bioluminiscentes in vivo el día 10.La resección y la inyección de hidrogel se realizaron el día 11. El tamaño de los tumores en el modelo de recaída post-resección de GBM fue significativamente menor que el del modelo de GBM intracraneal ortotópico. El seguimiento del crecimiento tumoral residual en el día 25 mostró la recurrencia de los tumores.La tinción de H&E confirmó que el modelo de recaída de GBM después de la resección se construyó con éxito y que los tumores residuales recidivaron significativamente después de la resección. Lo más importante que hay que recordar en este procedimiento es cortar las meninges y extirpar parte del tejido tumoral bajo el microscopio.

glioblastoma-relapse-post-resection-model-for-therapeutic-hydrogel

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video demuestra cómo las gliomasferas, derivadas de tumores cerebrales, se separan en células individuales y se encapsulan en un hidrogel a base de ácido hialurónico. Este proceso promueve las interacciones célula-célula, formando un modelo de glioblastoma estructurado y tridimensional.

Un hidrogel a base de ácido hialurónico para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Búsqueda de tumor terapéuticas las células madre mesenquimales (MSCs) muestran promesa como tratamiento para el glioblastoma invasor. El trasplante óptimo consiste en entrega de MSCs en la cavidad de resección de tumor en andamios. Aquí, preclínicas técnicas para estudio de tratamiento de MSC de glioblastoma se proporcionan como: resección tumoral guiada por la imagen; implantación de semillas MSC andamios; y seguimiento de la terapia postoperatoria.

Resección guiada por la imagen de Glioblastoma e implantación intracraneal de andamios sembrado células madre terapéuticas

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma derivados del paciente dentro de biomateriales ortogonalmente ajustables diseñados para imitar la matriz del cerebro. Este enfoque proporciona una en vitro, plataforma experimental que mantiene muchas características de en vivo células de glioblastoma normalmente perdidas en cultura.

Ácido hialurónico basado en hidrogeles de 3 dimensiones cultura de células de Glioblastoma derivados del paciente

Este trabajo describe el desarrollo de electrodos interdigitados flexibles para su implementación en modelos 3D de tumores cerebrales, a saber, cultivo in vitro , modelo in ovo y modelo murino in vivo . El método propuesto se puede utilizar para evaluar los efectos de los campos eléctricos pulsados en tumores en diferentes niveles de complejidad.

Dispositivos electrónicos orgánicos flexibles para la terapia de campo eléctrico pulsado del glioblastoma

El presente protocolo describe una plataforma experimental para evaluar los efectos de las señales mecánicas y bioquímicas en las respuestas quimioterapéuticas de las células de glioblastoma derivadas de pacientes en cultivos miméticos de matriz 3D utilizando un dispositivo de iluminación UV hecho a medida que facilita la fotoreticulación de alto rendimiento de hidrogeles con características mecánicas sintonizables.

Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Presentamos un método para replicar el microambiente tumoral de glioma en el frente invasivo que incorpora flujo de líquido intersticial. Este modelo es un hidrogel de hialuronano-colágeno I en un inserto de cultivo de tejidos donde se puede aplicar un cabezal de presión de fluido. La invasión se puede cuantificar y las células se pueden aislar o lisar.

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

Presentamos un modelo de migración de glioblastoma 3D utilizando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes generadas a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes. Esta plataforma permite visualizar la dinámica migratoria específica del paciente y evaluar la eficacia terapéutica. El ensayo puede multiplexarse tras la migración para evaluar la localización y los patrones de expresión de proteínas.

Ensayo reproducible de migración de glioblastoma 3D con localización esferoide mediada por nanopartículas magnéticas bajo condiciones hipóxicas

Aprende a establecer un modelo de recaída de glioblastoma post-resección en ratones para evaluar hidrogeles bioresponsivos inyectables. Este método permite estudiar la recurrencia tumoral y la eficacia del tratamiento local mediante imágenes bioluminiscentes.

Modelo post-resección de la recaída del glioblastoma para investigaciones terapéuticas de hidrogel

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