Name: Un modelo de ratón de fibrosis hepática crónica para el estudio de la atresia biliar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a crear un modelo de ratón con fibrosis hepática crónica que simula la atresia biliar en humanos. Este método permite evaluar tratamientos con anticuerpo anti-Ly6G y estudiar mecanismos de la enfermedad.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81974056) a R.Z. y de la Fundación Nacional de la Juventud de la Naturaleza de China (82101808) y el Proyecto de Planificación de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (No. 202102020196) a Z.L.

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Biomédico de Animales Yongnuo de Guangzhou (IACUC-AEWC-F2208020), donde se realizaron todos los experimentos con animales.
1. Establecimiento del modelo de ratón fibrótico BA crónico
NOTA: Todos los animales se mantuvieron en un ambiente específico libre de patógenos (SPF) en la misma habitación, y los experimentos se llevaron a cabo en un ambiente convencional. Los ratones BALB/c en el día 12.5 de gestación (edad: 10-12 semanas; peso 35-40 g) se mantuvieron en una habitación sin patógenos específicos a 25 ° C bajo un ciclo de oscuridad / luz de 12 h y se les proporcionó acceso gratuito a alimentos y agua esterilizados en autoclave. Los ratones neonatos, dentro de las 24 h posteriores al nacimiento (peso corporal promedio: 1.5-1.6 g), fueron seleccionados para el modelo BA del ratón.
<ol><li>Prepare el RRV como se informó anteriormente16. NOTA: Debido al mal estado de supervivencia de los ratones modelo, deben separarse a los 21 días de edad para evitar que sean mordidos o incluso asesinados por otros ratones en la misma jaula.</li>
	<li>Divida los ratones neonatos en tres grupos: el grupo control, el grupo RRV y el grupo RRV + anti-Ly6G. Inyectar por vía intraperitoneal a los ratones neonatos 20 μL de VRR (título: 1,5 x 106 UFP/ml) (grupo VRR) o solución salina (grupo control) dentro de las 24 h después del nacimiento. Para agotar las células Gr-1+ , pretratar a cada ratón con una inyección intraperitoneal de 5 μg de anticuerpo anti-Ly6G 4 h antes de la inyección del RRV. NOTA: La solución de anticuerpos anti-Ly6G se almacena a 2-8 °C y no debe congelarse. Saque el anticuerpo antes de usarlo y colóquelo a temperatura ambiente durante 30 minutos para calentarlo.</li>
	<li>Inyecte 10 μg de anticuerpo anti-Ly6G en el abdomen del ratón cada 3 días hasta el día 12 después de la inyección de RRV (Figura 1A).</li>
	<li>Verifique y registre la apariencia, el peso y la supervivencia de todos los ratones diariamente.</li>
</ol>2. Inyección intraperitoneal de los ratones
<ol><li>Retire los ratones recién nacidos de la jaula. Use una jeringa de insulina de 1 ml para inyectar 20 μL de solución de RRV o 50 μL de solución de anticuerpos anti-Ly6G. Pellizque la piel del cuello del ratón joven con el dedo índice y el pulgar de una mano, y sostenga suavemente las patas traseras del ratón con el dedo anular y el dedo de la cola para exponer el abdomen.</li>
	<li>Levante la aguja en una pendiente hacia arriba. Inserte la aguja en el muslo medio de la pata trasera derecha del ratón en un ángulo de 15° con la piel. Después de moverse a lo largo de la vía subcutánea hasta que la aguja llegue al borde costal derecho del ratón, dirija la aguja hacia abajo hacia la cavidad abdominal. Luego, inyecte el líquido debajo del hígado del ratón. NOTA: Los ratones recién nacidos tienen el estómago y el bazo en el abdomen izquierdo. Si se inserta una aguja en el lado izquierdo, es fácil perforar el estómago o causar hemorragia esplénica.</li>
	<li>Saque la aguja inmediatamente después de la inyección y observe si hay sangrado o fugas en el lugar de la inyección. Si hay alguno, límpielo con un algodón esterilizado en autoclave. Devuelva el ratón a la jaula de su madre. NOTA: Para reducir la influencia de la fuga de líquido durante la inyección en los resultados experimentales, asegúrese de que la acción de inyección sea suave, retire lentamente la aguja y presione el lugar de inyección con un hisopo de algodón durante 30 s.</li>
</ol>3. Recogida de muestras de tejido
<ol><li>El día 12, anestesiar a los ratones con inhalación de isoflurano al 4% y diseccionarlos bajo un microscopio. Inserte una jeringa de insulina de 1 ml en el ventrículo izquierdo del corazón para recolectar sangre. Después de la recolección de sangre, eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano al 4% durante 10 minutos. Centrifugar la sangre a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y separar el suero para medir la función hepática. NOTA: La recolección de sangre debe realizarse mientras los ratones están vivos. Si los ratones mueren, la sangre se retendrá en los vasos sanguíneos y no se puede recolectar.</li>
	<li>Fotografía el aspecto general del hígado y el conducto biliar. Posteriormente, diseccione el hígado y el bazo del ratón de los tejidos circundantes con tijeras y pinzas. NOTA: El hígado y otros tejidos se recogen y reservan a -80 ° C para la extracción de ARN y proteínas o se empapan en formalina al 10% para la preparación de muestras histológicas.</li>
</ol>4. Angiografía fluoresceínica del conducto biliar extrahepático
<ol><li>Después de sacrificar al ratón, exponga completamente el hígado, la vesícula biliar y los conductos biliares extrahepáticos con tijeras e hisopos de algodón.</li>
	<li>Observe bajo un microscopio postural, inyecte 5-10 μL del colorante fluorescente rodamina 123 (20 mg / ml) en la vesícula biliar con una jeringa de insulina de 1 ml y tome fotografías. Este proceso es el mismo que el reportado en un16 anterior. NOTA: Se utilizan diferentes ratones del mismo grupo para la recolección de tejido de muestras y la angiografía por fluorescencia.</li>
</ol>5. Tinción H&E
<ol><li>Sumerja el tejido hepático fresco del ratón en formalina al 10% durante 24 h.</li>
	<li>Después de incrustar el tejido en parafina, use un micrótomo de parafina para cortar el bloque de parafina en secciones con un grosor de 4 μm, y coloque dos secciones consecutivas en el mismo portaobjetos. Se requiere personal experimentado para estandarizar la operación para evitar cortes en los dedos17.</li>
	<li>Coloque las rodajas en una rejilla de rebanar, desparafinarlas en xileno, hidrátelas sucesivamente en etanol absoluto, etanol al 95%, etanol al 80%, etanol al 70% y agua destilada, y remojar en cada una durante 5 minutos.</li>
	<li>Manchar las secciones con solución de hematoxilina durante 5 minutos y remojarlas en ácido clorhídrico al 1% y alcohol al 75% durante 5 s. Enjuague las secciones con agua limpia y tiñe con solución de eosina durante 1 min.</li>
</ol>6. Tinción inmunohistoquímica CK19 y F4/80
<ol><li>Los primeros tres pasos son los mismos que los pasos de incrustación, seccionado y desparafinado de tejido en la sección de tinción de H&E.</li>
	<li>Realice la reparación del antígeno con tampón Tris-EDTA (10 mmol / L de base de Tris, 1 mmol / L de solución de EDTA, pH 9.0), caliente las secciones en un horno de microondas a 95 ° C durante 10 min, y luego retírelas y enfríelas naturalmente a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque las secciones de tejido en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos para eliminar la peroxidasa endógena.</li>
	<li>Trate las rodajas con suero de cabra al 5% para bloquear la unión inespecífica.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo monoclonal primario anti-ratón citoqueratina 19 de rata o anti-ratón de rata F4/80 a las secciones, e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Incubar las secciones con anticuerpos secundarios apropiados durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Use 3,3'-diaminobencidina (DAB) como agente cromogénico para observar la reacción cromogénica bajo el microscopio.</li>
	<li>Observe las rebanadas bajo un microscopio de 40x para obtener imágenes y analícelas según sea necesario.</li>
</ol>7. Tinción de rojo Sirius
<ol><li>Realice los primeros tres pasos de incrustación, seccionamiento y desparafinado de tejido como se describe en la sección de tinción de H&E.</li>
	<li>Después de que las secciones de tejido se contratiñen con hematoxilina, cubra cada tejido con 50 μL de solución de colorante Sirius Red a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Seque los portaobjetos naturalmente a temperatura ambiente durante 4 h, agregue una gota de goma neutra a cada portaobjetos y use un cubreobjetos para cubrir lentamente el tejido y evitar burbujas. Dejar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 24 h para solidificar la goma neutra.</li>
	<li>Utilice una microscopía de luz de contraste polarizado para observar los detalles de la deposición de colágeno; Seleccione un campo de visión claro y adecuado, y ajuste el brillo y el balance de blancos del campo visual del microscopio. Obtenga imágenes y analícelas según sea necesario bajo un microscopio de 40x.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En nuestro estudio, utilizamos anticuerpos anti-Ly6G para eliminar o disminuir las células Gr-1+ en un modelo de ratón de atresia biliar infectado con RRV para mejorar el síndrome BA agudo, prolongar la tasa de supervivencia y permitir que los ratones BA entren en la fase crónica. La reducción de la dosis de anticuerpos puede conducir a BA crónica con fibrosis hepática, lo que indica que el número de células Gr-1+ cambia el resultado de BA en las fases aguda y crónica. En nuestro estudio anterior, las células Gr-1+ se redujeron después de la administración del anticuerpo anti-Ly6G, y el estado de supervivencia general de los ratones BA mejoró15. Al mismo tiempo, se ha informado que los macrófagos Gr-1+ 19, los neutrófilos Gr-1+20, las células mieloides Gr-1+21 y los granulocitosGr-1+ pueden mejorar la fibrosis en algunos modelos animales22. Sin embargo, en este estudio, las células Gr-1 + en ratones se agotaron parcialmente con dosis bajas de anticuerpos anti-Ly6G, y los depósitos de colágeno permanecieron. Como resultado, es posible que se necesite más tiempo para abordar la enfermedad más a fondo.
La aplicación del anticuerpo anti-Ly6G disminuyó la inflamación, preservó parcialmente los conductos biliares y previno la muerte aguda inducida por BA en ratones. Sin embargo, solo del 20% al 30% de los ratones entraron en la fase crónica de BA; esto puede estar relacionado con el punto de tiempo y el número de inyecciones de anticuerpos anti-Ly6G. Necesitamos explorar más a fondo este punto clave para mejorar la tasa de éxito. Además, consideramos que no solo las células Gr-1+ sino también otras células inmunes pueden desempeñar un papel importante, como las células NK, las células T, las células B y los macrófagos.
En cuanto al protocolo, es necesario tener en cuenta algunos detalles. (i) Para evitar la fuga de drogas inyectadas, utilizamos una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de 0,33 mm de diámetro, porque el diámetro de la aguja es pequeño y el orificio de la aguja en la jeringa es pequeño, lo que es propicio para reducir la posibilidad de fuga de drogas. (ii) Antes de la inyección, el ratón debe fijarse para evitar que se mueva, evitar fugas de drogas y, por lo tanto, garantizar aún más el efecto experimental. (iii) Durante la inyección del fármaco, inyectamos el fármaco en la superficie o margen inferior del hígado del ratón en la medida de lo posible para que el fármaco entrara en el abdomen y entrara en contacto con el hígado para hacer efecto. (iv) La inyección generalmente se realiza desde la parte superior derecha del muslo del ratón, porque el estómago y el bazo del ratón recién nacido están en el abdomen izquierdo y el estómago está lleno de leche. Si la aguja se inserta desde el lado izquierdo, puede perforar fácilmente el estómago, haciendo que la leche fluya hacia el abdomen, o perforar el bazo, causando sangrado.
CD177 es un homólogo de Ly6G, y se ha investigado la expresión de CD177 en pacientes con BA. CD177 puede ser utilizado como un marcador para el diagnóstico precoz de BA en niños, indicando que las células CD177+ juegan un papel importante en el curso de BA23. Al analizar los datos de secuenciación de ARN, nuestro equipo encontró que las células CD177 eran la población dominante de células Gr-1 + ; mientras tanto, los ratones Cd177−/− BALB/ c vacunados con VRR mostraron un inicio tardío de BA y una reducción de la morbilidad y mortalidad18. Por lo tanto, nuestro modelo de ratón BA crónico tiene ventajas obvias para estudiar la patogénesis y la progresión de la enfermedad de BA; también proporciona un modelo animal adecuado para estudiar posibles tratamientos para BA.

La atresia biliar (BA) es una enfermedad hepatobiliar grave que a menudo ocurre en bebés y niños pequeños; específicamente, se presenta como una colangiopatía obliterativa con ictericia neonatal y heces pálidas1. Sus características clínicas son la destrucción inflamatoria de los conductos biliares intrahepáticos y extrahepáticos y la fibrosis progresiva, que finalmente se convierte en insuficiencia hepática2. Según las estadísticas, la incidencia de BA en los países asiáticos es mayor que en los países europeos y americanos, y la incidencia de BA en los países asiáticos es de 1/8.000. La etiología de BA incluye infección viral, desarrollo anormal de vías biliares, trastornos inmunes y variaciones genéticas3. La cirugía de Kasai es el método más utilizado para mejorar la colestasis en niños con BA, pero en última instancia, esto no puede prevenir la progresión de la fibrosis4. El tratamiento actual para BA se basa principalmente en el trasplante de hígado, que está limitado por la falta de fuentes hepáticas. Un estudio en profundidad de la patogénesis de BA es el medio más directo para resolver los desafíos de esta enfermedad. Sin embargo, los estudios sobre la patogénesis de BA se basan principalmente en modelos animales de BA, y es crucial seleccionar un modelo animal apropiado.
La mayoría de los estudios histopatológicos de BA han demostrado que la hiperplasia del conducto biliar (BDP), la trombosis biliar y la fibrosis de la vena porta son las características patológicas más importantes de la BA, y existen otras características patológicas de diferentes grados al mismo tiempo, como la infiltración de células inflamatorias portales y la hinchazón de hepatocitos 5,6. En la actualidad, hay una variedad de modelos de ratón que imitan BA, como el modelo de ratón alimentado con 3,5-die-thoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina crónica (DDC) con obstrucción segmentaria del conducto biliar y pericolangitis que involucra los conductos biliares extrahepáticos7 y el modelo de ratón de fibrosis hepática con una inyección intraperitoneal de tetracloruro de carbono8. El modelo de ligadura del conducto biliar (BDL) se caracteriza por ictericia y fibrosis rápida de la vena porta9. El modelo de ratón alimentado con alfa-naftilisotiocianato (ANIT) presenta colangitis confinada al conducto biliar intrahepático y lesión de hepatocitos10. Un modelo de ratón con ictericia prolongada es inducido por inoculación retardada del rotavirus rhesus (RRV)11. Aunque hay una variedad de modelos animales, especialmente modelos de ratón, cada modelo tiene sus propias limitaciones. Solo pueden simular parte de las características de la enfermedad de BA, como la inflamación aguda o la fibrosis hepática en el proceso de atresia biliar, y no existe un modelo que sea altamente consistente con el proceso de la enfermedad y las características patológicas de BA.
El modelo clásico de ratón BA es inducido por RRV, y este modelo es el modelo más similar a BA en humanos. Sin embargo, mientras que los ratones modelo BA inducidos por VRR muestran síntomas clínicos y características patológicas similares a algunos de los de la atresia biliar extrahepática, este modelo carece de fibrosis hepática, lo que limita en gran medida el estudio en profundidad de los mecanismos de BA y el desarrollo de nuevos tratamientos12. Por lo tanto, este estudio desarrolló un nuevo modelo de ratón BA de fibrosis hepática crónica. El anticuerpo anti-Ly6G se inyectó por vía intraperitoneal antes de la inoculación del VRR el día del nacimiento. Luego, se inyectaron 5-10 μg de anticuerpos anti-Ly6G cuatro veces, con intervalos de 2 días entre cada inyección. Los síntomas de BA de los ratones mejoraron, el tiempo de supervivencia se prolongó y los ratones entraron en la etapa de fibrosis crónica. Este modelo no solo simula la respuesta de fase aguda de BA, sino que también imita los procesos del hígado y la fibrosis progresiva. Por lo tanto, es un modelo animal más adecuado para el estudio mecanicista de BA, y podría proporcionar una base teórica para desarrollar futuros tratamientos para BA.
La molécula Gr-1 es un marcador de superficie celular derivado de mieloides que originalmente se encontró que se expresaba en neutrófilos13. El agotamiento de los anticuerpos anti-Ly6G reduce los neutrófilos circulantes en más del 90% y altera la respuesta activada por otras células inmunes. Las funciones de las poblaciones de células Gr-1+ han sido reportadas en diversos estudios utilizando anticuerpos específicos de eliminación, con efectos variables identificados sobre citoquinas y protección inmune mediada14. Hemos estudiado la función de las células Gr-1+ en modelos de ratón BA inoculados con RRV. Sin embargo, dado que no se ha encontrado que la molécula Gr-1 se exprese en humanos, una molécula similar, CD177, ha sido estudiada en pacientes con BA15. Nuestros datos demuestran la importancia de las poblaciones de células Gr-1+ , particularmente en la fase fibrótica crónica de la enfermedad, y proporcionan un modelo animal adecuado para investigar posibles terapias BA.

<table><tbody><tr><td>Ratón Balb/c</td><td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td><td>20221000112</td><td></td></tr><tr><td>rata anti-ratón Ly6G</td><td>Bio X</td><td>Cell clon 1A8</td><td>West Lebanon, NH</td></tr><tr><td>rata anti-ratón citoqueratina 19</td><td>Estudios de desarrollo Hibridoma Banco</td><td>clon TROMA III</td><td>Iowa City, IA</td></tr><tr><td>rata anti-ratón F4/80</td><td>R& D Systems</td><td>MAB5580</td><td>Minneapolis, MN</td></tr><tr><td>Cepa RRV &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>MMU 18006</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico fluorescente</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía óptica</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>DMI8+DFC7000T</td><td>Wetzlar, Alemania</td></tr><tr><td>Sistema de automatización de procesos preanalíticos Hitachi</td><td></td><td>7600 Analizador clínico</td><td>Tokio, Japón</td></tr><tr><td>Anestésico isoflurano</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83702</td><td></td></tr><tr><td>colorante rojo sirius</td><td>Leagene</td><td>DC0041</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de parafina</td><td>Leica Microsystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>goma neutra</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón de fibrosis hepática crónica para el estudio de la atresia biliar

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

La atresia biliar (BA) es una enfermedad mortal que implica ictericia obstructiva, y es la indicación más común para el trasplante de hígado en niños. Debido a la etiología compleja y la patogénesis desconocida, todavía no existen tratamientos farmacológicos efectivos. En la actualidad, el modelo clásico de ratón BA inducido por rotavirus rhesus (RRV) es el modelo más utilizado para estudiar la patogénesis de BA. Este modelo se caracteriza por retraso del crecimiento, ictericia de la piel y la mucosa, heces de arcilla y orina de color amarillo oscuro. La histopatología muestra inflamación hepática severa y obstrucción de los conductos biliares intrahepáticos y extrahepáticos, que son similares a los síntomas de la BA humana. Sin embargo, los hígados de ratones en etapa terminal en este modelo carecen de fibrosis y no pueden simular completamente las características de la fibrosis hepática en la BA clínica. El estudio presentado desarrolló un nuevo modelo de ratón BA de fibrosis hepática crónica inyectando 5-10 μg de anticuerpo anti-Ly6G cuatro veces, con intervalos de 2 días después de cada inyección. Los resultados mostraron que algunos de los ratones formaron con éxito BA crónica con fibrosis típica después del lapso de tiempo, lo que significa que estos ratones representan un modelo animal adecuado para el estudio mecanicista de fibrosis hepática inducida por virus de BA y una plataforma para desarrollar futuros tratamientos de BA.

Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 5 μg de anticuerpos anti-Ly6G dentro de las 24 h del nacimiento y luego inyectados intraperitonealmente con 20 μL de RRV 4 h más tarde. Luego, se inyectaron 10 μg de anticuerpos anti-Ly6G cada 3 días hasta el día 12 (Figura 1A). La mediana del tiempo de supervivencia en el grupo de VRR fue de 13 días. Por el contrario, la mayoría de los ratones tratados con el anticuerpo desarrollaron ictericia leve y no se observó pérdida de peso (Figura 1C). Alrededor del 20% -30% de los ratones tenían síndrome BA con ictericia a largo plazo y bajo peso corporal, pero sobrevivieron durante más de 42 días. Después del tratamiento con anticuerpos anti-Ly6G, el número de células Gr-1+ disminuyó15, y los ratones entraron en la etapa de fibrosis crónica, denominada BA crónica. Las muestras se recolectaron el día 12 y el día 42, y las cortes de tejido teñidas con Sirius Red mostraron un aumento gradual de la fibrosis hepática. Los ratones BA crónicos que sobrevivieron durante 42 días se utilizaron para análisis detallados. Además del pequeño tamaño, las orejas, los pies y la piel de la cola mostraron ictericia marcada (flechas azules en la Figura 1E). El día 6 después de la inyección de RRV, el color de las heces de los ratones se volvió más claro y el color de la orina se volvió más oscuro; esto se volvió significativamente diferente del grupo de control en el día 12, cuando los ratones del grupo RRV mostraron heces blancas y orina de color amarillo oscuro. En el día 42, la orina y las heces de los ratones BA crónicos también mostraron características obvias de ictericia (Figura 1D, E). Los hígados de los ratones BA fueron removidos y comparados con los de los controles. Los hígados eran más pequeños (Figura 2B), las lesiones necróticas eran visibles a simple vista (Figura 2A, triángulo negro) y también se observó un segmento de atresia del conducto biliar de forma extrahepática (Figura 2A, asteriscos blancos).
El análisis de la sección de tejido hepático mostró que la terapia anti-Ly6G en dosis bajas disminuyó la inflamación de la vena porta. Sin embargo, todavía se observó acumulación de células inflamatorias en los cortes de tejido hepático en el día 42 (Figura 3A). La tinción de Sirius Red mostró un pequeño aumento en la deposición de colágeno en la región portal el día 12 después de la inyección de RRV. Además, no se observaron cambios significativos en la expresión de colágeno después del tratamiento con el anticuerpo anti-Ly6g, pero la expresión de colágeno en muestras de tejido BA en el día 42 aumentó significativamente (Figura 3B). Cuando se examinó bajo un microscopio de luz polarizada, se observó que las fibras de colágeno se habían acumulado en el tejido hepático adyacente. Se observó una deposición sustancial de colágeno, predominantemente verde, en las muestras de tejido BA en el día 42 (Figura 3C), y la deposición de colágeno aumentó aún más en ratones que sobrevivieron durante 42 días sin aumento de peso. Con la reducción de la inflamación portal, se observaron células del conducto biliar CK19+ el día 12. En el día 42, sin embargo, los conductos biliares maduros fueron apenas detectables, a pesar de que se observó un aumento en las células del conducto biliar CK19+ (Figura 4A, las flechas rojas indican células epiteliales del conducto biliar). En el caso de los conductos biliares extrahepáticos en ratones con BA crónica, la disección seriada de la región portal de ratones reveló que los conductos biliares extrahepáticos estaban bloqueados y tenían infiltrados inflamatorios de macrófagos (Figura 4B, las flechas negras indican macrófagos).
En comparación con la VRR sola, el tratamiento con una dosis baja de anticuerpos anti-Ly6G disminuyó la lesión hepática en términos de los niveles de enzimas hepáticas el día 12 después de la inoculación del VRR. Los niveles de alanina aminotransferasa y fosfatasa alcalina en el hígado fueron más altos en el grupo de BA crónica que en el grupo de control normal. Los cambios más pronunciados se encontraron en los niveles de bilirrubina, con ratones RRV + anti-Ly6G que muestran niveles reducidos de TBIL, DBIL e IBIL en BA agudo en contraste con RRV solo. En ratones con BA crónica, los niveles de TBIL, DBIL e IBIL aumentaron (Figura 5), lo que indica que la función hepática se redujo significativamente en la etapa de fibrosis crónica de BA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> Figura 1: Efectos del tratamiento con anticuerpos anti-Ly6G en un modelo de ratón de atresia biliar infectado con VRR . (A) Ilustración esquemática de dosis bajas de anticuerpos para inducir la fase aguda y crónica BA en ratones con flechas que indican el momento de inyección del anticuerpo y RRV. (B) Curvas de supervivencia de los ratones en el grupo control normal (Cont.), grupo de rotavirus rhesus (RRV) y grupo de anticuerpos RRV + anti-Ly6G. (C) Curvas de peso corporal de los ratones en cada grupo. (D) Imágenes representativas de los ratones y sus heces y orina en cada grupo el día 12. (E) Imágenes representativas de los ratones y sus heces y orina en cada grupo el día 42. Las flechas azules indican las orejas y la cola amarillas. Esta cifra ha sido reimpresa con permiso de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> Figura 2: Los efectos del tratamiento con anticuerpos anti-Ly6G en el hígado en un modelo de ratón de atresia biliar infectado con RRV . (A) Comparación de la anatomía hepática y la angiografía de fluorescencia del conducto biliar extrahepática entre ratones BA crónicos (derecha) y ratones normales en el día 42. (B) Comparación del tamaño del hígado entre ratones BA crónicos y ratones normales. El triángulo negro indica necrosis hepática en ratones con BA crónica. El asterisco blanco indica atresia biliar extrahepática. Esta cifra ha sido reimpresa con permiso de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> Figura 3: Rebanadas de tejido hepático de los ratones en el grupo de control normal (Cont.), el grupo de rotavirus rhesus (RRV) y el grupo de anticuerpos RRV + anti-Ly6G en el día 12 y el día 42. (A) Imágenes de secciones de tejido hepático teñidas con hematoxilina y eosina (H&amp;E). (B) La tinción de Sirius Red mostró deposición de colágeno (PSR). (C) Observación adicional de los cortes utilizando microscopía de luz polarizada (Pol. Light). Abreviatura: PV = vena porta. Barra de escala = 50 μm. Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> Figura 4: Tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido hepático del grupo control normal (Cont.), grupo de rotavirus rhesus (RRV) y grupo de anticuerpos RRV + anti-Ly6G en el día 12 y día 42 . (A) La expresión del marcador de células epiteliales del conducto biliar (CK19) en diferentes grupos de tratamiento. (B) Se demostró la infiltración celular inflamatoria de macrófagos en diferentes grupos de tratamiento. Abreviatura: PV = vena porta. La flecha roja indica las células epiteliales del conducto biliar. La flecha negra indica macrófagos. Barra de escala = 50 μm. Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> Figura 5: Comparación de la función hepática en ratones en diferentes grupos de tratamiento. La sangre de ratón se recolectó después del experimento y se probó en el departamento de laboratorio del hospital. Cada grupo contenía de tres a cinco ratones. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001. Abreviaturas: ALT = alanina aminotransferasa; AST = aspartato aminotransferasa; ALP = fosfatasa alcalina; TBIL = bilirrubina total; DBIL = bilirrubina directa; IBIL = bilirrubina indirecta. Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Establecimos un modelo de ratón de fibrosis hepática crónica, que proporciona un modelo animal adecuado para el estudio mecanicista de fibrosis hepática inducida por virus de la atresia biliar (BA) y una plataforma para futuros tratamientos de BA.

Un modelo de ratón de fibrosis hepática crónica para el estudio de la atresia biliar

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Hemos utilizado con éxito este método para crear un modelo de ratón que es más consistente con los cambios patológicos de la atresia biliar. Esta técnica puede simular los síntomas de la atresia biliar aguda y crónica, lo que es útil para la investigación futura del mecanismo de la enfermedad. Después del uso de anticuerpos, el tiempo de supervivencia de los ratones se prolongó y los síntomas se aliviaron, lo que sugiere el efecto terapéutico de los anticuerpos sobre la atresia biliar.Después de dividir los ratones neonatos en diferentes grupos, como se describe en el manuscrito, pretrate a cada ratón con una inyección intraperitoneal de cinco microgramos de anticuerpo anti-Ly6G cuatro horas antes de la inyección de rhesus rotavirus o RRV para agotar las células Gr1 positivas. Dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento, inyecte por vía intraperitoneal al ratón neonatal 20 microlitros de rotavirus rhesus o solución salina. Después de la inyección de RRV, administre 20 microgramos de anticuerpo anti-Ly6G en el abdomen del ratón.Verifique y registre la apariencia, el peso y la supervivencia de todos los ratones diariamente. Para la inyección intraperitoneal, exponga el abdomen del ratón joven pellizcando la piel del cuello con el dedo índice y el pulgar de una mano y sosteniendo suavemente las patas traseras del ratón con el dedo anular y el dedo de la cola. Levante la aguja de la jeringa en una inclinación hacia arriba e inserte la aguja en el muslo medio de la pata trasera derecha del ratón en un ángulo de 15 grados con la piel.Mientras mueve la aguja a lo largo de la vía subcutánea hasta que llegue al borde costal derecho del ratón, dirija la aguja hacia abajo en la cavidad abdominal e inyecte el líquido debajo del hígado del ratón. Saque la aguja inmediatamente después de la inyección. Observe si hay sangrado o fugas en el lugar de la inyección.Después de anestesiar al ratón en el día 12, diseccionarlo bajo un microscopio. Inserte una jeringa de insulina de un mililitro en el ventrículo izquierdo del corazón para recolectar sangre. Centrifugar la sangre a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y separar el suero para medir la función hepática.Diseccionar el hígado y el bazo del ratón de los tejidos circundantes usando tijeras y pinzas. Fotografía el aspecto general del hígado y el conducto biliar. Después de la anestesia por inhalación, exponga el hígado, la vesícula biliar y los conductos biliares extrahepáticos con tijeras e hisopos de algodón.Bajo un microscopio de postura, inyecte de cinco a 10 microlitros del tinte fluorescente Rhodamine 123 en la vesícula biliar con una jeringa de insulina de un mililitro y tome fotografías. Sumerja el tejido hepático fresco del ratón en formalina al 10% durante 24 horas. Una vez que el tejido esté incrustado en parafina, use un micrótomo de parafina para cortar el bloque de parafina en secciones con un grosor de cuatro micrómetros, y coloque dos secciones consecutivas en el mismo portaobjetos.Luego coloque las rodajas en una rejilla para rebanar, desencerarlas en xileno e hidratarlas sucesivamente en etanol absoluto, 95% etanol, 80% etanol, 70% etanol y agua destilada durante cinco minutos cada una. Tiñe las secciones con solución de hematoxilina durante cinco minutos y sumérjalas en ácido clorhídrico al 1% y alcohol al 75% durante cinco segundos. Después de enjuagar las secciones con agua limpia, tiñéndalas con solución de eosina durante un minuto.Prepare las secciones de tejido para la tinción, como se demostró anteriormente, y realice la reparación de antígenos con tampón Tris-EDTA. Caliente las secciones en un horno de microondas a 95 grados centígrados durante 10 minutos, luego retírelas y enfríelas naturalmente a temperatura ambiente. Para eliminar la peroxidasa endógena, coloque las secciones de tejido en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos y trate las rodajas con suero de cabra al 5% para bloquear la unión no específica.A continuación, agregue el anti-ratón primario Citoqueratina 19 de rata o el anticuerpo monoclonal anti-ratón F4/80 de rata a las secciones, e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Incubar las secciones con anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos a temperatura ambiente. Use 3, 3-prime-diaminobencidina como agente cromogénico para observar la reacción cromogénica bajo el microscopio.Observe las rebanadas bajo un microscopio de 40x para obtener imágenes y analizarlas según sea necesario. Una vez que las secciones de tejido estén preparadas y contrateñidas con hematoxilina, cubra cada tejido con 50 microlitros de solución de colorante rojo sirio a temperatura ambiente durante una hora. Seque los portaobjetos naturalmente a temperatura ambiente durante cuatro horas, agregue una gota de goma neutra a cada portaobjetos y use un cubreobjetos para cubrir el tejido y evitar burbujas.Deje los portaobjetos a temperatura ambiente durante 24 horas para solidificar la goma neutra. Observe los detalles de la deposición de colágeno utilizando microscopía de luz de contraste polarizado. Seleccione un campo de visión claro y adecuado, y ajuste el brillo y el balance de blancos del campo visual del microscopio.Obtenga imágenes y analícelas según sea necesario bajo un microscopio de 40x. Después de la inyección de RRV, el tiempo medio de supervivencia en el grupo de RRV fue de 13 días. La mayoría de los ratones tratados con el anticuerpo desarrollaron ictericia leve y no se observó pérdida de peso.Los hígados de ratones BA mostraron lesiones necróticas y un segmento extrahepático de atresia del conducto biliar. El tamaño del hígado es más pequeño que el de los controles. El análisis histológico mostró que la terapia anti-Ly6G en dosis bajas disminuyó la inflamación de la vena porta.La acumulación de células inflamatorias todavía se observó en las cortes de tejido hepático en el día 42. El día 12, hubo un ligero aumento en la deposición de colágeno en la región portal. En el día 42, la expresión de colágeno aumentó significativamente y se observó una deposición sustancial de colágeno en el tejido BA.Las células CK19 positivas se observaron el día 12. En el día 42, las células CK19 positivas aumentaron, pero había pocos conductos biliares maduros. El conducto biliar extrahepático en ratones BA crónicos estaba bloqueado y tenía infiltrados inflamatorios de micrófagos.Los niveles de ALT y ALP en el hígado fueron más altos en el grupo de BA crónica que en el grupo de control normal. Los niveles de bilirrubina total, bilirrubina directa y bilirrubina indirecta aumentaron, lo que indica que la función hepática se redujo significativamente en la etapa de fibrosis crónica de BA. La inyección debe hacerse con precaución para no perforar el hígado del ratón. Después de la inyección, debemos tomar unos 10 segundos para observar el estado del ratón y limpiar la sangre de la herida.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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