Establecimiento, mantenimiento, diferenciación, manipulación genética y trasplante de organoides de ratón y glándula lagrimal humana

Con los organoides de la glándula lagrimal, uno puede ver cómo ciertos genes controlan la homeostasis de la glándula lagrimal. Además, los organoides se pueden utilizar para la medicina regenerativa. La principal ventaja de la tecnología de organoides de la glándula lagrimal derivada de células madre adultas es que permite el crecimiento y estudio de células epiteliales de la glándula lagrimal sanas y no transformadas.

Estos organoides podrían eventualmente usarse para tratar a pacientes con enfermedad del ojo seco. Comience preparando el medio y el material requerido para el experimento, seguido de combinar todos los componentes del medio de digestión antes del experimento. Moje previamente los bisturíes en este medio para evitar que las piezas de tejido se peguen a ellos.

Recupere el tejido de la glándula lagrimal del ratón del medio, colóquelo en la placa de Petri y piquelo con bisturís prehumedecidos. Una vez que las piezas de tejido tengan menos de 0,5 milímetros cúbicos, raspe la placa de Petri con el bisturí y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros que contenga el medio de digestión. Para una biopsia humana muy pequeña, colóquela directamente en el medio de digestión sin picar.

Incube el tubo de 15 mililitros que tiene trozos de tejido durante un máximo de 15 minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados. Mientras tanto, estrecha la punta de una pipeta Pasteur en una llama y humedécela previamente en el medio base. Para facilitar el proceso de disociación, pipetear la mezcla picada hacia arriba y hacia abajo cada cinco minutos con la pipeta Pasteur prehumedecida y estrechada.

Cuando muchas células individuales y grupos pequeños sean visibles bajo el microscopio, detenga la disociación agregando 10 mililitros del medio base. Después de girar a 400 g durante cinco minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros del medio base para repetir el lavado y granular las celdas. Retire los trozos de tejido grandes y no digeridos y las fibras de colágeno restantes filtrando la mezcla picada a través de un colador de 70 micrómetros.

Girar el eluido a 400g durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de matriz extracelular fría, o ECM, para una sola glándula lagrimal de ratón y 50 microlitros de ECM fría para una biopsia humana, sin crear las burbujas. Siembre hasta 100 microlitros de células por pocillo de una placa de suspensión de 12 pocillos usando un P200 para producir aproximadamente gotas de 20 microlitros en el pozo.

Coloque la placa boca abajo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para permitir la solidificación de ECM. Una vez que el ECM esté solidificado, agregue aproximadamente un mililitro de medio de expansión de ratón a temperatura ambiente por pocillo de una placa de 12 pocillos. Preparar un mililitro de medio de diferenciación humano que contenga componentes individuales que induzcan la secreción por los organoides de la glándula lagrimal.

En un microscopio automatizado de lapso de tiempo de campo claro, configure las posiciones que se tomarán en la placa, el intervalo de tiempo de cinco minutos y la duración de cuatro horas. Asegúrese de que una gota completa de ECM sea visible en cada posición. Antes de comenzar a tomar imágenes, retire el medio de cultivo de los pocillos para obtener imágenes sin mover la placa del microscopio y reemplácelo con el medio de diferenciación humana recién preparado y bien resuspendido que contenga compuestos, incluyendo forskoline y noradrenalina.

Como control negativo, incluya un pozo con medio de diferenciación renovado. Haga clic en el botón de ejecución en el microscopio y analice los resultados después de cuatro horas. Después de disociar los organoides como se menciona en el texto, deseche el sobrenadante.

Resuspender las células en 80 microlitros del tampón de electroporación. En un tubo de 1,5 mililitros, prepare los plásmidos necesarios para el experimento. Agregue los plásmidos a las células y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Configure el electroporador con los parámetros para el pulso de poring y el pulso de transferencia. Coloque las células con los plásmidos en una cubeta de electroporación. Mida inmediatamente la resistencia, que debe estar entre 0,3 amperios y 0,55 amperios, y electroporar inmediatamente.

Una vez hecho esto, transfiera las células a un tubo de 1.5 mililitros y agregue 400 microlitros de tampón de electroporación complementado con un inhibidor de la Rho-quinasa. Permita que las células se recuperen a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, pellet las células a 500 g durante cinco minutos.

Después de desechar el sobrenadante, coloque las células en 200 microlitros de ECM. Después de la solidificación, agregue el medio de expansión del mouse. Para la preparación de organoides, divida los organoides de la glándula lagrimal humana aproximadamente tres días antes del día del trasplante.

Para extraer los organoides de la ECM, agregue dispasa al medio de cultivo para alcanzar una concentración final de 0.125 unidades por mililitro, y resuspenda completamente las gotas de ECM para interrumpirlas usando un P1000. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37 grados centígrados durante 30 minutos. Resuspender los organoides en 10 mililitros de medio base para lavar la enzima.

Después de peletizar las células a 400 g durante cinco minutos, resuspenderlas en 50 microlitros de medio de expansión humano frío complementado con 5% de ECM. Coloque la suspensión organoide sobre hielo y proceda inmediatamente al trasplante. Para el trasplante ortotópico en ratones, aspirar la suspensión organoide en una aguja de insulina.

Cuando el ratón esté dormido, colóquelo rápidamente de lado con la glándula lagrimal principal accesible. Inyecte cinco microlitros de la suspensión organoide directamente a través de la piel en la glándula lagrimal. Permita que el ratón se recupere y evalúe la presencia de cualquier molestia relacionada con el trasplante diariamente, especialmente en el ojo.

Tras la disección de la glándula lagrimal del ratón, la digestión enzimática y mecánica generó pequeños fragmentos de tejido, incluyendo los acinos y los conductos. En la exitosa derivación de organoides de la glándula lagrimal de ratón, se encontraron organoides quísticos de aproximadamente 500 micrómetros de diámetro después de siete días. Los organoides de la glándula lagrimal humana crecieron como quistes en tres o cuatro días y alcanzaron un tamaño completo en 10 a 14 días después del aislamiento del tejido.

Después de cinco días y siete días, respectivamente, en el medio de diferenciación, los organoides de la glándula lagrimal humana y del ratón se volvieron más densos. La aplicación del activador cíclico de AMP forskoline o el neurotransmisor norepinefrina resultó en hinchazón organoide en menos de tres horas. En la electroporación exitosa, los organoides resistentes a la higrogicina crecieron.

Los clones de organoides en crecimiento de más de 300 micrómetros fueron recogidos antes de su diferenciación. La amplificación por PCR del locus Pax6 dirigido por el ARN guía produjo una banda de 367 pares de bases para todos los clones seleccionados. Se obtuvo un clon homocigótico de la glándula lagrimal del ratón knockout de seis secuenciados utilizando el ARN guía dirigido a Pax6.

Algunos clones crecieron bien, pero algunos clones de organoides se perdieron después de la recolección o comenzaron a diferenciarse. De los 10 clones de organoides elegidos, siete crecieron bien. El injerto de organoides se confirmó un mes después de inyectar los organoides en la glándula lagrimal del ratón mediante la tinción de un marcador específico para humanos, el antígeno nucleolar humano.

Una cosa a la que hay que prestar atención es no digerir demasiado el tejido ni los organoides. De lo contrario, las células podrían morir, y esto reduciría la tasa de establecimiento de organoides. Los organoides de la glándula lagrimal se pueden analizar por histología.

Al hacerlo, uno puede obtener información sobre su composición celular.