Name: Visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-STEM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende tomografía crio-STEM para visualizar orgánulos celulares in situ con resolución nanométrica en muestras biológicas intactas. Esta técnica no invasiva preserva estructuras nativas para estudios de biología celular tridimensional.

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Estamos muy agradecidos por el apoyo continuo y constante del autor y mantenedor del paquete de software SerialEM, David Mastronade, y Günther Resch. P.K. fue financiado por el Austrian Science Fund (FWF) a través de una beca Schrödinger J4449-B. Con el propósito de acceso abierto, los autores han aplicado una licencia de derechos de autor pública CC-BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de esta presentación. M.E. y S.G.W. reconocen la financiación de la Fundación de Ciencia de Israel, subvención no.1696/18, y del proyecto de hermanamiento Horizon 2020 de la Unión Europea, ImpaCT (subvención no.857203). M.E. reconoce la financiación del ERC en el proyecto CryoSTEM (subvención nº 101055413). M.E. es el titular de la Cátedra Sam y Ayala Zacks y director del Centro Irving y Cherna Moskowitz para Nano y Bio-Nano Imaging. El laboratorio de M.E. se ha beneficiado de la generosidad histórica de la familia Harold Perlman. También reconocemos la financiación de la Unión Europea. Sin embargo, los puntos de vista y las opiniones expresadas son únicamente los del autor o autores y no reflejan necesariamente los de la Unión Europea o de la Agencia Ejecutiva del Consejo Europeo de Investigación. Ni la Unión Europea ni la autoridad que concede la ayuda pueden ser consideradas responsables de ellas.

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El protocolo debe ayudar a los microscopistas de ciencias de la vida que estén interesados en obtener una vista 3D de los orgánulos intracelulares en regiones de la célula que no son accesibles para la tomografía TEM convencional. El mismo protocolo también se puede utilizar para la tomografía STEM de secciones plásticas, con restricciones relajadas en la exposición. El protocolo debe considerarse como un punto de partida y no como un conjunto de normas estrictas. De hecho, el poder de STEM es su flexibilidad; No hay una sola manera correcta de operarlo.
Enfatizamos que STEM, per se, se refiere solo a la sonda escaneada y no define la formación de la imagen. El contraste depende principalmente de la configuración de los detectores. Los métodos más sencillos emplean detectores con simetría axial, ya sea un disco centrado en el eje óptico o un anillo que lo rodea. En general, cuando la iluminación incide directamente en el detector, registramos una imagen BF donde la muestra (dispersión de electrones) aparece oscura; por el contrario, cuando el detector recoge solo electrones dispersos, registramos una imagen DF donde el espécimen denso aparece brillante. Cuando el hardware adecuado está disponible, SerialEM puede adquirir y grabar ambas señales simultáneamente. Hay configuraciones aún más sofisticadas disponibles, que van desde detectores con múltiples segmentos hasta cámaras totalmente pixeladas. La imagen de contraste de fase se puede lograr, por ejemplo, evaluando la diferencia entre los elementos detectores fuera del eje32,33. La recopilación de todo el patrón de dispersión 2D (difracción) por píxel define el método conocido como 4D STEM34, que permite la reconstrucción de múltiples contrastes de imagen a partir de los mismos datos originales. El STEM cuatridimensional permite la pticografía electrónica, que proporciona otro medio para obtener contraste de fase35.
Nos hemos centrado en la modalidad STEM particular que consideramos más útil para el estudio de orgánulos y células intactas o secciones celulares de micras de espesor. Esto implica específicamente el uso de imágenes BF con un pequeño ángulo de semiconvergencia en la iluminación y un ángulo de recolección relativamente grande en el detector. La pequeña convergencia proporciona una gran profundidad de campo para que toda la muestra permanezca enfocada a lo largo de la serie de inclinación19. En la práctica, con una buena etapa de microscopio, también puede eliminar la necesidad de ajustar el enfoque durante la adquisición. El precio es un compromiso en la resolución, como se describe en la sección 3 del protocolo. Hemos sugerido imágenes 4k con una sonda de ~2 nm, que con un espacio de píxeles de 1 nm alcanza un campo de visión de 4 μm. Sin embargo, se recomienda encarecidamente al lector que experimente. La segunda consideración está en el lado del detector. Cuando el disco de iluminación rellena el detector BF en el eje, el contraste de fase se suprime y domina el contraste de dispersión (amplitud); Esta condición ha sido llamada contraste de campo brillante incoherente36. La pregunta es por qué fracción llenar, y la respuesta depende de la muestra. Una muestra muy delgada mostrará el mejor contraste con el detector completamente lleno (es decir, el ángulo de recolección que coincide con el de la iluminación), pero una muestra más gruesa dispersará toda la intensidad, dejando una señal ruidosa con poco contraste. Una regla general útil es que cuanto más gruesa sea la muestra, mayor será el ángulo de corte exterior del detector BF21. El tamaño y la posición del detector son, por supuesto, fijos, por lo que el tamaño del disco de difracción se ajusta utilizando la longitud de la cámara, como se describe en la sección 1. Si los ajustes del amplificador del detector son tales que la señal llena el rango dinámico pero no se satura bajo iluminación directa (1.12.3), entonces la longitud de la cámara se puede aumentar hasta que se alcance una intensidad de señal y un contraste razonables. Una vez más, se anima al lector a experimentar. El arte, por así decirlo, está en los ángulos.
Otro parámetro, no discutido en el protocolo, es el voltaje de aceleración del microscopio. La interacción de los electrones iluminadores con la muestra será más fuerte a un voltaje más bajo. Con todo lo demás igual, podemos esperar un mayor contraste a un voltaje más bajo. Por otro lado, es el inicio de la dispersión múltiple dentro de la muestra lo que limita el grosor de la muestra utilizable, por lo que un voltaje más alto permite el uso de muestras más gruesas. Sin embargo, estos efectos son bastante sutiles. Nuestras experiencias hasta la fecha con aceleraciones de 200 kV y 300 kV son similares.
Teniendo en cuenta lo que se puede esperar de STEM en términos de resolución, esto depende nuevamente de la muestra y la configuración del detector. Usando un enfoque de análisis de partículas individuales, los iones metálicos en ferritina podrían localizarse mediante STEM de campo oscuro anular con una precisión de unos pocos angstrom37. Más recientemente, se logró una resolución subnanométrica para muestras de virus y proteínas utilizando imágenes obtenidas por contraste de fase diferencial integrado (iDPC) STEM32 , así como pticografía35. Para objetos únicos en especímenes celulares gruesos, y con los métodos descritos aquí, tal alta resolución no es realista. La resolución óptima es el diámetro de la sonda, que se relaciona con el ángulo de semiconvergencia como se describe. Otros factores degradarán la resolución, particularmente un muestreo de píxeles gruesos para alcanzar un gran campo de visión, desalineaciones en la serie de inclinación y propagación del haz de la sonda en la transmisión. Las imágenes se comparan bien con la tomografía de sección plástica. Con la configuración descrita aquí, por ejemplo, debería ser fácil ver el núcleo hueco de los microtúbulos, pero no los protofilamentos individuales.
En resumen, los métodos STEM y el hardware se encuentran en una fase de desarrollo. Podemos esperar que las innovaciones en imágenes también afecten a la tomografía, llevando a STEM a dominios que no han sido accesibles por otras técnicas. Esperamos que una convergencia con imágenes de fluorescencia criogénica correlativa basadas en métodos modernos de superresolución óptica sea especialmente fructífera. La escala de orgánulos, 100-1.000 nm, es un objetivo ideal para estos métodos emergentes.

La visualización tridimensional (3D) de orgánulos es una tarea primordial en la biología celular moderna. Dadas las escalas involucradas, que van desde decenas de nanómetros para vesículas secretoras hasta muchas micras para el núcleo celular, es difícil encontrar una sola técnica de microscopía que se adapte a todas las aplicaciones. Si bien la microscopía de fluorescencia moderna puede abarcar gran parte del rango en términos de resolución, solo aparecen las moléculas marcadas. El teatro celular sigue siendo el reino de la microscopía electrónica. Los métodos convencionales de fijación química, incrustación de plástico y tinción con metales pesados son fuertemente invasivos, por lo que los resultados pueden depender de los detalles de la preparación de la muestra. Cryo-EM, por otro lado, está limitado por la necesidad de vitrificar el medio acuoso; Los cristales de hielo que se forman difractan la iluminación de electrones, causando artefactos de contraste de mayor contraste que el material orgánico de interés.
La última década ha visto una proliferación de técnicas de imagen EM desarrolladas o adaptadas para estudios celulares1. La congelación a alta presión combinada con el fresado iterativo de haz de iones enfocado (FIB) y las imágenes seriadas de la superficie utilizando el microscopio electrónico de barrido (es decir, FIB-SEM) es actualmente el método de elección para muestras grandes2. La tomografía criogénica de rayos X blandos (crio-SXT) es adecuada para muestras de varias micras de tamaño, limitadas por la longitud de absorción característica de los rayos X blandos en agua 3,4,5. Esta escala incluye muchos tipos de células intactas, y la naturaleza cuantitativa del contraste de absorción de rayos X agrega un aspecto de la medición de concentración6 o espectroscopia7. Cuando se combina con el promedio de subtomograma, la tomografía electrónica de criotransmisión (crio-ET), basada en microscopía electrónica de transmisión de contraste de fase (TEM), ofrece la resolución más alta para macromoléculas o complejos 8,9,10. Sin embargo, es raro que los orgánulos intactos sean tan regulares que puedan promediarse enteros. Además, el modo convencional de TEM de campo amplio está limitado para el grosor de la muestra a unos pocos cientos de nanómetros mediante la combinación de dispersión inelástica (que implica pérdida de energía) en la muestra y aberración cromática en la lente magnética del objetivo11,12. La gran propagación de energía dicta el uso de un filtro de energía para eliminar la neblina desenfocada resultante, pero la muestra sensible aún sufre daños por radiación, mientras que la señal de imagen se vuelve exponencialmente más débil con el aumento del grosor.
El modo de imagen alternativo, EM de transmisión de barrido (STEM), evita la necesidad de filtrado de energía y retiene los electrones inelásticamente dispersos para la formación de imágenes, aunque actualmente a una resolución más baja que para la tomografía TEM (Figura 1). De hecho, no se forma ninguna imagen real. En cambio, como en un EM de escaneo, las mediciones se realizan punto por punto, y la imagen es ensamblada por la computadora. La ampliación está determinada solo por el tamaño de los pasos de escaneo sin cambiar las corrientes de la lente. Cuando se configura correctamente, el rango útil de espesor de la muestra para la tomografía crio-STEM (CSTET) puede alcanzar 1,5 o incluso 2 μm, aunque la zona de confort, donde la intensidad útil de la señal sigue siendo una fracción significativa de la iluminación, es de alrededor de 600-900 nm11,13. Esto es suficiente para ver una gran fracción del citoplasma y, ocasionalmente, un borde del núcleo celular. En la práctica, encontramos que la vitrificación por el método estándar de inmersión en líquido criogénico impone una restricción más severa en el grosor que las imágenes STEM. El objetivo de este artículo de video es facilitar la incorporación de CSTET en el cofre de herramientas para imágenes de células y orgánulos en laboratorios de investigación e instalaciones de microscopía.
El primer desafío es que las operaciones de microscopio en CSTET aún no están estandarizadas para aplicaciones de ciencias de la vida de la misma manera que lo han sido para la tomografía crio-TEM. El hardware STEM rara vez (o nunca) se ha dirigido al mercado crio-EM. Sin embargo, esto está cambiando con la última generación de microscopios, y muchas herramientas existentes se pueden adaptar. STEM como técnica ha despegado y tomado el relevo en gran medida en las ciencias de los materiales, donde también hay un interés incipiente en los métodos criogénicos y de dosis bajas14,15. La literatura de ciencia de materiales abunda en acrónimos BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., que se suman a la confusión. Ofrecemos aquí un punto de partida recomendado que, en nuestra experiencia colectiva en el Instituto Weizmann de Ciencias, proporciona el protocolo más general para resultados útiles basados en imágenes STEM de campo claro (BF)16. De ninguna manera agota o incluso explora la gama de posibilidades, pero servirá como base para futuras mejoras. Si bien enfatizamos crio-STEM, la mayor parte del protocolo es igualmente relevante para la tomografía STEM a temperatura ambiente de secciones incrustadas en plástico.
La esencia de STEM es escanear la muestra con una sonda electrónica enfocada (Figura 1), el cono de iluminación, y registrar señales del plano de difracción (dispersión) en transmisión, píxel por píxel, para producir imágenes 2D17,18. Los especímenes amorfos, incluyendo la mayoría de los materiales celulares, producirán un patrón de dispersión difusa en la transmisión. La configuración práctica más simple de STEM es colocar un detector circular para registrar el disco central (es decir, la iluminación de la sonda que se transmitiría sin una muestra). El espécimen dispersa electrones lejos de este cono de iluminación en la medida en que la señal disminuye. Esto produce una imagen BF: el espécimen aparece oscuro sobre un fondo brillante. También se puede usar un detector anular (o en su lugar) para detectar la dispersión de la muestra fuera del cono de iluminación. Con la muestra removida, no hay señal. Cuando una muestra está en su lugar, los objetos aparecen brillantes sobre un fondo oscuro en la imagen de campo oscuro (DF). La nomenclatura para STEM (BF, campo oscuro anular [ADF], campo oscuro anular de ángulo alto [HAADF], etc.) se refiere principalmente a los rangos de ángulos de recolección para los detectores.
El ángulo de convergencia de la iluminación representa una adaptación esencial de STEM a la tomografía celular. Cuando la máxima prioridad es la alta resolución, el ángulo de convergencia debe ser lo más grande posible. (Esto es similar a la microscopía de barrido láser confocal; la resolución está determinada por el diámetro de la sonda, que escala como la longitud de onda dividida por la apertura numérica. Tenga en cuenta que nos referimos al ángulo de semiángulo o semiconvergencia para EM). Cuando la prioridad es la profundidad de campo, por otro lado, un compromiso en la resolución ofrece una gran ventaja, ya que el haz enfocado permanece aproximadamente paralelo a una distancia igual al doble de la longitud de onda dividida por el semiángulo al cuadrado. Idealmente, todo el volumen celular permanece enfocado19. Por ejemplo, a 300 keV, la longitud de onda del deBroglie del electrón es de 0,002 nm, por lo que una convergencia de 1 mrad produce una resolución de 2 nm y una profundidad de campo de 4 micras. En estas condiciones, la tomografía se puede realizar incluso sin enfocar durante el proceso de recolección de datos, pero solo una vez al comienzo de la adquisición. Una STEM convencional con capacidad de tomografía puede alcanzar un ángulo de semiconvergencia de 7 u 8 mrad; Por lo tanto, en principio, podríamos alcanzar una resolución del orden de 0,25 nm, pero luego con una profundidad focal de solo 62 nm. Esto es claramente demasiado delgado para las imágenes celulares. Los microscopios más avanzados con tres lentes de condensador ofrecen un ajuste continuo del ángulo de semiconvergencia en un rango considerable. Con la configuración más tradicional de dos condensadores, la convergencia se fija discretamente por la apertura del condensador (C2).
Para muestras robustas incrustadas en plástico, se puede grabar una serie focal en cada inclinación y combinarlas para obtener una alta resolución20, pero para muestras criogénicas, el presupuesto de radiación está demasiado limitado. Finalmente, al sopesar las ventajas de las imágenes BF o DF, para muestras gruesas, se deben considerar los efectos de la dispersión elástica múltiple en la muestra. La señal BF está menos corrompida por dispersión múltiple y muestra una resolución más alta para especímenes gruesos16,21.
Una regla general útil ha sido establecer ángulos de colección varias veces mayores que la convergencia. Cuanto más grueso sea el espécimen, más grande debe ser el disco de recolección. Un disco demasiado pequeño proporcionará una intensidad de señal baja; Un disco demasiado grande dará como resultado un contraste de imagen deficiente, ya que solo la dispersión de ángulo más alto contribuirá. Los ángulos de recolección deben optimizarse para una muestra determinada. Los ángulos del detector en función de la longitud de la cámara (difracción) deben calibrarse de forma independiente. Pueden ser mostrados convenientemente por el software del microscopio. En la práctica, un factor de dos a cinco en la relación de semiángulos de recolección a iluminación, θ a α, respectivamente (Figura 1), es un punto de partida recomendado para CSTET de muestras celulares.
El siguiente protocolo describe la operación de tomografía STEM utilizando el popular software SerialEM para el control del microscopio22,23. SerialEM no está vinculado a un fabricante específico, y es ampliamente utilizado en la tomografía TEM. La mayoría de las operaciones de configuración para la tomografía se pueden transferir directamente desde TEM. La estrategia de SerialEM es modelar el sistema de escaneo como una cámara. Esto permite el cruce simple de TEM a STEM. Sin embargo, hay que tener en cuenta que parámetros como la ampliación y la agrupación son completamente artificiales. Los parámetros importantes son el campo de visión en micras, el número de píxeles en el campo de visión y el tiempo de exposición. El espaciado de píxeles, o muestreo, es el campo lineal dividido por el número de píxeles, mientras que el tiempo de permanencia es el número de píxeles dividido por el tiempo de exposición.
La configuración mínima para STEM y CSTET implica tres características en el microscopio: un generador de escaneo, un detector STEM y un software de control de tomografía. El protocolo se refiere a la nomenclatura de FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), pero los conceptos son genéricos. El software propietario de TFS ha sido descrito en JoVE para TEM24, y el funcionamiento STEM es muy similar.
Suponemos que el microscopio ha sido alineado de antemano por el equipo de servicio o el personal experimentado y que se puede llamar a una alineación de columna cargando un archivo. Los ajustes menores se denominan alineaciones directas y se pueden almacenar en los llamados registros FEG (microscopios TFS). Las alineaciones directas incluyen centro de rotación, puntos de pivote, alineación de difracción y compensación para el astigmatismo del condensador. Los ajustes deben realizarse de forma iterativa. Tenga en cuenta que los microscopios TFS implementan distintos modos de nanosonda (nP) y microsonda (μP); para una apertura de condensador dada, estos proporcionan un campo de visión relativamente estrecho o amplio con iluminación paralela en TEM y un haz de electrones más o menos convergente (estrechamente enfocado) en STEM, respectivamente. Otros fabricantes utilizan diferentes esquemas para cubrir el rango de ángulos de convergencia.
Antes de comenzar, se debe elegir el campo de visión, L, y el muestreo (ancho de píxeles), l, dependiendo de la muestra en estudio. Por ejemplo, para l = 1 nm/píxel, se debe elegir una imagen de 4.000 x 4.000 píxeles que cubra un campo de visión de 4μm2 . La resolución será, en el mejor de los casos, el doble del muestreo espacial, por lo que 2 nm, y el diámetro de la sonda, d, deberían coincidir con eso. La calibración del ángulo de la sonda está más allá del alcance de este protocolo, por lo que asumimos que hay una tabla o una lectura de pantalla disponible. El diámetro de la sonda es aproximadamente la longitud de onda del electrón dividida por el ángulo de semiconvergencia (en radianes): d = λ/θ. La longitud de onda, λ, es 0.002 nm para 300 keV y 0.0025 nm para electrones de 200 keV, por lo que θ de 1 mrad proporcionará un diámetro de punto de 2 o 2.5 nm, respectivamente.
El protocolo se presenta en una progresión de complejidad creciente. La primera tarea es producir una imagen STEM, que depende del software del fabricante del microscopio, y luego una serie de inclinación, para lo cual usamos SerialEM. Muchos lectores sin duda estarán familiarizados con SerialEM, por lo que las tareas más complicadas vendrán naturalmente. No hay necesidad de seguir los procedimientos estrictamente. Los desarrollos relacionados con la automatización pueden implementarse directamente tanto para STEM como para TEM. Los usuarios experimentados probablemente invertirán el protocolo, comenzando con el registro correlativo de mapas de fluorescencia y continuando configurando la tomografía por lotes. Se pueden encontrar más detalles en la extensa documentación y bibliotecas de tutoriales para SerialEM, incluido un artículo reciente de JoVE sobre los últimos desarrollos en automatización25.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; SerialEM</td><td>Universidad de Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEM es una plataforma de software libre para el control de microscopios y la adquisición de datos.</td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td>electrónico de transmisión con capacidad STEM</td><td>El protocolo se escribió sobre la base de la experiencia con varios microscopios de Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica y Tecnai T20-F. En principio, también debería ser aplicable a otros fabricantes.</td></tr></tbody></table>

visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-stem

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas u orgánicas incrustadas en su medio acuoso nativo; El agua se solidifica en un vaso (es decir, vitrificado) sin cristalización. El método crio-EM es ampliamente utilizado para determinar la estructura de macromoléculas biológicas recientemente a una resolución casi atómica. El enfoque se ha extendido al estudio de orgánulos y células mediante tomografía, pero el modo convencional de imágenes EM de transmisión de campo amplio sufre una limitación severa en el grosor de la muestra. Esto ha llevado a la práctica de fresar laminillas delgadas utilizando un haz de iones enfocado; La alta resolución se obtiene mediante el promedio de subtomografía de las reconstrucciones, pero se pierden las relaciones tridimensionales fuera de la capa restante. La limitación de espesor se puede eludir mediante imágenes de sonda escaneada, similar al EM de escaneo o al microscopio de escaneo láser confocal. Mientras que la microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) en la ciencia de los materiales proporciona resolución atómica en imágenes individuales, la sensibilidad de las muestras biológicas criogénicas a la irradiación de electrones requiere consideraciones especiales. Este protocolo presenta una configuración para la criotomografía utilizando STEM. La configuración tópica básica del microscopio se describe para sistemas de dos y tres condensadores, mientras que la automatización es proporcionada por el software no comercial SerialEM. También se describen las mejoras para la adquisición de lotes y la alineación correlativa con mapas de fluorescencia adquiridos previamente. Como ejemplo, mostramos la reconstrucción de una mitocondria, señalando la membrana interna y externa y los gránulos de fosfato de calcio, así como los microtúbulos circundantes, filamentos de actina y ribosomas. La tomografía crio-STEM sobresale en revelar el teatro de orgánulos en el citoplasma y, en algunos casos, incluso la periferia nuclear de las células adherentes en cultivo.

Un montaje de cuadrícula completo preparado en STEM muestra las áreas con celdas de interés (Figura 4). Tenga en cuenta que la imagen está en campo oscuro, por lo que los agujeros vacíos aparecen oscuros. Las células aparecen parcialmente brillantes, donde los electrones se dispersan hacia el detector HAADF. En las partes más gruesas, típicamente los centros o cerca de las barras de cuadrícula, el contraste vuelve a oscurecerse. Esto se debe a la dispersión múltiple, por la cual los electrones alcanzan ángulos no capturados por el detector. En la práctica, estas áreas serán demasiado gruesas para la tomografía.
La siguiente etapa involucra mapas de aumento intermedio (Figura 10). Estos a menudo se llaman mapas de montaje medio, o mapas cuadrados, que se refieren a los cuadrados de cuadrícula en lugar de la forma. Incluso en el modo STEM de microsonda más bajo, también se adquirirán como imágenes de montaje. Al hacer clic en el elemento en la ventana Navegador, se carga la imagen del mapa en la ventana principal. Dentro de esta área se eligen puntos específicos para la adquisición de tomogramas. Utilice el modo Vista previa para localizar el área en el aumento de la grabación. Tenga en cuenta que puede haber un cambio lateral entre Vista previa y Grabar, dependiendo de las velocidades de escaneo. Una sola serie de inclinación se puede registrar aquí. Las mitocondrias, por ejemplo, a menudo se pueden identificar en la imagen Vista previa y Grabación (Figura 12).
Para la tomografía discontinua, la etapa viajará alrededor de la cuadrícula y es posible que no regrese exactamente a la misma ubicación. Los mapas de anclaje se utilizan para garantizar que las áreas de grabación deseadas se vuelvan a identificar de forma fiable haciendo coincidir la imagen de vista previa con una vista de menor aumento, incluso si el movimiento del escenario se ha desplazado. PyEM23,24 ofrece una alternativa más rápida que sin duda se recomienda, pero aún no forma parte de la instalación estándar.
En el enfoque CLEM, se puede utilizar un mapa de fluorescencia para identificar las áreas de interés para la tomografía. La fluorescencia se adquiere externamente y debe registrarse en el montaje de la cuadrícula completa. Es útil tener visibles las barras de cuadrícula y los orificios, por lo que se puede preparar un compuesto combinado de fluorescencia + campo brillante antes de la importación, por ejemplo, en el software GIMP (https://www.gimp.org) o ImageJ31 (tenga cuidado de que ImageJ invierta el eje vertical). Cuando el rango dinámico de la fluorescencia es grande, puede ser difícil crear tal fusión sin saturación. En este caso, los dos mapas pueden importarse por separado y luego registrarse juntos como se describe (Figura 13). De esta manera, un punto en el mapa de fluorescencia en la ventana del navegador, seguido de "Go To XY", lleva el escenario a la posición correspondiente en la cuadrícula montada en el TEM. Tenga cuidado de que pequeñas inconsistencias en la creación del montaje (o el mapa de fluorescencia, si también es un montaje) conducirán a pequeños desplazamientos; Por lo tanto, para una precisión óptima, la fluorescencia debe volver a registrarse específicamente en el mapa cuadrado. A menudo es suficiente hacer este registro a ojo, sobre la base de agujeros en la película de soporte o características compartidas con la imagen de luz de campo brillante.
La reconstrucción de la serie de inclinación da como resultado un volumen 3D (Figura 14). Este ejemplo tiene un tamaño de píxel de 2,042 nm, lo que da como resultado un campo de visión de ~4 μm. Los depósitos de fosfato de calcio (puntas de flecha naranjas) se destacan, debido al mayor número atómico en comparación con el entorno. Los microtúbulos (puntas de flecha rojas) se pueden rastrear en todo el campo de visión. Además, las membranas mitocondriales internas y externas (puntas de flecha verdes) se pueden ver claramente. La actina se puede observar como haces o como filamentos individuales. Para lograr una resolución más isotrópica, la reconstrucción puede ser procesada por deconvolución.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> Figura 1: Comparación de TEM versus STEM. En TEM, el campo de visión está iluminado por un haz casi paralelo, y la lente del objetivo forma una imagen ampliada en la cámara. Para cryo-TEM, la apertura del objetivo se abre para pasar las ondas de electrones dispersos (línea roja discontinua), que, con el desenfoque, producen contraste de fase por interferencia con las ondas no dispersas (verdes). STEM, por otro lado, rasteriza un haz enfocado a través del espécimen y recoge los electrones dispersos de una manera píxel por píxel. Múltiples detectores pueden recoger electrones dispersos en diferentes ángulos. Esta cifra se ha modificado de30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de distorsión de imagen en el lado izquierdo debido a la alta velocidad de escaneo. Tenga en cuenta la distorsión marcada por puntas de flecha amarillas, así como los agujeros distorsionados de forma ovalada en el Quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> Figura 3: Diálogo de configuración de montaje para todo el montaje de la cuadrícula. Elija el aumento y el número de piezas en X e Y para que el área total alcance alrededor de 2.000 μm para obtener un mapa para la mayor parte de la cuadrícula. Elija también Mover etapa en lugar de cambiar imagen y Usar asignación de montaje, no Parámetros de grabación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> Figura 4: GridMap completo de bajo aumento registrado en modo STEM. Las áreas rotas aparecen completamente negras en la imagen de campo oscuro. Las áreas grises oscuras son probablemente demasiado gruesas y mal vitrificadas. Las buenas áreas candidatas para la tomografía son blancas o gris claro en esta exploración. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> Figura 5: Cambio al proceso de marcadores. Un objeto reconocible está marcado en el mapa de baja resolución por Agregar puntos (38 en esta imagen). Tenga en cuenta el cambio entre el mapa de baja resolución (círculo verde) y el mapa de resolución media (círculo naranja). A continuación, el objeto se marca con el marcador (cruz verde, círculo rojo) y se inicia el cuadro de diálogo Cambiar a marcador. La opción elegida mueve todos los mapas a 245x en la misma cantidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> Figura 6: Diálogo de configuración de la serie de inclinación para una serie de inclinación STEM. El esquema dosis-simétrico se utiliza de -60° a +60° en pasos de 2°. El enfoque automático se omite debido a la alta profundidad de enfoque cuando se utiliza un ángulo de convergencia bajo. No hay necesidad de refinar la eucentricidad como se ha hecho antes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> Figura 7: Diálogo de propiedades de archivo para mapas de resolución media. Guarde como un archivo de pila MRC, elija enteros y guarde información adicional en un archivo de metadatos .mdoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> Figura 8: Diálogo de configuración de montaje para guardar mapas de resolución media. Para un cuadrado en una cuadrícula de malla 200, que tiene 90 μm de ancho, se recomienda un área total de al menos 90 μm x 90 μm. Elija Mover etapa en lugar de cambiar la imagen y Usar parámetros de vista en el modo de dosis baja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> Figura 9: Grabación del mapa de resolución media. Adquirir en Elementos diálogo para grabar mapas de resolución media. Elija Mapping, Adquirir y guardar imagen o montaje, y marque Crear mapa de Navigator. En Tareas antes o después de la Primaria, elija Eucentricidad áspera y fina. Si no recibe ayuda, elija opcionalmente el cuadro Sin mensaje cuando se produzca un error y Cerrar válvulas de columna al final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> Figura 10: Imagen del mapa de resolución media. Mapa de resolución media (Square Map) grabado en modo STEM mediante un montaje de 3 x 3. Los dos mapas de anclaje de resolución media para la recopilación de datos se indican con los cuadrados azules. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> Figura 11: Datos de la serie de inclinación por lotes. Adquirir en Elementos del cuadro de diálogo para recoger series de inclinación de lotes. Para la recopilación de datos de la serie de inclinación, elija Datos finales y Adquirir serie de inclinación. En Tareas antes o después de Primaria, marque Administrar Dewars/Vacuum (elija la configuración adecuada en el menú Configuración), Realinear con elemento, Perfeccionar eucentricidad y Ejecutar script antes de la acción. En las opciones generales, marque la casilla Sin mensaje cuando se produzca un error y Cerrar válvulas de columna al final (consulte 5.14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> Figura 12: Inclinación de 0° de una serie de inclinación STEM de una mitocondria. Las puntas de flecha naranjas apuntan a depósitos de fosfato de calcio (gránulos de matriz), puntas de flecha verdes a crestas y puntas de flecha rojas a marcadores fiduciarios de oro de 15 nm. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> Figura 13: Mapas crio-CLEM registrados. (A) El mapa STEM de resolución media (mapa cuadrado, 26-A) está registrado en el (B) mapa STEM de baja resolución, (C) mapa cryo-FM del canal BF y (D) mapa cryo-FM del canal GFP. Los nueve puntos de registro (etiquetas 4-21) se muestran en el (E) Navegador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> Figura 14: Renderizado de volumen. Representación volumétrica de (A) 60 nm y una (B) sección de 40 nm de espesor a través de un tomograma filtrado similar a SIRT (30 ciclos) a diferentes profundidades. El tamaño del píxel es de 2.048 nm, lo que resulta en un campo de visión de aproximadamente 4 μm. Tenga en cuenta la densidad invertida en comparación con la Figura 12, lo que significa que las características de alta intensidad son brillantes. Las puntas de flecha naranja, blanca, roja, verde y azul claro apuntan a depósitos de fosfato de calcio, ribosomas, microtúbulos, la membrana mitocondrial interna y externa y filamentos de actina, respectivamente. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La tomografía crio-STEM proporciona un medio para visualizar orgánulos de células intactas sin incrustación, seccionamiento u otras preparaciones invasivas. La resolución 3D obtenida se encuentra actualmente en el rango de unos pocos nanómetros, con un campo de visión de varios micrómetros y un espesor accesible del orden de 1 μm.

Visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-STEM

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

La tomografía TEM se usa ampliamente para obtener imágenes de células, pero es muy limitada en términos de grosor de la muestra. FIB SEM y la tomografía de rayos X blandos se pueden usar para muestras más grandes, aunque a menor resolución. La tomografía STEM llena este vacío perfectamente.La tomografía STEM proporciona una mirada a muestras de micrones de espesor a una resolución de unos pocos nanómetros. La combinación con la preparación criogénica nos permite ver muestras biológicas y secciones en 3D. Revise los conceptos básicos de la óptica STEM para comprender la formación de imágenes y asegurarse de que el ingeniero de servicio haya alineado bien los modos de vástago y vástago Lomax, y que los pasos de calibración se vean como los del video.Para comenzar, cargue el archivo de alineación de columnas y abra los valores de columna. Si utiliza un soporte criogénico de entrada lateral, abra el protector criogénico y comience en el modo TEM. El haz debe aparecer en la pantalla.Baje el aumento si el haz no aparece. Lleve el microscopio al foco eucéntrico presionando el botón en el panel de control. Ajuste el tamaño del punto a un valor conveniente para visualizar la pantalla fluorescente directamente o con la cámara incorporada.Ajuste el microscopio al modo STEM y verifique que el enfoque utilice las lentes del condensador en lugar del objetivo. En el panel, establezca el enfoque eucéntrico y salga del modo de difracción para los ajustes iniciales. Asegúrese de que el haz no esté en blanco y reduzca el aumento hasta que aparezca el haz en la pantalla.Ajuste el desplazamiento del haz hacia el centro y aumente el aumento en pasos hasta 70, 000, manteniendo el haz en el centro. Luego inserte la apertura deseada del condensador, generalmente 50 micrómetros para el modo de microsonda, y verifique el centrado de la apertura. Al girar la perilla de enfoque hacia adelante y hacia atrás, el punto debe expandirse y contraerse, pero permanecer en su lugar, como si un avión cortara un reloj de arena vertical imaginario.Si la apertura no está centrada, la iluminación se desplazará lateralmente como si el reloj de arena estuviera inclinado. Enfoca el haz, presiona el enfoque de la lista de intensidad en la pestaña de alineaciones o vuelve al enfoque eucéntrico. Reajuste la posición del haz hacia el centro y ajuste el centro de rotación.Ahora, gire la rueda de enfoque al mínimo, o un paso por encima, para que el haz pulse suavemente y asegúrese de que permanezca estacionario a medida que el enfoque se mueve hacia arriba y hacia abajo. Seleccione los puntos de pivote y junte los dos puntos con los ajustes X e Y. Ajuste los estigmas del condensador para que el haz sea redondo.Sube y baja a través del enfoque para optimizar. No debe haber tendencia a alargarse en una dirección u otra al pasar a través del foco. Normalice las lentes, luego aumente el aumento progresivamente a aproximadamente 240, 000, mientras usa el desplazamiento del haz para mantener el punto centrado y repita los ajustes del centro de rotación y el punto de pivote.Volver al modo de difracción. En esta etapa, el haz debe aparecer como un disco uniforme en la pantalla fluorescente. La longitud de la cámara ahora controla efectivamente la distancia óptica al detector como una cristalografía de rayos X.Cámbielo y observe cómo el disco se contrae y se agranda como si la ubicación de la pantalla se moviera hacia o lejos de la muestra. Este cono representa la iluminación de campo claro. Para activar el modo STEM con un gran aumento, comience con el detector de vástago de campo claro y ajuste la alineación de difracción para centrar el haz utilizando la longitud de cámara deseada.Active la marca de campo claro en la pantalla, reduzca la longitud de la cámara a 330, levante la pantalla e inserte los detectores. Inicie un escaneo en el software del microscopio. Utilice la pantalla del osciloscopio para ayudar a ajustar los ajustes de brillo y contraste como se describe en el manuscrito.Iterar el ajuste varias veces. Devuelva el microscopio a un aumento relativamente bajo en el registro de aumento alto, sin entrar en modo de aumento bajo. Inserte la pantalla fluorescente y anote la corriente de la pantalla como referencia.Al igual que en TEM, la corriente se puede cambiar con la lente de la pistola y los ajustes de tamaño de punto con números crecientes correspondientes a una corriente reducida. En este punto, guarde un registro FEG para facilitar el retorno a los valores estándar. Vaya al modo LMTEM para ver la muestra.Inserte la muestra. Llevar la muestra a la altura eucéntrica. Hay varios métodos para hacer esto.Por ejemplo, utilice el tambaleante de escenario para inclinar la cuadrícula mientras mueve la altura de la muestra a lo largo del eje Z hasta que la imagen deje de desplazarse lateralmente. Alternativamente, marque algunas características en la pantalla de visualización e incline el escenario de 10 a 30 grados. La función se moverá lateralmente.Ajuste la altura de la muestra para devolverla a su posición original. Aumente la ampliación o la inclinación de la etapa para refinar y devolver la inclinación a cero grados. Ahora vuelva al modo STEM e inserte el detector STEM.Asegúrese de que la opción Activar análisis LM no esté marcada. Vaya al modo de aumento alto más bajo. Ajuste el astigmatismo del condensador por el método.Con el haz sobre un área de muestra delgada, concéntrese en el punto donde el haz transmitido explota entre las imágenes de sombra de la muestra a cada lado. Luego ajuste la sintonización del condensador para hacer que el disco central sea redondo. Esto requiere algo de práctica, especialmente para muestras criogénicas.Vuelva a la apertura de 50 micrómetros y actualice el registro FEG. Vaya al modo LMSTEM y continúe escaneando para encontrar un área interesante. Si es necesario, reajuste la configuración de brillo y contraste del detector aproximadamente en este punto.Presione el enfoque eucéntrico, aumente el aumento y refine el enfoque mientras escanea usando el bucle de enfoque proporcionado por el microscopio y verifique el astigmatismo en las cuentas de oro. Hasta ahora, todo se realiza en modo nano sonda. Tenga en cuenta que la inserción de una abertura de condensador más pequeña disminuye el ángulo de semiconvergencia, lo que es útil para muestras gruesas.Un enfoque alternativo con los instrumentos TFS es cambiar al modo de microsonda, lo que conduce a un ángulo de semiconvergencia reducido. Luego, ajuste la longitud de la cámara para que el ángulo de recolección sea tres veces mayor que el ángulo de convergencia; es decir, las marcas del área del detector BF en la pantalla son aproximadamente tres veces más grandes que el haz.Estimar la dosis para registrar usando una ecuación. Como regla general, apunte de 100 a 150 electrones por tinta cuadrada para todo el tomógrafo. Devuelva el escenario a un todo y ajuste la corriente del haz utilizando el tamaño del punto o la configuración de la lente de la pistola para alcanzar la corriente de pantalla deseada.El mapa completo de cuadrícula de bajo aumento registrado en modo STEM muestra las áreas con celdas de interés. Las células aparecen parcialmente brillantes con electrones dispersos hacia el detector HAADF. El mapa de resolución media grabado en modo STEM mostraba dos mapas de anclaje de resolución media.La inclinación de cero grados de una serie de inclinación del tallo permitió la visualización de los depósitos de fosfato de calcio, crestas y marcadores fiduciales de oro de una mitocondria. Se muestra una representación volumétrica de secciones de 60 nanómetros y 40 nanómetros de espesor. La tomografía criovástago, o CSTET, proporciona un puente entre la biología estructural y la biología celular, así como un contexto para la fluorescencia de súper resolución.Sin la necesidad de seccionamiento o preparación de láminas, podemos ver todo el teatro celular en un estado casi nativo.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

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