Name: Ensayo de captación de anticuerpos para el seguimiento de la endocitosis notch/delta durante la división asimétrica de los progenitores radiales de la glía del pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende un ensayo de captación de anticuerpos para rastrear la endocitosis Notch/DeltaD en progenitores de glía radial de Danio rerio. Este método permite visualizar la señalización celular durante el desarrollo cerebral.

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El proyecto fue apoyado por NIH R01NS120218, el Premio Mary Anne Koda-Kimble Seed a la Innovación de la UCSF y Chan Zuckerberg Biohub.

Hemos utilizado la línea de tipo salvaje AB y la línea transgénica Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] para el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco, EE.UU. (Número de aprobación: AN179000).
1. Preparación de embriones de pez cebra
<ol><li>Instale tanques de cruce de peces por la tarde antes de las 5:00 p.m., con un pez hembra de tipo salvaje y un pez macho Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisores para separarlos en cada tanque.</li>
	<li>Retire los divisores antes de las 11:00 a.m. de todos los tanques de cruce a la mañana siguiente. Manténgase callado y no moleste a los peces mientras se aparean. El desove generalmente ocurre dentro de los 30 minutos después de eliminar los divisores. Los huevos fertilizados permanecen en el fondo del tanque.<ol><li>Recoja los huevos fertilizados de los tanques con un filtro de malla. Transfiera los huevos lavándolos en una placa de Petri llena de agua de huevo y examine los embriones bajo un microscopio de disección con un aumento de 10x a 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera los embriones fertilizados a una placa de Petri limpia que contenga aproximadamente 20 ml de medio embrionario (100 ml de solución madre 1,000x contiene 29.4 g de NaCl, 1.27 g de KCl, 4.85 g de CaCl 2.2H 2 O y 8.13 g de MgSO4.7H 2O) con pipetas Pasteur de vidriode gran calibre. Mantener los embriones a 28 °C. Mantener 50 embriones fertilizados por placa de Petri con 30 mL de medio embrionario a 28.5 °C. NOTA: Un par de peces normalmente produce 100-300 embriones, y la tasa de fertilización y supervivencia de embriones sanos es superior al 95% para cada apareamiento.</li>
	<li>A la mañana siguiente, saque los embriones de la incubadora a las 8:00 a.m., cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de desarrollo de ~ 18-20 h después de la fertilización (hpf). Obsérvelos bajo un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 20x, usando luz blanca al principio. En ese momento, los embriones de pez cebra están en la etapa de somita 20.<ol><li>Deseche los embriones muertos que estén turbios o rotos bajo el microscopio usando una pipeta de vidrio.</li>
	</ol></li>
	<li>Encienda la lámpara fluorescente y elija la configuración del filtro RFP del microscopio. Luego, seleccione los embriones con fluorescencia roja fuerte y transfiéralos a un nuevo plato con agua de huevo.<ol><li>Decorionar los embriones manualmente con dos pinzas finas (las puntas de las pinzas deben ser afiladas y no dañadas) bajo luz blanca (Tabla de materiales).</li>
		<li>Sostenga el corion con un par de fórceps y haga un desgarro en el corion con los otros fórceps. Abra el desgarro con cuidado usando los fórceps y hágalo lo suficientemente grande para que el embrión pase empujando suavemente el embrión con las puntas de los otros fórceps.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera los embriones descorionados a una nueva placa de Petri con medio embrionario fresco para un enjuague rápido antes de la microinyección.</li>
</ol>2. Preparación de la microinyección
<ol><li>Utilice los capilares (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, con filamento) para tirar de agujas finas de inyección en un extractor. Diseñar y optimizar el programa de extracción de acuerdo con el manual.</li>
	<li>Abra la punta de la aguja con fórceps bajo un microscopio de disección estéreo. Haga que el diámetro de la punta sea de alrededor de 10 μm y el ángulo cónico de alrededor de 30 °.</li>
	<li>Conjugar el anticuerpo monoclonal anti-Dld de ratón con el anti-Mouse-IgG-Atto647N antes de la inyección.<ol><li>Para cada experimento de inyección, mezclar 0,5 μL del anticuerpo anti-Dld (0,5 mg/ml) con 2 μL del anticuerpo anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/ml) pipeteando 5-10 veces. Luego, incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos (o en hielo durante 2-3 h).</li>
		<li>Después de la incubación, añadir 2,5 μL de tampón de bloqueo (10 mg/ml de IgG de ratón) y 0,5 μL de rojo de fenol al 0,5% a la mezcla de anticuerpos, y pipetear 10 veces para mezclar bien, para bloquear cualquier anticuerpo no conjugado que quede en la mezcla. NOTA: Para cada ensayo, prepare una mezcla adicional sin el anticuerpo anti-Dld y úsela como control.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 1% en el medio embrionario. Calentar la mezcla contenida en agarosa a 70 °C hasta que la mezcla se vuelva transparente.<ol><li>Alícuota de la solución de agarosa en tubos de microcentrífuga de 2 ml. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjuague el embrión en el tubo que contiene un 1% de agarosa de bajo punto de fusión durante 3 s.</li>
	<li>Coloque el embrión en una tapa de placa de Petri de plástico invertida junto con gotas individuales de agarosa (~ 30-40 μL) para montar cada embrión por separado en la tapa como se muestra en la Figura 1. Coloque los embriones planos lateralmente en la agarosa y mantenga esta posición hasta que la agarosa se haya solidificado a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte 12 embriones en tres filas una por una como arriba. Cubra todos los embriones montados en la agarosa con medio de huevo.</li>
</ol>3. Microinyección
<ol><li>Coloque los embriones incrustados bajo el microscopio estereoscópico y cubra la agarosa con agua de huevo.</li>
	<li>Coloque el inyector de presión de aire junto con los micromanipuladores, colocándolos cerca de los microscopios como se muestra en la Figura 1. Utilice el cilindro de gas de acero que contiene nitrógeno gaseoso (N2) a alta presión como recurso de aire.<ol><li>Abra la válvula de gas solo después de que los embriones se hayan montado en la agarosa. Luego, cargue frontalmente la aguja de vidrio preparada con 2 μL de mezcla de anticuerpos en el micromanipulador, como se muestra en la Figura 1, cuando use el módulo de llenado frontal del microinyector.</li>
		<li>Sintoniza la presión de entrada a ~80-90 psi y la presión de inyección a ~20 psi.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibre el volumen de inyección usando un micrómetro bajo el microscopio, como se describió anteriormente15. Establezca la duración del tiempo de sintonía para que sea de 10 ms a 120 ms, de acuerdo con el tamaño de la apertura de la aguja. Administre cada pulso de inyección golpeando la paleta. Sintonice el volumen de inyección de cada administración a ~4-5 nL.</li>
	<li>Introduzca la punta de la aguja de microinyección a través de la placa dorsal del techo del cerebro posterior al punto de bisagra r0/r1 e inyecte aproximadamente 10 nL (dos o tres pulsos) de mezcla de anticuerpos sin golpear el tejido cerebral. Observe el flujo de fluidos rojos en el ventrículo cerebral. NOTA: El ventrículo del cerebro posterior es posterior al límite del cerebro posterior del mesencéfalo. La mezcla de anticuerpos inyectados que contienen rojo de fenol llena el ventrículo cerebral desde el cerebro posterior hasta el cerebro anterior inmediatamente al difundirse con líquido cefalorraquídeo.</li>
	<li>Después de la inyección, retire la punta de la aguja del embrión rápidamente girando la perilla del micromanipulador. Para una inyección exitosa, el tinte rojo de la mezcla inyectada permanece en el ventrículo cerebral de manera estable sin filtrarse en la agarosa circundante.</li>
	<li>Mueva la placa de montaje bajo el microscopio para localizar otro embrión montado en una posición adecuada para repeticiones.<ol><li>Después de inyectar de seis a ocho embriones, pelar la agarosa con un cuchillo microquirúrgico para liberar los embriones de la agarosa incrustada. Transfiera los embriones microinyectados a un plato fresco con 30 ml de medio embrionario y colóquelos a temperatura ambiente para los próximos pasos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montaje e imágenes en vivo de lapso de tiempo
<ol><li>Después de 30 min, transfiera los embriones seleccionados a 10 ml de medio embrionario. Agregue 420 μL de stock de tricaína (4 mg / ml) a 10 ml de medio embrionario para anestesiar los embriones.</li>
	<li>Para montar los embriones, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,8% que contenga la misma concentración de tricaína en el tubo. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~40 °C.</li>
	<li>Utilice una pipeta de vidrio para sumergir los embriones inyectados en la agarosa caliente durante 3 s. Luego, retire inmediatamente los embriones de la agarosa con la misma pipeta de vidrio y coloque los embriones en el centro de los platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm con una gota de agarosa del tubo. Coloque solo un embrión por gota en el vidrio.</li>
	<li>Oriente los embriones suavemente con una sonda de fibra o punta de carga para mantener el lado dorsal del cerebro embrionario lo más cerca posible del fondo de vidrio. Ajuste la posición del embrión suavemente para extender el embrión sin curvarse a medida que la agarosa se solidifica gradualmente.</li>
	<li>Después, verifique la posición del embrión volteando el plato con fondo de vidrio. Asegúrese de que todo el prosencéfalo dorsal con los embriones montados correctamente se pueda ver bajo el microscopio.</li>
	<li>Añadir 2-3 ml de medio embrionario precalentado a 28,5 °C que contenga tricaína para cubrir el embrión. Coloque el plato correctamente en la etapa de temperatura controlada del microscopio confocal, como se muestra en la Figura 1. Ajuste la temperatura de la cámara de imágenes para que esté a 28,5 °C. El embrión ahora está listo para la obtención de imágenes.</li>
	<li>Realice imágenes en vivo de lapso de tiempo con un intervalo de tiempo fijo utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x.<ol><li>Utilice el software de control de imágenes y microscopios (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>Seleccione los canales de imagen de 564 nm y 647 nm para obtener imágenes de la fluorescencia de membrana del pez cebra transgénico MyR-Tdtomato y el anti-Dld-Atto647N endosomal en la célula (Figura 1).</li>
		<li>Ajuste la potencia del láser al 30% para ambos canales. Utilice un tiempo de exposición por plano z de 200 ms para cada canal.</li>
		<li>Para cada embrión de pez cebra montado, use un paso z de escaneo de 1 μm para 20 planos z en total, y un ciclo de escaneo de 100 marcos de tiempo.</li>
		<li>Establezca el intervalo de tiempo entre cada ciclo de escaneo en 20 s y el modo de escaneo como canal, segmento.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
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<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para el etiquetado y la obtención de imágenes del tráfico endosomal de Notch/Delta en progenitores radiales de la glía del pez cebra con alta eficiencia. En comparación con los métodos anteriores utilizados para rastrear anticuerpos anti-DeltaD marcados en células SOP de Drosophila 7,8, nuestro método utilizó microinyección en lugar de incubaciónde muestras en el anticuerpo conjugado. Se microinyectaron ant...

La señalización de Notch controla la decisión y el patrón del destino celular durante el desarrollo en metazoos1, y estudios recientes han demostrado que la señalización de Notch en la división de células madre depende principalmente del tráfico endocítico 2,3. Endocytosed Notch/Delta puede activar la señalización de Notch en el núcleo y mejorar la transcripción de los genes diana de Notch 4,5,6. El tráfico endosomal direccional Notch/Delta se observó por primera vez en células precursoras de órganos sensoriales (SOP) de Drosophila durante su división celular asimétrica (ACD), lo que resultó en una mayor actividad de señalización de Notch en pIIa que en pIIb 7,8. Se han aplicado ensayos de captación de anticuerpos con anticuerpos anti-Delta y anti-Notch para monitorizar el proceso endocítico en células POE mitóticas. Los endosomas Notch/DeltaD se mueven junto con una proteína motora de quinesina al huso central durante la citocinesis, y se translocan asimétricamente en la célula pIIa debido a la matriz antiparalela del huso central asimétrico en el último momento de la división celular 3,8. Estos estudios han arrojado luz sobre los mecanismos moleculares que regulan la división asimétrica en las células SOP de Drosophila, pero no está claro si ocurren procesos endocíticos similares en progenitores de glía radial de vertebrados (RGP).
Además, los mecanismos moleculares que regulan la señalización asimétrica de Notch/DeltaD durante la división RGP de vertebrados no se conocen bien. En el pez cebra, se ha descrito que la interacción de Notch y Delta facilita la endocitosis del ligando DeltaD9. Se desconoce si la endocitosis DeltaD puede afectar la elección del destino celular de las células hijas en el cerebro de los vertebrados en desarrollo. Estudios recientes muestran que la inyección de anticuerpos anti-DeltaD conjugados fluorescentes en el tubo neural podría marcar los endosomas Sara específicamente en las células neuroepiteliales, y los endosomas Sara que contienen anti-DeltaD se segregan preferentemente en células hijas proliferantes10. Se ha sugerido que la señalización de Notch de los endosomas podría regular el destino de las células hijas. Resultados anteriores han demostrado que la mayoría de las células RGP de pez cebra en el cerebro anterior en desarrollo experimentan ACD, y la determinación del destino de las células hijas depende de la señalización intralinaje Notch / DeltaD11. Con el fin de dilucidar la naturaleza de la señalización intralinaje Notch / DeltaD en RGP de pez cebra, hemos desarrollado el ensayo de captación de anticuerpos anti-DeltaD en el cerebro en desarrollo del pez cebra. Usando este protocolo, hemos realizado con éxito el etiquetado en vivo y las imágenes del tráfico endocítico DeltaD en RGP mitóticos.
El anticuerpo anti-DeltaD marcado con fluorescencia se internaliza eficientemente en los RGP a lo largo del ventrículo del cerebro anterior. Ha facilitado enormemente el descubrimiento del tráfico direccional de endosomas DeltaD en los RGPs de división asimétrica12,13. En comparación con los protocolos anteriores de captación de anticuerpos desarrollados para cultivos de Drosophila notum y la médula espinal del pez cebra 10, este protocolo ha logrado un marcado anti-DeltaD duradero y altamente eficiente en la capa de células del ventrículo cerebral, específicamente con menos de10 nL de mezcla de anticuerpos microinyectados. La inyección del ventrículo del cerebro posterior es muy conveniente para aplicar el ensayo de captación de anticuerpos en el cerebro en desarrollo, ya que el ventrículo del cerebro posterior está bien expandido en embriones de pez cebra y lleno de líquido cefalorraquídeo en la etapa temprana de desarrollo14. Al inyectar la mezcla de anticuerpos en el ventrículo del cerebro posterior sin dañar ningún tejido en desarrollo crucial, el protocolo ha minimizado el posible daño a la zona de imágenes en el cerebro anterior tanto como sea posible. La dosis reducida del anticuerpo primario inyectado también ha evitado los posibles efectos secundarios de interferir con la señalización endógena de Delta-Notch in vivo. Este protocolo puede combinarse fácilmente con otras perturbaciones farmacológicas o genéticas, utilizarse en diferentes etapas de desarrollo y posiblemente adaptarse al cerebro adulto, así como a los organoides cerebrales 2D / 3D derivados de células madre pluripotentes humanas. En conjunto, el protocolo ha permitido comprender cómo y cuándo se establece la asimetría de señalización Notch durante ACD. El principal desafío para la implementación exitosa de este protocolo es lograr la entrega precisa de concentraciones apropiadas del anticuerpo basadas en condiciones experimentales específicas.

<table><tbody><tr><td>Plato de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm;</td>Inyector <td>de presión de aire P35GC-1.5-10-C</td><td></td>de <td>la corporación MatTek</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse-IgG-Atto647N&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Capilares, 1,2 mm de diámetro exterior, 0,9 mm de diámetro interior, con filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 Disco giratorio/Nikin de campo amplio de alta velocidad</td><td></td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp; Microscopio de fluorescencia invertida Ti con CSU-W1 confocal de gran campo de visión.</td></tr><tr><td>Pinzas Médicas Dumont Estilo 5</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Tirador P897 Marrón Flameado</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Micromanipuladores</td><td></td> Sigma-Aldrich M2773 <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-DLD&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo de IgG para ratones de Zenon</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp; &nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM agarosa de bajo punto de fusión&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de captación de anticuerpos para el seguimiento de la endocitosis notch/delta durante la división asimétrica de los progenitores radiales de la glía del pez cebra

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

La división celular asimétrica (ACD), que produce dos células hijas de diferentes destinos, es fundamental para generar diversidad celular. En los órganos en desarrollo tanto de invertebrados como de vertebrados, la división asimétrica de progenitores genera una Notchhi auto-renovadora y una hija Notchlo diferenciadora. En el cerebro embrionario del pez cebra, los progenitores de la glía radial (RGP), las principales células madre neurales de vertebrados, se someten principalmente a ACD para dar a luz a un RGP y una neurona diferenciadora. La claridad óptica y la fácil accesibilidad de los embriones de pez cebra los hacen ideales para obtener imágenes de lapso de tiempo in vivo para visualizar directamente cómo y cuándo se establece la asimetría de la señalización Notch durante ACD. Estudios recientes han demostrado que la endocitosis dinámica del ligando Notch DeltaD juega un papel crucial en la determinación del destino celular durante la ACD, y el proceso está regulado por el regulador de polaridad conservado evolutivamente Par-3 (también conocido como Pard3) y el complejo motor de dineína. Para visualizar los patrones de tráfico in vivo de los endosomas de señalización de Notch en los RGP mitóticos, hemos desarrollado este ensayo de captación de anticuerpos. Usando el ensayo, hemos descubierto el dinamismo de los endosomas que contienen DeltaD durante la división RGP.

En la Figura 2A, los embriones inyectados con Atto647N, sin unirse con el anticuerpo primario, mostraron fluorescencia de fondo en el ventrículo cerebral. Se pueden observar muy pocas partículas fluorescentes engullidas en las células. Los embriones de pez cebra inyectados anti-Dld-Atto647N mostraron grandes cantidades de partículas fluorescentes internalizadas en la mayoría de las células del cerebro anterior en desarrollo (Figura 2A, panel derecho). Después de...

Este trabajo desarrolla un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización de Notch / DeltaD intra-linaje en la división de progenitores de glía radial del cerebro embrionario del pez cebra.

Ensayo de captación de anticuerpos para el seguimiento de la endocitosis notch/delta durante la división asimétrica de los progenitores radiales de la glía del pez cebra

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

La señalización Notch controla la decisión y el patrón de sulfato durante el desarrollo en metazoos. Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para etiquetar el ligando delta-D y obtener imágenes de su tráfico endocítico en progenitores de glía radial en el cerebro anterior del pez cebra en desarrollo. La inyección ventricular cerebral oculta del pez cebra permite la captación selectiva de Anti-Dld-Atto-647N por progenitores de glía radial miotósica que recubren los ventrículos cerebrales en desarrollo con alta eficiencia y efectos duraderos.Este protocolo puede combinarse fácilmente con otras perturbaciones farmacológicas o genéticas utilizadas en diferentes etapas del desarrollo y posiblemente adaptadas al cerebro adulto, así como a organoides cerebrales 2D o 3D derivados de células madre pluripotentes humanas. Después de generar los embriones fertilizados e incubarlos durante 18 a 20 horas, retírelos de la incubadora. Obsérvelos bajo un microscopio de epifluorescencia usando luz blanca primero con un aumento de 20 veces.Deseche los embriones muertos que parezcan turbios o rotos bajo el microscopio usando una pipeta de vidrio. Luego encienda la lámpara fluorescente y elija la configuración del filtro RFP del microscopio. Seleccione los embriones con fluorescencia roja fuerte y transfiéralos a un nuevo plato con agua de huevo.Ahora decorionar los embriones manualmente con dos pinzas finas bajo luz blanca. Sostenga el corion con un par de fórceps y haga un desgarro en el corion con los otros fórceps. Abra el desgarro con cuidado usando los fórceps y hágalo lo suficientemente grande para que el embrión pase empujando suavemente el embrión con las puntas de los otros fórceps.Transfiera los embriones descorionados a una nueva placa de Petri con medio embrionario fresco para un enjuague rápido antes de la microinyección. Después de tirar de agujas finas de inyección en un extractor, abra la punta de la aguja con fórceps bajo un microscopio de disección estéreo. Haga que el diámetro de la punta sea de alrededor de 10 micrómetros y el ángulo cónico de alrededor de 30 grados.Ahora mezcle 0.5 microlitros del anticuerpo anti-Dld con dos microlitros del anticuerpo anti ratón L G Atto-647N pipeteando de cinco a 10 veces para conjugarlos e incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Al final de la incubación, agregue 2.5 microlitros de tampón de bloqueo y 0.5 microlitros de rojo fenol al 0.5% a la mezcla de anticuerpos y mezcle por pipeteo para bloquear cualquier anticuerpo no conjugado que quede en la mezcla. A continuación, prepare una agarosa de bajo punto de fusión al 1% en el medio embrionario.Caliente la mezcla contenida en agarosa a 70 grados centígrados hasta que la mezcla se vuelva transparente. Después de alícuota la solución de agarosa, manténgalos en un bloque de calor a 40 grados centígrados. Enjuague el embrión en el tubo que contiene 1% de agarosa de bajo punto de fusión durante tres segundos.Coloque el embrión en una tapa de placa de Petri de plástico invertida con gotas de agarosa individuales para montar cada embrión por separado. Coloque los embriones planos lateralmente en la agarosa y mantenga esta posición hasta que la agarosa se haya solidificado a temperatura ambiente. Cubra todos los embriones montados en la agarosa con medio de huevo.Coloque los embriones incrustados bajo el microscopio estereoscópico y cubra la agarosa con agua de huevo. Coloque el inyector de presión de aire con micromanipuladores, colocándolos cerca de los microscopios. Utilice el cilindro de gas de acero que contiene nitrógeno gaseoso a alta presión como recurso de aire.Una vez que los embriones hayan sido montados en la agarosa, abra la válvula de gas. Mientras usa el módulo de llenado frontal del microinyector, cargue frontalmente la aguja de vidrio preparada con dos microlitros de mezcla de anticuerpos en el micromanipulador. Ahora ajuste la presión de entrada a 80 a 90 libras por pulgada cuadrada y la presión de inyección a 20 libras por pulgada cuadrada.Calibre el volumen de inyección usando un micrómetro bajo el microscopio. Ajuste la duración del tiempo de sintonía de acuerdo con el tamaño de la abertura de la aguja de 10 a 120 milisegundos. Toque la paleta para administrar cada pulso de inyección y ajuste el volumen de inyección de cada entrega a cuatro o cinco nanolitros.Luego empuje la punta de la aguja de microinyección a través de la placa dorsal del techo del cerebro posterior, posterior al punto de bisagra rondimere cero-uno e inyecte aproximadamente 10 nanolitros de mezcla de anticuerpos sin golpear el tejido cerebral. Se observó el flujo de fluidos rojos en el ventrículo cerebral. Después de la inyección, retire la punta de la aguja del embrión rápidamente girando la perilla del micromanipulador.Para una inyección exitosa, el tinte rojo de la mezcla inyectada permanece en el ventrículo cerebral de manera estable sin filtrarse en la agarosa circundante. Mueva la placa de montaje bajo el microscopio para localizar otro embrión montado en una posición adecuada para repeticiones. Después de inyectar de seis a ocho embriones, pelar la agarosa con un cuchillo microquirúrgico para liberar los embriones de la agarosa incrustada.Transfiera los embriones microinyectados a un plato fresco con 30 mililitros de medio embrionario y colóquelos a temperatura ambiente para los siguientes pasos. Después de 30 minutos, transfiera los embriones seleccionados a 10 mililitros de medio embrionario. Para montar los embriones, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,8% que contenga la misma concentración de tricano en el tubo.Use una pipeta de vidrio para sumergir los embriones inyectados en la agarosa caliente durante tres segundos. Luego, retire inmediatamente los embriones de la agarosa con la misma pipeta de vidrio y coloque los embriones en el centro de los platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 milímetros con una gota de agarosa del tubo. Oriente los embriones suavemente con una sonda de fibra o una punta de carga para mantener el lado dorsal del cerebro embrionario lo más cerca posible del fondo de vidrio.Gire la posición del embrión suavemente para extender el embrión sin curvarse a medida que la agarosa se solidifica gradualmente. Después, verifique la posición del embrión volteando el plato con fondo de vidrio. Asegúrese de que todo el prosencéfalo dorsal con los embriones montados correctamente se pueda ver bajo el microscopio.Agregue de dos a tres mililitros de medio embrionario precalentado de 28.5 grados centígrados que contenga tricano para cubrir el embrión. Coloque el plato correctamente en la etapa de temperatura controlada del microscopio confocal y ajuste la temperatura de la cámara de imágenes a 28.5 grados centígrados. El embrión ahora está listo para la obtención de imágenes.Los embriones inyectados con Atto-647N mostraron fluorescencia de fondo en el ventrículo cerebral. Los embriones de pez cebra inyectados anti-Dld-Atto-647N mostraron grandes cantidades de partículas fluorescentes internalizadas en la mayoría de las células del cerebro anterior en desarrollo. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron el movimiento de los endosomas intracelulares Anti-Dld-Atto-647N durante la división celular.La mayoría de los progenitores mitóticos de la glía radial mostraron segregación asimétrica anterior o posterior de endosomas anti-Dld-Atto-647N en dos células hijas. La asimetría se estabilizó hacia el final de la anafase, lo que resultó en una herencia asimétrica de endosomas de señalización de muesca por las células hijas después. Asegúrese de que la aguja se haya colocado en el ventrículo oculto de la marca en el lugar correcto y verifique si hay alguna fuga después de la microinyección.Además de etiquetar la señalización delta de muesca, el protocolo es aplicable para etiquetar otras proteínas de membrana o proteínas extracelulares utilizando estrategias similares, si se dispone de un buen anticuerpo contra el dominio extracelular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Este video muestra un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra. Consiste en montar embriones de pez cebra decorionados incrustados en agarosa, inyectar una solución de colorante dirigida a los ligandos DeltaD en los RGP y obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia para la división celular asimétrica que confirme la activación de la señalización Notch/DeltaD.

Un ensayo de captación de anticuerpos para la obtención de imágenes de la señalización Notch/DeltaD en los progenitores de la glía radial del pez cebra

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

Se describe una técnica novedosa para la detección de receptores endógenos de baja abundancia presentes en embriones de pez cebra. Lo hemos denominado AFLIP porque consiste en el marcaje de afinidad del receptor por su ligando ligado a la inmunoprecipitación.

Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

Inmunomarcación para analizar poblaciones distintas de los microtúbulos en el cerebro en desarrollo del pez cebra se describen los métodos, que son ampliamente aplicables a otros tejidos. El primer protocolo describe un método optimizado de inmunomarcación microtúbulos estables y dinámicos. El segundo protocolo proporciona un método para la imagen y cuantificar nacientes microtúbulos específicamente.

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

El pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos (Z-REX) es un método basado en la biología química para la investigación de la señalización reactiva de moléculas pequeñas. Esta técnica se puede aplicar a peces vivos de diferentes etapas de desarrollo. Aquí, combinamos ensayos estándar en pez cebra con Z-REX para el análisis de la vía de señalización.

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Aprende un ensayo de captación de anticuerpos para rastrear la endocitosis Notch/DeltaD en progenitores de glía radial de Danio rerio. Este método permite visualizar la señalización celular durante el desarrollo cerebral.

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