Name: Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a determinar la autocompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía de fluorescencia y análisis de genotipo S. Este método permite identificar 21 haplotipos S en Citrus maxima para optimizar programas de mejoramiento genético y selección de polinizadores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este proyecto fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32122075, 32072523).

1. Preparación para la tinción de azul de anilina
<ol><li>Prepare los siguientes reactivos y herramientas para el experimento: un pincel polinizador, pinzas, un lápiz, papel sulfato, una bolsa de polinización, bolsas con cierre hermético, clips, formaldehído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinzas, goteros de pegamento, portaobjetos, cubreobjetos, bisturís y polietilenglicol.</li>
	<li>Preparar un medio de germinación in vitro que contenga 0,02% de MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% de Ca(NO 3)2, 0,01% deH3 BO 3, 20% de PEG-4000 y 15% de sacarosa. Ajuste el pH a 6.0-6.2 con KOH. Use un agitador magnético ya que PEG-4,000 es difícil de disolver.</li>
	<li>Prepare la solución fijadora de Carnoy, que es etanol absoluto y ácido acético glacial mezclados en una proporción de 3: 1. Prepare la solución de fijación FAA, que es 40% de formaldehído, 80% de etanol y ácido acético glacial (1: 8: 1). Prepare 4 M de hidróxido de sodio (NaOH) y solución de azul de anilina, que es 0.1% de azul de anilina en 0.1 M K3PO4. Use una botella de color ámbar para almacenar la solución azul de anilina porque es sensible a la luz.</li>
</ol>2. Recolección de polen
<ol><li>Conozca el período de floración de los árboles experimentales (Ma jia pummelo en este estudio) de antemano. Recoja flores maduras sin abrir desde el comienzo del período de floración hasta la etapa máxima de floración, y colóquelas en una bolsa con cierre hermético. Las flores se pueden conservar a 4 °C en la nevera durante 24 h.</li>
	<li>Lleve las flores al laboratorio. Use pinzas para recoger las anteras y colóquelas en una placa de Petri que contenga papel de filtro. Recolecta anteras de 20 a 30 flores.</li>
	<li>Colocar la placa de Petri que contiene las anteras en un horno a 28 °C durante 24 h hasta que los granos de polen se sequen. Para la organización detallada de las flores, véase Hu et al.9.</li>
	<li>Coloque el polen seco en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Guarde el polen en una bolsa hermética con cierre hermético que contenga gel de sílice que cambia de color (desecante). Cierre la bolsa y etiquétela con el nombre de la variedad de polen y la fecha de almacenamiento. El polen seco se puede almacenar en un refrigerador de -20 °C durante 96 semanas16.</li>
</ol>3. Prueba de germinación de polen in vitro 
<ol><li>Vierta 300 μL de medio líquido en una placa de cultivo celular o en la tapa de un tubo de centrífuga de 2 ml, y espolvoree el polen uniformemente con la ayuda de un cepillo de polinización. Incubar el polen a 28 °C en un ambiente oscuro humidificado durante 12 h.</li>
	<li>Retire la parte superior de 1 mm de la punta de una pipeta de 1.000 μL. Use la pipeta para absorber el polen con una pequeña cantidad de solución de cultivo y muévala al centro del portaobjetos del microscopio. Cúbralo con un cubreobjetos. Observe la muestra con un microscopio invertido utilizando un objetivo 10x.</li>
	<li>Realizar tres réplicas independientes utilizando aproximadamente la misma densidad de polen para cada réplica17. Administre visualmente la cantidad de polen, asegurándose de que toda la placa de Petri esté cubierta de polen y que cada placa de Petri tenga una cantidad casi igual de polen.</li>
	<li>El polen germinado produce un tubo polínico con una longitud de aproximadamente el doble de su diámetro. Calcule la tasa de germinación a partir de 20 campos visuales, lo que da el porcentaje de polen germinado en todos los campos de polen.</li>
</ol>4. Polinización
<ol><li>Elija un día soleado sin viento para la polinización. Seleccione 10 cogollos completamente desarrollados a punto de abrirse, retire los pétalos con cuidado y tenga cuidado de no magullarlos.</li>
	<li>Use un cepillo de polinización para esparcir una cantidad suficiente de polen viable sobre la superficie del estigma y tenga cuidado de no dañar el pistilo. Para la autopolinización, use el polen de la misma planta / cultivar. Para la polinización cruzada, use el polen de una planta con un genotipo diferente.</li>
	<li>Cubra las flores polinizadas con una bolsa de papel de sulfato. Use un clip para sellar la bolsa y evitar la polinización por polen genotípicamente distinto.</li>
	<li>Escriba el nombre de la especie y el número y el tiempo de polinización en la etiqueta. Cuelgue la etiqueta en las ramas cerca de las flores polinizadas.</li>
</ol>5. Muestreo, fijación y conservación
<ol><li>Retire las bolsas de polinización aproximadamente 3-4 días después de la polinización y recoja las flores polinizadas en bolsas con cierre hermético.</li>
	<li>Retire inmediatamente los pétalos, receptáculos y ovarios de las flores, y sumerja los estigmas fusionados a los estilos en un tubo de centrífuga que contenga una solución fijadora recién preparada. Incubar los estigmas y estilos en la solución fijadora durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, deseche la solución fijadora y lave los estigmas y estilos dos o tres veces en etanol al 95%.</li>
	<li>Transfiera los estilos a una solución de etanol al 70%. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en la solución. Los estilos en esta etapa se pueden almacenar a 4 °C durante 1-2 meses.</li>
</ol>6. Tinción de azul de anilina
<ol><li>Lave las muestras de estilo almacenadas en etanol al 70% con agua destilada de tres a cuatro veces. Sumergir en una solución de NaOH 4 M, sellar e incubar en un baño maría a 65 °C durante 60 min. Durante este paso, el color del estilo cambia de amarillo-blanco a naranja-rojo.</li>
	<li>Remojar los estilos en agua destilada durante 30 min. Deseche el agua destilada y lave los estilos con agua destilada tres o cuatro veces o hasta que el color del estilo se vuelva amarillo.</li>
	<li>Coloque la muestra en un tubo de 10 ml, agregue el azul de anilina hasta que la muestra se haya sumergido y teñir durante 12 h en la oscuridad.</li>
	<li>Observe el crecimiento del tubo polínico con un microscopio de fluorescencia.</li>
</ol>7. Microscopía de fluorescencia
<ol><li>Antes de observar las muestras, coloque la diapositiva sobre una mesa plana y agregue de dos a tres gotas de polietilenglicol a la superficie de la diapositiva.</li>
	<li>Lavar el estilo a observar con agua destilada. Use un bisturí para dividirlo en dos mitades a lo largo del eje longitudinal. Coloque la mitad del estilo en el portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos en el escenario del microscopio por encima de la abertura y visualice usando un objetivo de 10x. Utilice el filtro DAPI (excitación: 325-375 nm; emisión: 435-485 nm). Observe cinco estilos para cada tipo de polinización. Observe el crecimiento del tubo polínico.</li>
</ol>8. Identificación del genotipo S basado en PCR
<ol><li>Extraer el ADN genómico de la muestra de estigma utilizando el método CTAB18.<ol><li>Coloque las hojas recolectadas en un tubo de centrífuga de 2 ml y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Preparar HCl:EDTA:NaCl:H2O tampón en una proporción de 1:1:3:5 y una mezcla de alcohol isoamílico cloroformo en una proporción de 24:1</li>
		<li>Añadir 10 ml del tampón preparado, 0,2 g de TALAB y 200 μL de mercaptoetanol a un tubo de centrífuga de 50 ml, y ponerlos en un baño maría a 65 °C durante 5 minutos hasta que la solución se vuelva clara y transparente.</li>
		<li>Coloque las cuchillas en un mortero, agregue las muestras congeladas, agregue nitrógeno líquido y muela. Coloque la muestra molida en un tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 600 μL de mezcla CTAB, póngala en un baño maría a 65 ° C durante 60 minutos y mezcle boca abajo cada 30 minutos.</li>
		<li>Añadir 700 μL de la mezcla de alcohol isoamílico cloroformo (24:1) y mezclar boca abajo durante 10 min. Centrifugar a 24 °C a 12.000 x g durante 10 min, pipetear el sobrenadante y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Añadir 60 μL de solución de NaCl 5 M y 1 ml de etanol absoluto, y mezclar boca abajo. Congelar a -20 °C durante 30 min, y centrifugar a 24 °C y 9.000 x g durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de solución de etanol al 70% y déjelo a temperatura ambiente durante 1-2 h. Centrifugar a 24 °C, 9.000 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante, aspirar el exceso de solución de etanol y secar al aire durante 5 min.</li>
		<li>Agregue 100 μL de agua estéril para disolver, mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro y congélela en un congelador de -4 °C para su almacenamiento a largo plazo.</li>
		<li>Configure el sistema de reacción RT-PCR. Prepare la siguiente mezcla de reacción para 10 μL que contengan 5 μL de PCRMix 2x, 0,25 μL de cebador directo e inverso, 1 μL de ADN (100 ng/μL) y 3,5 μL deH2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure el programa de PCR según la Tabla 1. El programa de PCR para todas las isoformas fue de 95 °C durante 5 min 32x (95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min) y 72 °C durante 5 min. Separe los productos en geles de TAE-agarosa al 1,5% y fotografíe9. Verifique el genotipo S especificado utilizando ADN genómico.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

En los cultivos frutales, tanto la partenocarpia como la IS son rasgos importantes porque allanan el camino para las frutas sin semillas, un rasgo muy apreciado por los consumidores. La autoincompatibilidad promueve el rechazo del autopolen y, por lo tanto, previene la endogamia20. Entre los cítricos, el pummelo es una variedad autoincompatible7. Casi el 40% de todas las especies de angiospermas exhiben SI21. Este rasgo evita el cuajado de la fruta, ...

La autoincompatibilidad (IS) es un mecanismo genéticamente controlado presente en aproximadamente el 40% de las especies de angiospermas. En este proceso, el pistilo rechaza el polen de una planta con el mismo genotipo SI y, por lo tanto, impide la autofertilización 1,2. Ma jia pummelo es una variedad local en la provincia de Jinagsu, China, con las excelentes cualidades de fruta grande y rosada, un rico contenido de jugo, un sabor agridulce y una cáscara gruesa3. Aunque la IS promueve el cruzamiento, afecta negativamente el rendimiento y la calidad de las frutas4 y requiere árboles polinizadores adecuados con genotipos IS distintos para tasas confiables de cuajado de frutos y altos rendimientos. En la actualidad, hay dos tipos principales de SI, la autoincompatibilidad esporofítica (SSI), representada por Brassicaceae, y la autoincompatibilidad gametofítica (GSI), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae y Solanaceae 5,6,7,8.
Los cítricos son uno de los cultivos frutales más importantes del mundo. El sistema GSI basado en S-RNasa se encuentra en muchas accesiones de cítricos e influye negativamente en la tasa de cuajado de frutos9. En este sistema, el SI está controlado por el locus S, un único locus polimórfico con dos alelos complejos que transportan determinantes de pistilo S y determinantes de polen S 7. El determinante femenino es la S ribonucleasa (S-RNasa), y el determinante masculino es el locus S F-box (SLF)7. Las células del pistilo secretan proteínas S-RNasa. Las S-RNasas no propias son reconocidas por las proteínas SLF, lo que conduce a la ubiquitinación y degradación de las S-RNasas no propias por la vía del proteasoma 26S. En contraste, las auto-RNasas S son capaces de acumular e inhibir el crecimiento del tubo polínico (PT) porque evaden las proteínas SLF y, por lo tanto, se les impide la ubiquitinzación10,11,12,13.
Aquí, informamos una técnica in vivo que es útil para identificar genotipos S y grados de compatibilidad e incompatibilidad del polen. El protocolo consiste en extraer ADN total de las hojas y predecir el genotipo S utilizando cebadores específicos de S. Además, la tinción con azul de anilina y la microscopía de fluorescencia seguida de polinización manual proporcionan evidencia del grado de compatibilidad e incompatibilidad. El procedimiento de polinización semi in vivo, que consiste en la polinización manual de flores en el laboratorio14,15, también ha sido adaptado para evaluar los grados de autocompatibilidad e incompatibilidad. Sin embargo, también hemos utilizado la polinización de campo seguida del embolsado de flores para evitar la contaminación del polen no deseado para permitir que los tubos de polen se desarrollen en condiciones naturales. Este protocolo es simple y directo y proporciona la información necesaria para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados.

<table><tbody><tr><td>etanol absoluto</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>azul de anilina</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>botella marrón</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio tetrahidrato, Ca(NO3 )2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrífugo</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0(CAS)</td><td></td></tr><tr><td>Caída</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético, EDTA</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>Pinzas de 10009617</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldehído</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Molino rápido de muestras totalmente automático</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Tissuelyser-96</td><td></td></tr><tr><td>ácido</td> <td>acético glacialSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de molienda</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>etiqueta</td><td>M& G Chenguang Papelería Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Shanghái Leica Co., Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPIO Cubierta de vidrio</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>clips</td><td>M& G Chenguang Papelería Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lápiz</td><td>M& G Chenguang Papelería Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cepillo polinizador</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol, PEG 6000</td><td>Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de potasio, KNO3</td><td>Sinopharm Reactivo químicoCo., Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Jiangsu Songchang Equipo médico Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, NAOH</td><td>Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sinopharm Reactivo químicoCo., Ltd</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>papel de sulfato</td><td>Taizhou Jinnong Termostato de malla de fábrica</td><td></td><td></td></tr> baño <tr>de<td>agua</td><td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tripotásico tribásico trihidratado, K3PO4</td><td>Shanghai Lingfeng Reactivo químico Co., Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>bolsas con cierre hermético</td><td>M& G Chenguang Papelería Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo s

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Los cítricos utilizan la autoincompatibilidad basada en S-RNasa para rechazar el autopolen y, por lo tanto, requieren árboles polinizadores cercanos para una polinización y fertilización exitosas. Sin embargo, la identificación de variedades adecuadas para servir como polinizadores es un proceso que requiere mucho tiempo. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método rápido para identificar cultivares de cítricos compatibles con la polinización que utiliza electroforesis en gel de agarosa y tinción de azul de anilina. La compatibilidad del polen se determina en función de la identificación de genotipos S mediante la extracción de ADN total y la realización de ensayos de genotipado basados en PCR con cebadores específicos. Además, los estilos se recolectan 3-4 días después de la polinización manual y se realiza la tinción de azul de anilina. Finalmente, el estado de crecimiento de los tubos polínicos se observa con un microscopio de fluorescencia. La compatibilidad e incompatibilidad del polen se puede establecer observando si el crecimiento del tubo polínico es normal o suprimido, respectivamente. Debido a su simplicidad y rentabilidad, este método es una herramienta eficaz para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen de diferentes variedades de cítricos para establecer grupos de incompatibilidad y relaciones de incompatibilidad entre diferentes cultivares. Este método proporciona información esencial para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados y, por lo tanto, facilita el establecimiento de nuevos huertos y la selección de padres apropiados para los programas de reproducción.

Para los experimentos realizados aquí, se seleccionaron flores maduras, se recolectaron las anteras, se secaron en un horno y el polen se germinó a 28 ° C durante 12 h. La viabilidad del polen y las tasas de germinación se cuantificaron como se muestra en la Figura 1.
Los cítricos se polinizaron manualmente, y la compatibilidad e incompatibilidad del polen se evaluó mediante tinción de azul de anilina y microscopía de fluorescencia. El polen compatible podría germ...

Este protocolo proporciona un método rápido para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen en cultivares de cítricos.

Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Esta técnica puede identificar eficientemente el genotipo S e identificar con precisión la autoincompatibilidad de los cítricos, proporcionando la información necesaria para seleccionar árboles polinizadores adecuados. Esta es una técnica eficiente en el tiempo, simple y confiable para seleccionar los árboles parentales apropiados en los programas de reproducción. Esta técnica es simple y fácil de hacer y hacer experimentos por primera vez necesita paciencia y cuidado.La identificación del genotipo S y el diseño del cebador específico S necesitan más atención y cuidado. Demostrando el procedimiento estará Yu Hu, un estudiante graduado de mi laboratorio. Comience la recolección de polen llevando las flores Majia pomelo, Citrus maxima, al laboratorio.Recoja las anteras con pinzas y colóquelas en una placa de Petri que contenga papel de filtro. Seque los granos de polen colocando la placa de Petri que contiene las anteras en un horno de 28 grados centígrados durante 24 horas. Después del secado, guarde el polen en una bolsa hermética con cierre hermético Micro Centron que contenga gel de sílice que cambia de color.Cierre la bolsa y etiquétela con el nombre de la variedad de polen y la fecha de almacenamiento. Vierta 300 microlitros del medio líquido en la tapa de un tubo de centrífuga de dos mililitros y rocíe el polen uniformemente con la ayuda de un cepillo de polinización. Coloque el polen en una caja negra humidificada e incube a 28 grados centígrados durante 12 horas.Después de la incubación, corte la punta superior de un milímetro de una punta de pipeta de 1.000 microlitros y aspire el polen con una pequeña cantidad de solución de cultivo. Coloque el polen en el centro del portaobjetos del microscopio y cúbralo con un cubreobjetos. Una vez hecho esto, observe la muestra con un microscopio invertido utilizando un objetivo 10X.Realice tres réplicas independientes utilizando aproximadamente la misma densidad de polen para cada réplica. Para la polinización, use un cepillo de polinización para esparcir una cantidad suficiente de polen viable en la superficie del estigma, asegurándose de no dañar el pistilo. Cubra las flores polinizadas con una bolsa de papel sulfato y evite la polinización por pólenes genotípicamente distintos sellando la bolsa con un clip.Escriba el nombre de la especie y el número y el tiempo de polinización en la etiqueta. Cuelgue la etiqueta en las ramas cerca de las flores polinizadas. Retire las bolsas de polinización aproximadamente tres o cuatro días después de la polinización y recoja las flores polinizadas en bolsas con cierre hermético.Retire inmediatamente los pétalos, receptáculos y ovarios de las flores y sumerja el estigma fusionado al estilo en un tubo de centrífuga que contenga una solución fijadora recién preparada. Incubar el estigma y el estilo en la solución fijadora durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, deseche la solución fijadora antes de lavar el estigma y peine dos o tres veces en etanol al 95%.Luego, agregue una solución de etanol al 70% al estilo, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida en la solución. Los estilos en esta etapa se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante uno o dos meses. Para la tinción de azul de anilina, lave las muestras de estilo almacenadas en etanol al 70% con agua destilada de tres a cuatro veces.Sumérjalo en una solución de hidróxido de sodio de cuatro molares y séllelo antes de incubarlo en un baño de agua de 65 grados centígrados durante 60 minutos. Durante este paso, el color del estilo cambia de amarillo-blanco a naranja-rojo. A continuación, remoje los estilos en agua destilada.Después de 30 minutos, deseche el agua destilada y lave los estilos con agua destilada de tres a cuatro veces o hasta que el color del estilo se vuelva amarillo. Luego, agregue el azul de anilina hasta que la muestra se sumerja e incube durante 12 horas en la oscuridad. Observe el crecimiento del tubo polínico bajo el microscopio de fluorescencia.Coloque la diapositiva sobre una mesa plana. Divide el estilo en dos mitades a lo largo del eje longitudinal con un bisturí. Coloque la mitad del estilo en un portaobjetos de vidrio y agregue de dos a tres gotas de polietilenglicol a la superficie del portaobjetos.Luego, cúbralo con un cubierto. Una vez hecho esto, coloque el portaobjetos en la plataforma del microscopio por encima de la abertura y visualice usando un objetivo 10X. Utilice el filtro DAPI y observe el crecimiento del tubo polínico.Observe cinco estilos para cada tipo de polinización. La viabilidad polínica de Citrus maxima y las tasas de germinación se cuantificaron mediante microscopía fluorescente. El polen compatible germinó con éxito en la superficie del estigma y produjo un tubo polínico normal, que creció y finalmente condujo a la fertilización en el ovario.En contraste, los tubos de polen incompatibles crecieron a través de aproximadamente 2/3 del estilo y luego dejaron de crecer. La electroforesis en gel de agarosa detectó el producto de ADN amplificado utilizando los cebadores específicos del locus S. Mostró la amplificación del producto de ADN entre 500 y 1.000 pares de bases.Se identificó el genotipo S correspondiente. Se identificaron 21 haplotipos S en diferentes especies de cítricos utilizando este método. El paso de polinización es crítico.Solo la polinización exitosa puede garantizar la observación posterior de los tubos de polen. La técnica se utilizó para analizar los rasgos de autoincompatibilidad y para explorar e identificar los determinantes femeninos de la autoincompatibilidad. Este método es importante para la investigación de la autoincompatibilidad y los programas de mejoramiento.También puede facilitar a la comunidad agrícola la selección de árboles polinizadores para sus huertos.

determination-self-compatibility-inter-compatibility-relationships

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hemos desarrollado una metodología para la realización de cruces en Setaria viridis (S. viridis). El método consiste en la poda de la panícula antes de un tratamiento de agua caliente para matar el polen viable. Cruces se realizan siguiendo un régimen de crecimiento bien controlada y típicamente dan lugar a la recuperación de 1 a 7 cruz de polinización semillas / s por panícula.

Los métodos para realizar cruces en<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Un nuevo sistema de modelo para las gramíneas

Para revelar la eficacia polinizador de una especie de planta dada, se han desarrollado varios métodos de los experimentos de campo. Este estudio demuestra los métodos básicos de los experimentos de campo de ecología de la polinización utilizando el estudio de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea y el nuevo mecanismo de polinización, rompiendo capullo de la polinización.

Los experimentos de campo de Ecología de la Polinización: el caso de<em&gt; Sanguinea Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

En este protocolo, se describen métodos para la realización de cruzamientos de consanguinidad y para evaluar el éxito de esas cruces, de la hormiga Vollenhovia emeryi. Estos protocolos son importantes para experimentos para entender la base genética de los sistemas de determinación de sexo en himenópteros.

Inducción y evaluación de cruces de consanguinidad con la hormiga, Vollenhovia Emeryi

Aquí, presentamos un protocolo para forzar la floración en mandarinos en condiciones Fitotrón. Agua estrés, alta iluminación y fotoperiodo resorte simulado permitida flores viables obtener en un corto período de tiempo. Esta metodología permite a los investigadores tener varios periodos de floración en 1 año.

Floración forzada en mandarinos Phytotron condiciones

Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Presentamos una metodología para establecer los requisitos de polinización de los cultivares de albaricoque (Prunus armeniaca L.) que combinan la determinación de la auto-(in)compatibilidad por microscopía de fluorescencia con la identificación del S-genotipo por análisis PCR.

Determinación de las relaciones de autoejecución e inter-(in) en albaricoque que combinan la polinización manual, la microscopía y los análisis genéticos

Se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela, que combina polinizaciones de campo y laboratorio y observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia con la identificación de genotipos Spor PCR y el monitoreo de la floración para la selección de polinizadores.

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

En este trabajo, se describe un método robusto para la cuantificación de la eficiencia de apareamiento en la levadura Saccharomyces cerevisiae . Este método es particularmente útil para la cuantificación de barreras precigóticas en estudios de especiación.

Determinación de la eficiencia de apareamiento de haploides en Saccharomyces cerevisiae

Aquí se describe un método mejorado para medir los perfiles de hidratación del polen en Arabidopsis thaliana . El nuevo método ofrece una resolución más alta, no es invasivo y es altamente reproducible. El protocolo representa una nueva herramienta para una disección más fina de los procesos que regulan las primeras etapas de la polinización.

Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de grano único de alta resolución para Arabidopsis thaliana

Aquí se describe el procedimiento aplicado en el Grupo de Biología de Membrana Caffrey estructurales y funcionales para establecer manualmente ensayos de cristalización de proteínas de la membrana lipídica en mesofases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

Aprende a determinar la autocompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía de fluorescencia y análisis de genotipo S. Este método permite identificar 21 haplotipos S en Citrus maxima para optimizar programas de mejoramiento genético y selección de polinizadores.

Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S (Video) | JoVE Journal

Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S

Explorar más videos