Name: Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a establecer, mantener y diferenciar organoides de glándula lagrimal de ratón y humanos mediante digestión tisular, electroporación y microscopía de lapso de tiempo. Este método permite estudiar la homeostasis glandular y aplicaciones en medicina regenerativa.

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Agradecemos a Yorick Post por el desarrollo inicial del protocolo. Este trabajo fue apoyado en parte por un premio del Cancer Research UK Grand Challenge (C6307 / A29058) y la Fundación Mark para la Investigación del Cáncer al equipo de SPECIFICANCER.

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
<li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

Hans Clevers es el jefe de Investigación Farmacéutica y Desarrollo Temprano en Roche, Basilea, y posee varias patentes relacionadas con la tecnología de organoides.

Este protocolo describe el establecimiento y uso de organoides de la glándula lagrimal para ensayos funcionales, modelado de mutaciones y trasplante. Al establecer organoides de ratón y glándula lagrimal humana, la disociación tisular es crucial. Si el tejido no se digiere lo suficiente, el rendimiento del organoide será bajo. Si el tejido se digiere en exceso, las células morirán y no crecerán como organoides. Cada tejido debe ser digerido con una enzima específica durante un tiempo específico para asegurar un crecimiento óptimo de los organoides14,17,18. La glándula lagrimal es un tejido bastante blando para el cual una digestión de colagenasa de 5-10 min combinada con disociación mecánica basada en pipeteo es suficiente para aislar pequeños trozos de tejido. Si es necesario obtener células individuales para aplicaciones como la secuenciación de ARN de una sola célula, la disociación puede llevarse a cabo durante más tiempo hasta que se alcance la etapa de una sola célula, pero la disociación debe detenerse tan pronto como se obtengan células individuales para limitar cualquier disminución en la viabilidad. Como la disociación tisular es tan crucial, la digestión excesiva es la razón más probable del fracaso del establecimiento de organoides de la glándula lagrimal.
El mantenimiento adecuado de los organoides de la glándula lagrimal es importante para su uso. El mantenimiento a largo plazo es un sello distintivo de los organoides de la glándula lagrimal derivados de células madre adultas, en comparación con los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas 7,17. Para lograr un mantenimiento a largo plazo, se debe realizar una división regular de organoides y cambios medios. Sin esto, los organoides comienzan a diferenciarse y desarrollar un potencial de células madre disminuido, lo que dificulta su mantenimiento a largo plazo7. En este paso nuevamente, la digestión excesiva puede matar las células madre y perjudicar el mantenimiento de los organoides. Para el mantenimiento regular, no se requiere la disociación de organoides en células individuales. Sin embargo, para generar líneas de organoides clonales knock-out, es fundamental comenzar con células individuales. De lo contrario, los organoides estarán constituidos por un mosaico de células con diferentes antecedentes genéticos, lo que imposibilita analizar el efecto de una única mutación definida. Aquí, describimos el uso de un editor base C > T para generar codones de parada. Este editor del genoma se basa en la presencia de codones de arginina, glutamina o triptófano dentro de 12-18 bases de un NGG PAM. Cuando estas condiciones no se cumplen en el diseño de un ARNg, se pueden utilizar editores de bases Cas9 o C >T convencionales con PAM alternativos 7,18. Sin embargo, el Cas9 convencional introduce roturas de doble cadena que resultan en indeles al reparar11. Como ambos alelos pueden albergar diferentes indeles, el genotipado de clones requiere precaución adicional. La deconvolución de las modificaciones introducidas debe realizarse para asegurar que ambos alelos contienen indeles fuera de marco y, por lo tanto, que los clones organoides son eliminados para el gen objetivo19. La ventaja de los editores de bases C > T radica en el hecho de que pueden usarse para modelar mutaciones puntuales que no necesariamente resultan en codones de parada. Por ejemplo, se pueden utilizar para modelar mutaciones específicas de Pax6 encontradas en pacientes con aniridia para estudiar su impacto en la fisiología de la glándula lagrimal20.
La glándula lagrimal secreta la parte acuosa de la película lagrimal1. La secreción lagrimal puede recapitularse en organoides humanos después de la diferenciación mediada por la retirada del factor de crecimiento y la inhibición de NOTCH. En estas condiciones, los organoides experimentan diferenciación terminal y no pueden mantenerse más. Sin embargo, los organoides diferenciados de la glándula lagrimal pueden guiar el desarrollo de fármacos inductores de lagrimeo en el contexto de la enfermedad del ojo seco, potencialmente en pantallas de alto rendimiento. El ensayo de desgarro presentado en este protocolo es el que actualmente da el mayor cambio en el tamaño del organoide en un corto período de tiempo, lo que facilita su cuantificación en el contexto de un cribado de drogas 7,9,17.
La terapia con células madre es muy prometedora para la regeneración de la glándula lagrimal en la enfermedad del ojo seco21. Los organoides de glándulas lagrimales derivados de células madre adultas podrían ser un material de origen para tales aplicaciones. El protocolo presentado aquí da como resultado un injerto de organoides de la glándula lagrimal humana, principalmente como quistes. El injerto de organoides bajo puede surgir debido a que los organoides se inyectan en el sitio equivocado. El entrenamiento del procedimiento de inyección con un tinte permite el seguimiento del lugar de inyección y, en última instancia, mejora la precisión de la inyección. Alternativamente, la epidermis del ratón puede ser incisa para tener acceso directo a la glándula lagrimal, como se hizo en ratas antes de los22 años. Este método lleva más tiempo, pero puede ser más preciso. Por otro lado, con el protocolo actual, los organoides no se integraron funcionalmente en la glándula lagrimal del ratón. Se han observado resultados similares para el injerto de glándula lagrimal derivado de iPSC22. El método de trasplante podría mejorarse aún más hiriendo la glándula lagrimal por adelantado, utilizando un modelo de ratón de ojo seco y / o inyectando los organoides como células individuales o pequeños grupos. Sin embargo, los organoides de la glándula lagrimal derivados de células madre adultas y el conjunto de herramientas relacionado pueden ser la base de futuras aplicaciones en la investigación de la glándula lagrimal y la medicina regenerativa.

La glándula lagrimal es el epitelio glandular responsable de producir la mayor parte de la capa acuosa de la película lagrimal1. La capa acuosa de la película lagrimal no sólo contiene agua para lubricar la superficie ocular, sino también un gran repertorio de componentes antimicrobianos que protegen la superficie ocular de infecciones2. Cuando la glándula lagrimal está dañada o inflamada, se produce la enfermedad del ojo seco, lo que resulta en molestias para los pacientes y eventualmente puede conducir a la pérdida de la visión3. A lo largo de los años, los sistemas modelo para estudiar la glándula lagrimal, en particular la glándula humana, se han limitado 4,5,6. Esto ha contribuido a una brecha de conocimiento sobre la función de la glándula lagrimal en condiciones fisiológicas y patológicas.
Recientemente, se han desarrollado modelos in vitro para estudiar la glándula lagrimal en una placa 7,8,9. Estos organoides de la glándula lagrimal se derivan de células madre adultas cultivadas como estructuras tridimensionales en una matriz extracelular complementada con un cóctel de factores de crecimiento que sostiene sus capacidades regenerativas in vitro7. La ventaja de los organoides derivados de células madre adultas (ASC) es que se pueden mantener durante mucho tiempo mientras recapitulan las características del tejido sano. Este tipo de organoide consiste únicamente en células epiteliales, a diferencia de los organoides derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que también pueden contener células del estroma, por ejemplo. A diferencia de los organoides derivados de células madre pluripotentes (PSC), los organoides ASC se establecen directamente a partir de tejido adulto y no requieren ninguna modificación genética para expandirse. Los organoides ASC expresan características adultas10.
Este protocolo contiene una caja de herramientas para derivar organoides de la glándula lagrimal a partir de tejido primario de ratón y humano. El protocolo describe cómo mejorar aún más la funcionalidad de los organoides mediante la simple retirada del factor de crecimiento y cómo provocar que los organoides secreten líquido lagrimal mediante la realización de un ensayo de hinchazón. Este protocolo también incluye un método de transfección basado en electroporación para diseñar genéticamente organoides de ratón utilizando editores de bases derivados de CRISPR. A diferencia del Cas9 convencional, el uso de editores de bases permite la modificación de bases simples en el genoma sin generar una ruptura de doble cadena11,12. Por último, se describe el trasplante ortotópico de organoides de la glándula lagrimal humana en ratones inmunodeficientes y la posterior evaluación histológica del injerto. Este kit de herramientas organoides de la glándula lagrimal se puede utilizar en la investigación sobre la regeneración y función de la glándula lagrimal y para el modelado de enfermedades genéticas e inflamatorias.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga de bloqueo seguro de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Hidrato de tetraclorhidrato de diaminobenzidina (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9 , ATENCIÓN, la solución de 6 g/L se puede almacenar alícuota a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>5x verde Tampón GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M891A Almacenar</td><td>a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Tienda a -20 &deg; C, stock a 30 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>tienda a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Placas de agar que contienen ampicilina</td> Instituto <td></td><td></td><td>Hubrecht</td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave VAPOUR-Line lite</td><td>VWR chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Almacenar en -20 &deg; C, 50x</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine aguja de insulina 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de sobremesa DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>MP biomedicals</td><td>160069</td><td>Almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>BTXpress BTX</td><td>MDS450805</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Instituto Hubrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casetes</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>Medio de criopreservación, siga las instrucciones</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS: 5949-29-1</td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9407</td><td>Alícuotas a 20 mg/mL, 20x, almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tubos cónicos 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos 50 mL</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Extracto de Membrana Basal (BME), Factor de Crecimiento Reducido, Tipo 2 - matriz extracelular</td><td>R& D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>Tienda en -20 &deg; C, manténgalo a 4 & grados; C hasta por 1 mes</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>Almacene a -20 & grados; C, stock a 10 mM, 1000x</td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato disódico anhidro</td><td>Productos químicos VWR</td><td>28026.292</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Disodiohidrogenofosfato dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS:10028-24-7</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>Alícuotas a 50 U/mL, almacenamiento a -20 & deg; C hasta su uso, 400x</td></tr><tr><td>Bisturí Desechable Estéril N&deg; 10</td><td>Swann Morton 3033838</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DM4000 Microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>Mezcle los 4 nucleótidos juntos, Almacene a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>Coladores Easy 70 &micro; m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP ratón</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206; 5000</td><td>PRECAUCIÓN, Úselo para preparar otras diluciones de etanol</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Sistema de adquisición de imágenes celulares</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Microscrope de campo claro para imágenes en vivo</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Almacene a -20 &deg; C, stock a 100 mg/mL en medio base, 100x</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH, Fiji developers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>CAS: 50-00-0, PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>Tienda a -20 &deg; C, stock a 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Productos químicos de VWR</td><td>10047105</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Almacenar a 4 & grados; C, 100x</td></tr><tr><td>Histocore H y C, Máquina de inclusión de tejidos</td><td>Placa caliente Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de antígeno nucleolar humano</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0, PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno 30%</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS: 7722-84-1, PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Higromicina B-oro</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>Stock a 100 mg/&micro; L, 1000x</td></tr><tr>plásmido <td></td><td></td><td>que contiene casete de resistencia a la higromicina</td><td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB medio</td><td>Instituto Hubrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Microtomo RM2235</td> Kit de aislamiento de ADN <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ADN Miniprep</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td> K210003 <td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>Almacenar en -20 &deg; C, stock a 500 mM, 400x</td></tr><tr><td>NEPA21 electroporator</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>Tienda a -20 &deg; C, stock a 1M, 100x</td></tr><tr><td>ratones NOD Scid Gamma (NSG)</td> colonia <td>del Instituto</td><td></td><td></td>Hubrecht</tr><tr><td>Medio acondicionado Noggin</td><td>U-Protein Express</td><td>Pedido personalizado</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Noradrenaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7257</td><td>Tienda a -20 &deg; C, culata a 100 mM</td></tr><tr><td>Horno</td><td>Memmert</td><td></td><td>Set a 58 & grados; C</td></tr><tr><td>Pipetas P20, P200 y P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Productos químicos VWR</td><td>10048502</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetas, taponadas para vidrio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Pertex</td><td>Klinipath</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X, almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Prostaglandina E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>Tienda a -20 &deg; C, culata a 10 mM, placa de Petri 10000x</td></tr>, tampón <tr><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td>Q5 de<td>10 cm</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract Solución de extracción de ADN</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>alícuotas de almacenamiento a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>R-espondina 3 medio acondicionado</td><td>U-Protein Express</td><td>Pedido personalizado</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>sgRNA Imprimación inversa: TCTGCGCCCATCTCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTCTCTCTCTCTCTACAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>Adhesivo, molido</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS: 26628-22-8, PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS: 6132-04-3</td></tr><tr><td>Imprimación directa estándar: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eficiencia de subclonación células competentes DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular en suspensión (24 pocillos)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 pocillos</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular en suspensión (12 pocillos)</td><td>Greiner Bio-One 665102</td><td></td><td>12 pocillos</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TAE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>Stock a 50x, diluido a 1x con agua ultrapura</td></tr><tr><td>Plásmido que contiene transposasa</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>tienda en 4 & deg; C</td></tr><tr><td>U6_Forward imprimación: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7, PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 diclorhidrato Almacene</td><td>a -20 & deg; C, culata a 10 mM, 1000x</td></tr></tbody></table>

establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

La glándula lagrimal es un órgano esencial para la homeostasis de la superficie ocular. Al producir la parte acuosa de la película lagrimal, protege el ojo del estrés de desecación y los insultos externos. Poco se sabe sobre la (fisio)fisiología de la glándula lagrimal debido a la falta de modelos in vitro adecuados. La tecnología de organoides ha demostrado ser una plataforma experimental útil para múltiples órganos. Aquí, compartimos un protocolo para establecer y mantener organoides de la glándula lagrimal humana y de ratón a partir de biopsias de glándulas lagrimales. Al modificar las condiciones de cultivo, mejoramos la funcionalidad organoide de la glándula lagrimal. La funcionalidad del organoide se puede probar a través de un ensayo de "llanto", que implica exponer los organoides de la glándula lagrimal a neurotransmisores seleccionados para desencadenar la liberación de lágrimas en su luz. Explicamos cómo visualizar y cuantificar este fenómeno. Para investigar el papel de los genes de interés en la homeostasis de las glándulas lagrimales, estos pueden ser modificados genéticamente. Describimos a fondo cómo modificar genéticamente los organoides de la glándula lagrimal utilizando editores de bases, desde el diseño del ARN guía hasta el genotipado de clones de organoides. Por último, mostramos cómo probar el potencial regenerativo de los organoides de la glándula lagrimal humana mediante la implantación ortotópica en el ratón. En conjunto, este conjunto completo de herramientas proporciona recursos para utilizar organoides de ratón y glándula lagrimal humana para estudiar la (fisio)fisiología de la glándula lagrimal.

Tras la disección de la glándula lagrimal del ratón (Figura 2A), la digestión enzimática y mecánica generó pequeños fragmentos de tejido, entre los que se podían distinguir los acinos y los conductos (Figura 2B). Los pedazos grandes restantes de tejido desestabilizarían la ECM, lo que reduciría el crecimiento inicial de los organoides. La derivación del organoide de la glándula lagrimal de ratón fue exitosa cuando se encontraron organoides quísticos de ~ 500 μm de diámetro después de ~ 7 días, la etapa en la que los organoides estaban listos para ser divididos (Figura 2C). Incluso si la derivación general del organoide es exitosa, algunos organoides pueden comenzar a crecer antes de detenerse eventualmente. Los organoides de la glándula lagrimal humana crecieron como quistes en 3-4 días y alcanzaron su tamaño completo en 10-14 días después del aislamiento del tejido (Figura 2D). Tanto para ratones como para humanos, la derivación de organoides a veces fallaba, con ningún o pocos organoides creciendo; Esto generalmente fue causado por la digestión excesiva del tejido. Los organoides de la glándula lagrimal del ratón podrían pasar al menos 40x y los organoides humanos al menos 20x. El paso se realizó cada 7-10 días en promedio, dependiendo del crecimiento del organoide.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> Figura 2: Establecimiento de organoides de ratón y glándula lagrimal humana. (A) Fotografías de las diferentes etapas de la disección de la glándula lagrimal del ratón. La flecha apunta a la glándula lagrimal debajo de su membrana protectora. (B) Imágenes de campo claro de células de la glándula lagrimal del ratón justo después de la digestión del tejido, con recuadros que muestran un acino y un conducto. (C) Imágenes de campo claro de una derivación exitosa y fallida del organoide de la glándula lagrimal del ratón. (D) Imágenes de campo claro del crecimiento de organoides humanos en el transcurso de 14 días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los organoides de la glándula lagrimal contienen una gran proporción de células madre cuando se cultivan en el medio de expansión. Para aumentar su nivel de diferenciación, configuramos un ratón y un medio de diferenciación humano con un contenido reducido de factor de crecimiento. Después de 5 días y 7 días, respectivamente, en el medio de diferenciación, los organoides de la glándula lagrimal humana y del ratón se volvieron más densos (Figura 3A-B). Este cambio morfológico se correlacionó con el aumento de las propiedades funcionales. La aplicación del activador cíclico de AMP forskolina o el neurotransmisor norepinefrina resultó en hinchazón organoide (es decir, secreción de agua apical) en menos de 3 h (Figura 3C). Cuando la hinchazón tomó más de 3-4 h, esto sugirió que los organoides no estaban lo suficientemente diferenciados y / o no expresaban marcadores funcionales, como receptores para neurotransmisores.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> Figura 3: Diferenciación de organoides de ratón y glándula lagrimal humana y ensayo de hinchazón funcional en organoides humanos. (A) Imágenes de campo claro de organoides de glándula lagrimal de ratón cultivados en medio de expansión durante 7 días y en medio de diferenciación durante 5 días después de 2 días en medio de expansión. (B) Imágenes de campo claro de organoides de glándulas lagrimales humanas cultivadas en medio de expansión durante 11 días y en medio de diferenciación durante 9 días después de 2 días en medio de expansión. (C) Imágenes de campo claro de organoides diferenciados de la glándula lagrimal humana expuestos a medio de diferenciación fresco (control), a 1 μM de forskolina y a 100 μM de norepinefrina en el transcurso de 3 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para eliminar Pax6 en organoides de glándulas lagrimales de ratón, se generó un plásmido que contenía el ARNg dirigido a Pax6 elegido mediante PCR y ligadura (Figura 4A). Este plásmido que contiene ARNg se electropórrió junto con los plásmidos Piggy-Bac (plásmidos que contienen transposones y transposasa de resistencia a la higrogicina) y el editor de bases C &gt; T Cas9 en organoides de glándulas lagrimales de ratón disociados en células individuales. Después de 3 días, cuando los organoides se habían recuperado, fueron expuestos a la higrogicina para seleccionar clones que habían incorporado el casete de resistencia a la higrogicina. En electroporaciones exitosas, los organoides resistentes a la higrogicina crecieron (Figura 4B). Los clones de organoides en crecimiento que eran mayores de ~ 300 μm fueron escogidos, idealmente antes de que comenzaran a diferenciarse espontáneamente (Figura 4C). El ADN se extrajo de parte del organoide mientras se mantenía el resto en cultivo. La amplificación por PCR del locus Pax6 al que se dirige el ARNg produjo una banda de 367 pb para cada uno de los clones seleccionados (Figura 4D). Después de secuenciar el locus amplificado, se mantuvieron clones que fueron homocigóticamente C &gt; T editados (n = 1). Por otro lado, los clones que no fueron editados (n = 4), editados heterocígicamente o mal editados (n = 1) fueron descartados (Figura 4E). En general, utilizando este ARNg dirigido a Pax6, se obtuvo un clon homocigótico de la glándula lagrimal de ratón knock-out de seis secuenciados. Algunos clones crecieron bien, pero algunos clones de organoides se perdieron después de la recolección o comenzaron a diferenciarse (Figura 4F). De los 10 clones de organoides elegidos, 7 crecieron bien.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> Figura 4: Knock-out mediado por edición de base de Pax6 en organoides de glándula lagrimal de ratón. (A) Traza de secuenciación de Sanger de pFYF1320 después de la correcta integración del ARNg dirigido al locus Pax6. (B) Imágenes de campo claro de organoides de la glándula lagrimal de ratón 5 días después de la exposición a la higromicina después de la electroporación. Los organoides fueron cultivados en medio de expansión de ratón. A la izquierda hay un ejemplo de una electroporación fallida, sin ningún clon resistente a la higromicina en crecimiento. A la derecha hay un ejemplo de una electroporación exitosa, con varios clones de organoides resistentes a la higromicina que sobreviven. (C) Imágenes de campo claro de clones que deben ser recogidos y clones que no deben ser recogidos. (D) Gel de agarosa que muestra la amplificación del locus Pax6 dirigido con el ARNg. En verde, se resalta la banda del tamaño esperado de 367 pb. (E) Rastro de secuenciación de Sanger de tres clones de organoides que eran resistentes a la higromicina. El clon superior no está editado. El clon del medio es una edición homocigótica C &gt; T y, por lo tanto, un knock-out homocigoto. El clon inferior presenta dos mutaciones puntuales heterocigotas y es un knock-out heterocigótico o un clon mixto y ha sido editado erróneamente. (F) Imágenes de campo claro de los clones de organoides seleccionados con varios niveles de crecimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Por último, para realizar el trasplante ortotópico de organoides de la glándula lagrimal humana en ratones, se utilizaron organoides que se dividieron con 3 días de anticipación (&lt; 100 μm de diámetro). El injerto de organoides se confirmó 1 mes después de inyectar los organoides en la glándula lagrimal del ratón mediante tinción de un marcador específico para humanos, el antígeno nucleolar humano (Figura 5). La ausencia de tinción puntiaguda de todas las secciones de la glándula lagrimal del ratón significó una falta de injerto de organoide humano.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> Figura 5: Trasplante de organoides de la glándula lagrimal humana en la glándula lagrimal del ratón. Tinción de glándulas lagrimales de ratón trasplantadas para el marcador nucleolar humano para monitorear el injerto 1 mes después del trasplante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuadro complementario 1: Composición de los medios y buffers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Este protocolo describe cómo establecer, mantener, modificar genéticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente y trasplantar organoides de la glándula lagrimal derivados de tejido primario de ratón y humano.

Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Con los organoides de la glándula lagrimal, uno puede ver cómo ciertos genes controlan la homeostasis de la glándula lagrimal. Además, los organoides se pueden utilizar para la medicina regenerativa. La principal ventaja de la tecnología de organoides de la glándula lagrimal derivada de células madre adultas es que permite el crecimiento y estudio de células epiteliales de la glándula lagrimal sanas y no transformadas.Estos organoides podrían eventualmente usarse para tratar a pacientes con enfermedad del ojo seco. Comience preparando el medio y el material requerido para el experimento, seguido de combinar todos los componentes del medio de digestión antes del experimento. Moje previamente los bisturíes en este medio para evitar que las piezas de tejido se peguen a ellos.Recupere el tejido de la glándula lagrimal del ratón del medio, colóquelo en la placa de Petri y piquelo con bisturís prehumedecidos. Una vez que las piezas de tejido tengan menos de 0,5 milímetros cúbicos, raspe la placa de Petri con el bisturí y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros que contenga el medio de digestión. Para una biopsia humana muy pequeña, colóquela directamente en el medio de digestión sin picar.Incube el tubo de 15 mililitros que tiene trozos de tejido durante un máximo de 15 minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados. Mientras tanto, estrecha la punta de una pipeta Pasteur en una llama y humedécela previamente en el medio base. Para facilitar el proceso de disociación, pipetear la mezcla picada hacia arriba y hacia abajo cada cinco minutos con la pipeta Pasteur prehumedecida y estrechada.Cuando muchas células individuales y grupos pequeños sean visibles bajo el microscopio, detenga la disociación agregando 10 mililitros del medio base. Después de girar a 400 g durante cinco minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros del medio base para repetir el lavado y granular las celdas. Retire los trozos de tejido grandes y no digeridos y las fibras de colágeno restantes filtrando la mezcla picada a través de un colador de 70 micrómetros.Girar el eluido a 400g durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de matriz extracelular fría, o ECM, para una sola glándula lagrimal de ratón y 50 microlitros de ECM fría para una biopsia humana, sin crear las burbujas. Siembre hasta 100 microlitros de células por pocillo de una placa de suspensión de 12 pocillos usando un P200 para producir aproximadamente gotas de 20 microlitros en el pozo.Coloque la placa boca abajo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para permitir la solidificación de ECM. Una vez que el ECM esté solidificado, agregue aproximadamente un mililitro de medio de expansión de ratón a temperatura ambiente por pocillo de una placa de 12 pocillos. Preparar un mililitro de medio de diferenciación humano que contenga componentes individuales que induzcan la secreción por los organoides de la glándula lagrimal.En un microscopio automatizado de lapso de tiempo de campo claro, configure las posiciones que se tomarán en la placa, el intervalo de tiempo de cinco minutos y la duración de cuatro horas. Asegúrese de que una gota completa de ECM sea visible en cada posición. Antes de comenzar a tomar imágenes, retire el medio de cultivo de los pocillos para obtener imágenes sin mover la placa del microscopio y reemplácelo con el medio de diferenciación humana recién preparado y bien resuspendido que contenga compuestos, incluyendo forskoline y noradrenalina.Como control negativo, incluya un pozo con medio de diferenciación renovado. Haga clic en el botón de ejecución en el microscopio y analice los resultados después de cuatro horas. Después de disociar los organoides como se menciona en el texto, deseche el sobrenadante.Resuspender las células en 80 microlitros del tampón de electroporación. En un tubo de 1,5 mililitros, prepare los plásmidos necesarios para el experimento. Agregue los plásmidos a las células y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Configure el electroporador con los parámetros para el pulso de poring y el pulso de transferencia. Coloque las células con los plásmidos en una cubeta de electroporación. Mida inmediatamente la resistencia, que debe estar entre 0,3 amperios y 0,55 amperios, y electroporar inmediatamente.Una vez hecho esto, transfiera las células a un tubo de 1.5 mililitros y agregue 400 microlitros de tampón de electroporación complementado con un inhibidor de la Rho-quinasa. Permita que las células se recuperen a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, pellet las células a 500 g durante cinco minutos.Después de desechar el sobrenadante, coloque las células en 200 microlitros de ECM. Después de la solidificación, agregue el medio de expansión del mouse. Para la preparación de organoides, divida los organoides de la glándula lagrimal humana aproximadamente tres días antes del día del trasplante.Para extraer los organoides de la ECM, agregue dispasa al medio de cultivo para alcanzar una concentración final de 0.125 unidades por mililitro, y resuspenda completamente las gotas de ECM para interrumpirlas usando un P1000. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37 grados centígrados durante 30 minutos. Resuspender los organoides en 10 mililitros de medio base para lavar la enzima.Después de peletizar las células a 400 g durante cinco minutos, resuspenderlas en 50 microlitros de medio de expansión humano frío complementado con 5% de ECM. Coloque la suspensión organoide sobre hielo y proceda inmediatamente al trasplante. Para el trasplante ortotópico en ratones, aspirar la suspensión organoide en una aguja de insulina.Cuando el ratón esté dormido, colóquelo rápidamente de lado con la glándula lagrimal principal accesible. Inyecte cinco microlitros de la suspensión organoide directamente a través de la piel en la glándula lagrimal. Permita que el ratón se recupere y evalúe la presencia de cualquier molestia relacionada con el trasplante diariamente, especialmente en el ojo.Tras la disección de la glándula lagrimal del ratón, la digestión enzimática y mecánica generó pequeños fragmentos de tejido, incluyendo los acinos y los conductos. En la exitosa derivación de organoides de la glándula lagrimal de ratón, se encontraron organoides quísticos de aproximadamente 500 micrómetros de diámetro después de siete días. Los organoides de la glándula lagrimal humana crecieron como quistes en tres o cuatro días y alcanzaron un tamaño completo en 10 a 14 días después del aislamiento del tejido.Después de cinco días y siete días, respectivamente, en el medio de diferenciación, los organoides de la glándula lagrimal humana y del ratón se volvieron más densos. La aplicación del activador cíclico de AMP forskoline o el neurotransmisor norepinefrina resultó en hinchazón organoide en menos de tres horas. En la electroporación exitosa, los organoides resistentes a la higrogicina crecieron.Los clones de organoides en crecimiento de más de 300 micrómetros fueron recogidos antes de su diferenciación. La amplificación por PCR del locus Pax6 dirigido por el ARN guía produjo una banda de 367 pares de bases para todos los clones seleccionados. Se obtuvo un clon homocigótico de la glándula lagrimal del ratón knockout de seis secuenciados utilizando el ARN guía dirigido a Pax6.Algunos clones crecieron bien, pero algunos clones de organoides se perdieron después de la recolección o comenzaron a diferenciarse. De los 10 clones de organoides elegidos, siete crecieron bien. El injerto de organoides se confirmó un mes después de inyectar los organoides en la glándula lagrimal del ratón mediante la tinción de un marcador específico para humanos, el antígeno nucleolar humano.Una cosa a la que hay que prestar atención es no digerir demasiado el tejido ni los organoides. De lo contrario, las células podrían morir, y esto reduciría la tasa de establecimiento de organoides. Los organoides de la glándula lagrimal se pueden analizar por histología.Al hacerlo, uno puede obtener información sobre su composición celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.

La manipulación de la murino Glándula Lagrimal

La glándula lagrimal (LG) tiene dos tipos de células que expresan α-actina muscular lisa (αSMA): células mioepiteliales (MECs) y pericytes. Los MECs son de origen ectodérmico, se encuentran en muchos tejidos glandulares, mientras que los pericitos son células musculares lisas vasculares de origen endodérmico. Este protocolo aísla los MECs y los pericitos de los LGS murinos.

El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

El método tridimensional de cultivo sin suero para células madre adultas de la glándula lagrimal (LG) está bien establecido para la inducción de la formación y diferenciación de organoides LG en células acinares o similares a las ductales.

Sistema de cultivo tridimensional sin suero para células madre de la glándula lagrimal

Aquí, presentamos un método para establecer un modelo de ratón de ojo seco acuoso-deficiente mediante la extirpación de las glándulas lagrimales extraorbitarias e infraorbitarias y evaluar los cambios en la superficie ocular en el ojo seco por deficiencia acuosa.

Establecimiento de un modelo de ratón de deficiencia acuosa de ojo seco

Generación de humanos CD40 activado por células B

Este protocolo demuestra cómo mantener sano, indiferenciada madre embrionarias humanas (ES) las células.

La cultura y el mantenimiento de células estaminales embrionarias humanas

Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de...

Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

Aprende a establecer, mantener y diferenciar organoides de glándula lagrimal de ratón y humanos mediante digestión tisular, electroporación y microscopía de lapso de tiempo. Este método permite estudiar la homeostasis glandular y aplicaciones en medicina regenerativa.

Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana (Video) | JoVE Journal

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