Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

La epidemiología basada en las aguas residuales se utiliza actualmente para complementar las estrategias de control de la COVID-19 en todo el mundo mediante la detección de ARN viral en muestras de aguas residuales y la identificación de posibles brotes. Esta técnica proporciona una instantánea de toda la población de la prevalencia de COVID-19 en nuestra comunidad, que incluye casos asintomáticos. El muestreo de aire también es una adición importante a este protocolo.

El diagnóstico clínico sigue siendo la forma más precisa de gestionar los brotes de enfermedades y las pandemias. Sin embargo, esta técnica sigue siendo útil como complemento de la misma. Este método tiene muchos pasos y puntos críticos.

Una demostración visual es esencial, ya que permitirá a los laboratorios que no están tan familiarizados con la biología molecular replicar el procedimiento. Para comenzar, recoja un litro de una muestra compuesta de aguas residuales de 24 horas. Coloque 20 microlitros de mengovirus en 70 mililitros de la muestra.

Después de centrifugar la muestra a 700 g durante 10 minutos, concentrar el sobrenadante resultante utilizando un dispositivo de ultrafiltración centrífuga con un corte de 10 kilodaltons por centrifugación. Eluir el concentrado centrifugando a 700 G durante 40 minutos e invirtiendo la posición del dispositivo de ultrafiltración. Utilice el concentrado resultante para la extracción de ARN.

Para recolectar las muestras de aire, coloque un cono estéril en el muestreador de aire antes de comenzar la recolección. Una vez finalizado el muestreo, extraiga el ARN del PBS lavado del cono utilizando un kit comercial de extracción de ARN viral o un método interno. Prepare la mezcla maestra de reacción para cada objetivo, mengovirus, SARS-CoV-2, genes N1 y N2 en una campana limpia en la sala de preparación de reactivos.

Mezcle la mezcla de cebadores y sonda y la enzima invirtiendo cinco veces o pulsando el vórtice. Manteniendo los tubos de microcentrífuga en una rejilla fría, dispense 15 microlitros de la mezcla en tubos de PCR en tiras o en una placa de PCR de 96 pocillos colocada en una rejilla de enfriamiento. Cubra la placa y muévala al área de manipulación de ácidos nucleicos.

Agite suavemente una alícuota del ARN extraído durante cinco segundos. Pipetear cinco microlitros del ARN a la mezcla de reacción para hacer 25 microlitros e iniciar la RT-qPCR. En una placa de PCR, pipetee 16 microlitros de cada muestra a su posición en la placa y agregue cuatro microlitros de transcripción inversa cinco veces o mezcla maestra RT.

A continuación, inicie la reacción de PCR. A continuación, prepare 10 diluciones micromolares de cada juego de cebadores y la mezcla maestra para cada juego de cebadores. En una nueva placa de PCR, pipetee 20 microlitros de la mezcla maestra y, a continuación, cinco microlitros de la muestra RT a cada mezcla.

Después de cubrir la placa, inicie la reacción de PCR. Una vez finalizada la PCR, gire la placa a 1000 G durante 15 a 30 segundos. Para la purificación por PCR, agregue 50 microlitros de reactivo a base de perlas a cada pocillo y mezcle por pipeteo para proceder a la separación magnética.

Retire la placa del soporte magnético. Resuspenda cada gránulo con 15 microlitros de agua de grado PCR e incube la placa a temperatura ambiente durante dos minutos. Vuelva a colocar la placa en el soporte magnético y deje que las perlas se granulen durante dos minutos.

A continuación, pipetee cuidadosamente 15 microlitros del sobrenadante de cada muestra en una nueva placa de PCR. A continuación, para la preparación de la biblioteca, agregue 1,75 microlitros de tampón de reacción del kit de preparación de la biblioteca de ADN y 0,75 microlitros de mezcla de enzimas a cada muestra. Agite brevemente la placa cubierta y gire hacia abajo a 1000 G durante 15 a 30 segundos.

Incubar durante cinco minutos a 21 grados centígrados y cinco minutos a 65 grados centígrados. Pipetear tres microlitros de agua de grado PCR para cada muestra en una nueva placa de PCR. Agregue 0,75 microlitros de las muestras preparadas y 1,25 microlitros de códigos de barras para la preparación de la biblioteca de secuenciación.

A continuación, agregue cinco microlitros de mezcla maestra de ADN ligasa T4 y mezcle bien pipeteando. Después de girar la placa en la centrífuga, incube la placa a 21 grados centígrados durante 20 minutos y a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Después de agrupar todas las muestras, agregue 192 microlitros de reactivo a base de perlas al grupo para la purificación por PCR.

Mezclar bien pipeteando e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Coloque el tubo en un soporte magnético. Espere a que el sobrenadante se aclare y se forme una bolita de cuentas.

Retire el sobrenadante y el tubo del soporte magnético. Añadir 700 microlitros del tampón de fragmentos cortos o SFB y mezclar mediante pipeteo. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético y espere a que se forme el gránulo y se elimine el líquido.

Deseche el sobrenadante con una pipeta. Agregue 35 microlitros de agua de grado PCR al tubo, mezcle por pipeteo e incube a temperatura ambiente durante dos minutos. Coloque el tubo en el soporte magnético y deje que las perlas se granulen y el líquido se aclare.

Pipetear 35 microlitros del sobrenadante en un tubo nuevo. A continuación, prepare la mezcla de reacción de ligadura del adaptador como se describe en el manuscrito del texto e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mezcle 20 microlitros del reactivo a base de perlas con la mezcla de reacción de ligadura para la purificación por PCR e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Coloque el tubo en el soporte magnético y espere a que se forme la bolita de cuentas y el sobrenadante se vuelva incoloro. Deseche con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo. Mezcle 125 microlitros de SFB en el tubo y vuelva a colocarlo en el soporte magnético para separar las perlas.

Cuando el líquido se vuelva claro, deseche el sobrenadante y repita la adición de SFB como se demostró anteriormente. Deje abierto el tubo en el soporte magnético durante 30 segundos. Añadir 15 microlitros del tampón de elución y mezclar bien pipeteando.

Después de un breve centrifugado e incubación a temperatura ambiente durante cinco minutos, colóquelo en el soporte magnético durante dos minutos. Pipetear 15 microlitros del sobrenadante en un nuevo tubo de baja unión para medir la concentración con un kit de cuantificación fluorométrica de ADN. A continuación, inserte la celda de flujo en el dispositivo de secuenciación de ADN y ARN en tiempo real.

Inserte la punta de una pipeta de 1.000 microlitros ajustada a 200 microlitros en el puerto de cebado. Gire la rueda de ajuste de volumen para aumentar el volumen hasta ver el líquido en la punta y luego deseche la punta. Agregue 800 microlitros de la mezcla de cebado al puerto de cebado sin burbujas y espere cinco minutos.

Pipetee 200 microlitros de la mezcla de la biblioteca en el puerto de cebado. Cierre el puerto de la cubierta y el puerto de cebado. Inicie el experimento de secuenciación en el software y seleccione Base Calling On.Este método detectó y cuantificó el ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire.

Las muestras de aguas residuales tuvieron una desviación estándar de 1,91% a 13,98% entre los triplicados, y variaron de 3,05 veces 10 a tres a 2,83 veces 10 a las ocho copias de genes por litro. Las muestras de aire variaron de 6,17 por 10 a tres a 5,48 por 10 a nueve, con la desviación estándar en los duplicados entre 0,54% y 10,95%Como se describe en este protocolo, las muestras fueron secuenciadas, y aquí se resume un ejemplo de los resultados de tres muestras secuenciadas. En las tres muestras, el linaje BA.5.

x fue asignado como el más prevalente por la herramienta de Freyja. La concentración de muestras de aguas residuales es un paso crucial, ya que el ARN viral está presente en bajas concentraciones en las aguas residuales. Por lo tanto, este paso es fundamental para una detección y cuantificación precisas.

Este procedimiento se puede adaptar mediante el uso de diferentes cebadores en el protocolo RT-qPCR para ser utilizado en la detección y cuantificación de otros agentes infecciosos. La técnica cuantificó con precisión el SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire. Se pueden detectar y cuantificar diferentes patógenos en diferentes ubicaciones.