Name: BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celularPresentación del receptor GABA A en el cerebro de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda a evaluar la expresión de receptores GABA A en superficie celular mediante el ensayo de reticulación BS3 en cerebro de roedores. Este método revela adaptaciones moleculares del estrés psicosocial crónico.

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Los autores agradecen al personal de la instalación de animales CAMH por cuidar a los animales durante la duración del estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), el Discovery Fund del CAMH (a T.P.), la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (premio NARSAD # 25637 a E.S.) y el Instituto de Investigación de Salud Mental de la Familia Campbell (a E.S.). E.S. es el fundador de Damona Pharmaceuticals, una biofarmacéutica dedicada a llevar nuevos compuestos GABAérgicos a la clínica.

Todo el trabajo con animales en este protocolo se completó de acuerdo con la Ley de Animales para la Investigación de Ontario (RSO 1990, Capítulo A.22) y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC) y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales.
1. Preparación de los animales
<ol><li>Determinar el número de animales que se utilizarán en los experimentos y dividirlos en grupos apropiados o cohortes experimentales. Consulte la sección de discusión para obtener una discusión sobre el tamaño del grupo, el sexo y el poder estadístico. NOTA: Este protocolo está personalizado para ratones (cepa C57BL6/J; 2-4 meses de edad; típicamente 20-30 g de peso corporal; número equivalente de machos y hembras a utilizar).</li>
	<li>Colocar a los animales bajo UCMS o controlar condiciones no estresadas durante 5-8 semanas, siguiendo el protocolo descrito anteriormente14.</li>
	<li>Después del último procedimiento de UCMS, permita que los animales permanezcan en sus jaulas domésticas durante 1 día antes de usarlos para el ensayo de reticulación para evitar efectos de estrés agudo en la expresión del receptor.</li>
</ol>2. Preparación de las soluciones madre
<ol><li>Prepare y almacene las siguientes soluciones según las instrucciones previas al ensayo.<ol><li>Preparar 5 M de NaCl disolviendo 14,6 g de NaCl en 40 ml de agua desionizada. Conservar a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Preparar 1,08 M de KCl disolviendo 3,22 g de KCl en 40 ml de agua desionizada. Tienda en RT.</li>
		<li>Preparar 400 mM de MgCl 2 disolviendo 3,25 g de MgCl2·6H2Oen 40 mL de agua desionizada. Tienda en RT.</li>
		<li>Preparar 1 M de glicina disolviendo 3 g de glicina en 40 ml de agua desionizada y conservar a 4 °C.</li>
		<li>Preparar 1 M de ditiothreitol (DTT) disolviendo 1,54 g de TDT en 10 ml de agua desionizada. Filtrar-esterilizar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 μm, y alícuota en tubos de 2 ml. Conservar a -20 °C.</li>
		<li>Prepare 10% de Nonidet-P40 (NP-40) diluyéndolo en una proporción de 1:10 (v/v) en agua desionizada. Tienda en RT.</li>
		<li>Prepare 0,5 M EDTA (pH = 8,0) y guárdelo en RT.</li>
		<li>Preparar tampón HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) y conservar a 4 °C.</li>
		<li>Preparar glucosa al 2,5 M o al 45% (p/v) y conservar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación del puesto de trabajo
<ol><li>El día del ensayo de reticulación BS3, reúna los siguientes materiales en la sala de disección de animales (Figura 1), con varios elementos preenfriados en hielo: un cubo de hielo, un bloque de temperatura de metal (preenfriado sobre hielo), PBS helado en un tubo cónico de 50 ml y PBS congelado en una placa de Petri, papel de filtro humedecido con PBS y colocado sobre una superficie plana refrigerada o hielo azul, una matriz cerebral (intervalo de 1 mm para la inserción de una hoja de afeitar) preenfriada en hielo, hojas de afeitar (~10) preenfriadas en hielo, herramientas de disección (tijeras, fórceps, una sonda curva), un punzón de tejido, papel y toallas de papel de spray de etanol al 70%, puntas de pipeta (200 μL), una pipeta (P200), un cronómetro, un bloc de notas, un bolígrafo y tubos de microcentrífuga (1,5 ml).<ol><li>Antes del ensayo, etiquete los tubos de microcentrífuga con la información de la muestra (p. ej., número de identificación del animal, tipo de tratamiento [UCMS versus sin estrés (NS)], región cerebral, con o sin BS3, etc.). NOTA: Para los ensayos de reticulación BS3, se deben recolectar dos muestras de cada región del cerebro; una muestra se utilizará para la reticulación (con BS3) y la otra para la reacción sin reticulación (sin BS3) como control. Por lo tanto, para tomar muestras de dos regiones cerebrales (es decir, la corteza prefrontal [PFC] y el hipocampo [HPC]) en 12 ratones, etiquete 48 tubos para el muestreo inicial (= 2 muestras × 2 regiones × 12 ratones) (que se utilizará en la sección 6). Etiquetar dos juegos adicionales de 48 tubos para su posterior almacenamiento (para almacenar dos volúmenes diferentes [100 μL, 300 μL] de cada muestra) (que se utilizarán en la sección 7). Por lo tanto, se requiere etiquetar 144 tubos en total para este tamaño de cohorte.</li>
	</ol></li>
	<li>Además, asegúrese de que el siguiente equipo esté disponible en el laboratorio: una microcentrífuga refrigerada de mesa, un sonicador, un rotador de tubos (para ser utilizado en la cámara frigorífica o dentro del refrigerador [4 °C]), un congelador (-80 °C) para almacenar muestras y un cubo de hielo seco para el almacenamiento temporal de las muestras (que se utilizará en la sección 7)</li>
</ol>4. Preparación de las soluciones de trabajo y tampones
NOTA: En la mañana del ensayo, prepare las siguientes soluciones. Este cálculo se basa en las soluciones necesarias para procesar dos regiones cerebrales (es decir, el PFC y el HPC) de 12 ratones.
<ol><li>Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, pH = 7.4) como se menciona en la Tabla 1. Dispensar 750 μL de aCSF en cada tubo de muestreo (los 48 tubos etiquetados en el paso 3.1.1) y colóquelos en el bloque de temperatura del metal sobre hielo para enfriar previamente el tampón.</li>
	<li>Prepare el tampón de lisis como se menciona en la Tabla 2. Conservar en hielo (400 μL por muestra).</li>
	<li>Preparar una solución madre BS3 de 52 mM (26x) en tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0).<ol><li>Primero, prepare 100 mM de ácido cítrico (stock A) y 100 mM de citrato de sodio (stock B).</li>
		<li>Diluir el stock A y el stock B en una proporción de 1:20 con agua desionizada. Añadir 100 μL cada uno a 1,9 ml de agua para preparar 5 mM de ácido cítrico (stock C) y 5 mM de citrato de sodio (stock D), respectivamente.</li>
		<li>Mezclar 410 μL de cepa C y 590 μL de caldo D para preparar un tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0) (solución E, 1 ml).</li>
		<li>Confirme el pH de la solución E utilizando una tira indicadora de pH.</li>
		<li>Disolver 24 mg de BS3 en 806,4 μL de solución E mediante vórtice durante 30 s para preparar la solución madre de BS3 (26x).</li>
		<li>Prepare otro 1 ml de solución E para usar como control del vehículo para las muestras sin reticulación. NOTA: Prepare la solución madre BS3 cuando todo lo demás esté listo y el experimento esté a punto de comenzar. El BS3 debe conservarse desecado a 4 °C hasta su uso. Una vez reconstituida, la BS3 permanece activa sólo durante aproximadamente ≤3 h. Como se informa que el pH del tampón de citrato de sodio de 5 mM (solución E) aumenta con el tiempo, causando hidrólisis BS3 acelerada, se recomienda que la solución E se prepare fresca a partir de las soluciones madre A y B9. Debido a la solubilidad limitada de BS3 a bajas temperaturas, mantener el BS3 reconstituido a RT. Utilizar el BS3 reconstituido en 3 h, y no congelar/descongelar ni reutilizar el BS3 reconstituido.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Disección de tejidos cerebrales
NOTA: A partir de este paso, al menos dos personas deben trabajar juntas de manera coordinada. Mientras una persona se centra en la disección de animales (pasos 5.2-5.10 y paso 6.3), la otra persona debe trabajar como cronometrador y ayudar a coordinar el ensayo (paso 5.1, paso 6.1, paso 6.2, paso 6.4 y paso 6.5)
<ol><li>Lleve el primer animal para la disección del área de alojamiento a la sala de disección. NOTA: Como los factores estresantes agudos (por ejemplo, un ambiente nuevo, el olor a sangre) pueden afectar la dinámica de las proteínas cerebrales, los animales deben mantenerse en sus jaulas domésticas colocadas lejos del área de disección y luego ser llevados individualmente a la sala de disección para su decapitación inmediata.</li>
	<li>Eutanasia del ratón por luxación cervical seguida de decapitación. Retire el cerebro rápidamente del cráneo y sumérjalo en PBS helado en una placa de Petri durante 10-15 s (Figura 2). NOTA: Los animales no son anestesiados para experimentos BS3 ya que cualquier agente anestésico podría influir potencialmente en el nivel de presentación superficial de los receptores de neurotransmisores9.</li>
	<li>Coloque el cerebro frío en la matriz cerebral sobre hielo, con el lado ventral del cerebro hacia arriba (Figura 3).</li>
	<li>Inserte la primera hoja de afeitar a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo para cortar el cerebro coronalmente (Figura 4). Usando de tres a cuatro cuchillas de afeitar adicionales, corte en serie la parte anterior del cerebro coronalmente con intervalos de 1 mm.</li>
	<li>Levante los cortes coronales de la matriz cerebral sosteniendo todas las cuchillas de afeitar insertadas juntas, dejando la parte posterior del cerebro atrás en la matriz cerebral. Use fórceps para separar las hojas de afeitar entre sí y colóquelas en la superficie plana y fría con el corte del cerebro hacia arriba (Figura 5).</li>
	<li>Identifique los sectores que contienen la región de interés. Para tomar muestras del PFC, elija la segunda y tercera rebanadas posteriores a la primera rebanada que contiene el pedúnculo olfativo.</li>
	<li>Retire la región de interés con un punzón de tejido (Video 1), déjela a un lado en la cuchilla de afeitar refrigerada y divida uniformemente el tejido en dos (por ejemplo, tejidos del hemisferio izquierdo versus derecho, con una mitad para usar la reacción de reticulación BS3 y la otra mitad para el control sin reticulación si la proteína objetivo de interés se expresa igualmente en ambos hemisferios).</li>
	<li>Pique cada tejido en pedazos en la hoja de afeitar usando la punta fina de las pinzas con múltiples movimientos verticales contra la hoja (Video 2) en lugar de triturar o moler los tejidos. Esto maximizará el área de superficie accesible a BS3 sin comprometer gravemente la integridad de la membrana de las células. Inmediatamente después de picar, transfiera los tejidos picados a los tubos apropiados (ver paso 6.3).</li>
	<li>Para tomar muestras de la HPC, saque la parte posterior del cerebro de la matriz y coloque el cerebro sobre papel de filtro humedecido sobre la superficie plana refrigerada, con el lado dorsal hacia arriba (Figura 6).</li>
	<li>Usando una sonda curva y fórceps, y acercándose desde el lado dorsal (Video 3), disecciona el HPC (mitad dorsal, mitad ventral o ambas) de ambos hemisferios (una mitad para la reticulación BS3 y la otra mitad para el control). Picar cada tejido como en el paso 5.8 y transferir el tejido a los tubos apropiados (ver paso 6.3). NOTA: El tiempo completo de disección para cada animal debe mantenerse en ~ 5 minutos para que las condiciones experimentales y los resultados sean consistentes.</li>
</ol>6. Reacción de reticulación
<ol><li>Lleve al siguiente animal para la disección desde el área de alojamiento a la sala de disección cuando la disección del cerebro del ratón anterior esté a punto de terminar (paso 5.10).</li>
	<li>Clavar el tubo preenfriado en hielo (a partir del paso 4.1) con 30 μL de solución BS3 (26x) o solución vehículo E justo antes de que los tejidos picados estén listos para ser transferidos a los tubos apropiados. Cambie las puntas de pipeta entre los tubos para asegurarse de que no se contamine BS3 en los tubos de control sin reticulación.</li>
	<li>Transfiera los tejidos picados (de los pasos 5.8 y 5.10) a los tubos apropiados y, a continuación, comience a diseccionar al siguiente animal (paso 5.2)</li>
	<li>Invierta y mezcle el tubo para separar los trozos de tejido en trozos más pequeños (Video 4), y comience a incubar las muestras en el rotador del tubo en la cámara frigorífica durante 30 minutos a 2 h. Registre la hora de inicio de la incubación BS3 para cada tubo. Consulte la sección de discusión para conocer el tiempo de incubación óptimo.</li>
	<li>Apagar la reacción pinchando el tubo con 78 μL de glicina 1 M e incubar la muestra durante 10 min a 4 °C con rotación constante. Registre la hora de inicio y finalización del enfriamiento para cada tubo. Continúe ayudando a la persona que se enfoca en la disección de animales trayendo al siguiente animal (paso 6.1) y ayudando con la reticulación (paso 6.2). NOTA: Trate cada muestra exactamente con el mismo tiempo en todas las muestras. Si la sala de disección está lejos de la cámara frigorífica, se recomienda encarecidamente que se reclute a una tercera persona para que participe en la incubación y enfriamiento de la muestra en la cámara frigorífica.</li>
</ol>7. Lisis tisular, preparación de proteínas y Western blot
<ol><li>Después de 10 minutos de enfriamiento (paso 6.5), girar las muestras a 20.000 x g a 4 °C durante 2 min y desechar el sobrenadante. Si hay una tercera persona disponible, continúe con el paso 7.2; De lo contrario, congele rápidamente las muestras en hielo seco y detenga el ensayo aquí hasta que se complete la disección cerebral (sección 5) y la reticulación (sección 6) para todos los animales.</li>
	<li>Añadir 400 μL de tampón de lisis helada por tubo.</li>
	<li>Sonicar las muestras durante 1 s cinco veces con intervalos de 5 s en el medio, mientras mantiene las muestras en hielo.</li>
	<li>Girar las muestras a 20.000 x g durante 2 minutos para hilar los restos de tejido insolubles (pellets) y guardar el sobrenadante.</li>
	<li>Utilice 5 μL del sobrenadante para medir la concentración de proteína mediante el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA).</li>
	<li>Divida el resto del sobrenadante en dos tubos; un tubo contiene 100 μL de sobrenadante para la posterior Western blot, y el otro tubo contiene el resto (~300 μL) para almacenamiento a largo plazo a −80 °C. Añadir una cantidad adecuada de tampón de muestra 4x SDS (suplementado con β2-mercaptoetanol) a las muestras, e incubar a 70 °C durante 10 min.</li>
	<li>Ejecute 10-20 μg de proteína por pocillo en un gel de acrilamida para electroforesis (SDS-PAGE), y luego transfiera proteínas a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) para el análisis de Western blot.</li>
	<li>Bloquear la membrana de PVDF en leche descremada al 5% (p/v) disuelta en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h en RT.</li>
	<li>Lave brevemente la membrana dos veces con TBS-T e incube con el anticuerpo primario diluido en TBS-T durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lave el anticuerpo primario tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T en RT.</li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en TBS-T durante 1 h en RT.</li>
	<li>Lave el anticuerpo secundario tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T en RT.</li>
	<li>Incubar la membrana en un reactivo de quimioluminiscencia mejorado y detectar la señal utilizando el aparato de documentación del gel.</li>
</ol>

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Los autores no informan conflictos de intereses.

Aunque el impacto del estrés psicosocial crónico en los comportamientos (es decir, la emocionalidad y los déficits cognitivos) y los cambios moleculares (es decir, la expresión reducida de los genes GABAérgicos y los déficits que acompañan a la neurotransmisión GABAérgica) están bien documentados10, los mecanismos subyacentes a tales déficits necesitan más investigación. En particular, dado el reciente estudio que muestra que el estrés crónico afecta significativamente el proteoma neuronal a travé...

Los receptores de neurotransmisores se localizan en la superficie de la membrana plasmática neuronal o intracelularmente en las endomembranas (por ejemplo, el endosoma, el retículo endoplásmico [RE] o el aparato trans-Golgi) y se desplazan dinámicamente entre estos dos compartimentos dependiendo de los estados fisiológicos intrínsecos en las neuronas o en respuesta a las actividades de la red neuronal extrínseca 1,2. Dado que los neurotransmisores recién secretados provocan sus funciones fisiológicas principalmente a través del conjunto de receptores localizados en la superficie, los niveles de receptores de superficie para un neurotransmisor dado son uno de los determinantes críticos de su capacidad de señalización dentro del circuito neuronal3.
Existen varios métodos disponibles para monitorizar los niveles de receptores de superficie en neuronas cultivadas, incluyendo el ensayo de biotinilación superficial4, el ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico en condiciones no permeabilizadas5, o el uso de un transgén receptor genéticamente fusionado con un indicador óptico fluorescente sensible al pH (por ejemplo, pHluorin)6. Por el contrario, estos enfoques son limitados o poco prácticos cuando se evalúan los niveles de receptores de superficie in vivo. Por ejemplo, el procedimiento de biotinilación de superficie puede no ser práctico para procesar grandes cantidades y números de muestras de tejidos cerebrales in vivo debido a su precio relativamente alto y los pasos posteriores necesarios para purificar las proteínas biotiniladas en perlas conjugadas con avidina. Para las neuronas integradas en la arquitectura cerebral tridimensional, la baja accesibilidad de anticuerpos o las dificultades en la cuantificación basada en microscopios pueden plantear una limitación significativa para evaluar los niveles de receptores de superficie in vivo. Para visualizar la distribución de los receptores de neurotransmisores en cerebros intactos, se podrían utilizar métodos no invasivos, como la tomografía por emisión de positrones, para medir la ocupación del receptor y estimar los niveles de receptores de superficie7. Sin embargo, este enfoque se basa críticamente en la disponibilidad de ligandos de radio específicos, equipos costosos y experiencia especial, lo que lo hace menos accesible para el uso rutinario de la mayoría de los investigadores.
Aquí, describimos un método simple y versátil para medir los niveles de receptores de superficie en cerebros de animales experimentales ex vivo utilizando un reticulante químico soluble en agua e impermeable a la membrana, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 se dirige a aminas primarias en la cadena lateral de residuos de lisina y puede reticular covalentemente proteínas muy cercanas entre sí. Cuando los cortes de cerebro se preparan recién a partir de una región de interés y se incuban en un tampón que contiene BS3, los receptores de la superficie celular se entrecruzan con proteínas vecinas y, por lo tanto, se transforman en especies de mayor peso molecular, mientras que los receptores asociados a la endomembrana intracelular permanecen sin modificar. Por lo tanto, los grupos de receptores superficiales e intracelulares pueden separarse mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cuantificarse mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos para el receptor a estudiar.
El estrés crónico leve impredecible (EMU) es un paradigma experimental bien establecido para inducir estrés psicosocial crónico en roedores10. UCMS provoca fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos y déficits cognitivos a través de la modulación de una serie de sistemas de neurotransmisores, incluyendo GABA y sus receptores10,11. En particular, el receptor GABA A que contiene la subunidad α5 (α5-GABAA R) está implicado en la regulación de la memoria y las funciones cognitivas12,13, lo que sugiere la posible participación de funciones alteradas de esta subunidad en los déficits cognitivos inducidos por UCMS. En este protocolo, utilizamos el ensayo de reticulación BS3 para cuantificar los niveles de α5-GABAAR expresado en la superficie en la corteza prefrontal de ratones expuestos a UCMS en comparación con ratones de control no estresados.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>2,5 M (45%, c/v) Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>4x SDS tampón de muestra (Laemmli)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Bis(sulfosuccinimidil)suberado (BS3)</td><td>Pierce</td><td>A39266</td><td>Formato sin peso; 10 x 2 mg</td></tr><tr><td>Matriz cerebral</td><td>Ted Pella</td><td>15003</td><td>Para ratón, 30 g adulto, coronal, 1 mm</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Sonda curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>10088-15</td><td>Sonda de Anatomía Macroscópica; angulado 45</td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>milli-Q</td><td>EQ 7000</td><td>Agua ultrapura [resistividad 18.2 M&Omega; &punto medio; cm @ 25 & deg; C; carbono orgánico total (COT) &le; 5 ppb]&nbsp;</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro (3MM)</td><td>Whatman</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas (grande)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Pinzas de Graefe Extra Finas</td></tr><tr><td>Pinzas (pequeñas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Dumont #5 Pinzas</td></tr><tr><td>GABA-A R alfa 5 anticuerpo</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-31163</td><td>IgG policlonal de conejo; detectar una señal errónea en la reticulación química</td></tr><tr><td>GABA-A R alfa 5 C-terminal anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>PPS027</td><td>IgG policlonal de conejo; reacciones cruzadas con Glycine Sigma de ratón y rata</td></tr><tr><td></td><td></td><td>W328707</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante</td> <td>Bio-Rad</td><td>1721019</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40, sustituto (NP-40)</td><td>SantaCruz</td><td>68412-54-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras (grandes)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>Tijeras quirúrgicas -</td></tr><tr><td>Tijeras dentadas (pequeñas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Tijeras finas - Afiladas</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)&nbsp;</td><td>Qsonica</td><td>15338284</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de tejido (ID 1 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td>Miltex Punzón de biopsia con émbolo, ID 1,0 mm, OD 1,27 mm</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 5x Tampón</td><td>de transferencia Bio-Rad</td><td>10026938</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo (LabRoller)</td><td>Labnet</td><td>H5000</td><td></td></tr></tbody></table>

bs3 ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celularpresentación del receptor gaba a en el cerebro de roedores

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

La ansiedad es un estado de emoción que afecta de manera variable los comportamientos de los animales, incluidas las funciones cognitivas. Los signos conductuales de ansiedad se observan en todo el reino animal y pueden reconocerse como respuestas adaptativas o desadaptativas a una amplia gama de modalidades de estrés. Los roedores proporcionan un modelo experimental probado para estudios traslacionales que abordan los mecanismos integradores de la ansiedad a nivel molecular, celular y de circuito. En particular, el paradigma del estrés psicosocial crónico provoca respuestas desadaptativas que imitan fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos que son análogos entre humanos y roedores. Si bien estudios previos muestran efectos significativos del estrés crónico en el contenido de los neurotransmisores en el cerebro, el efecto del estrés en los niveles de receptores de neurotransmisores está poco estudiado. En este artículo, presentamos un método experimental para cuantificar los niveles de superficie neuronal de los receptores de neurotransmisores en ratones bajo estrés crónico, especialmente centrándonos en los receptores de ácido gamma-aminobutírico (GABA), que están implicados en la regulación de la emoción y la cognición. Usando el reticulante químico irreversible impermeable a la membrana, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), mostramos que el estrés crónico regula significativamente a la baja la disponibilidad superficial de los receptores GABAA en la corteza prefrontal. Los niveles de superficie neuronal de los receptores GABAA son el proceso limitante de la velocidad para la neurotransmisión de GABA y, por lo tanto, podrían usarse como un marcador molecular o un proxy del grado de fenotipos similares a la ansiedad / depresivos en modelos animales experimentales. Este enfoque de reticulación es aplicable a una variedad de sistemas receptores para neurotransmisores o neuromoduladores expresados en cualquier región del cerebro y se espera que contribuya a una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes a la emoción y la cognición.

Para demostrar la viabilidad del ensayo de reticulación BS3 para evaluar los niveles de superficie de α5-GABA A R en el PFC de ratón, ejecutamos 10 μg de muestras de proteínas reticuladas y no reticuladas de BS3 en SDS-PAGE y analizamos las proteínas por Western blot utilizando un anticuerpo anti-α5-GABAAR (policlonal de conejo) (Figura 7). Las muestras de proteínas no reticuladas dieron la cantidad total de α5-GABA A R a ~ 55 kDa, mientras que las muestras de proteínas...

El ensayo de reticulación química BS3 revela una expresión reducida del receptor GABAA en la superficie celular en cerebros de ratones en condiciones de estrés psicosocial crónico.

BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celularPresentación del receptor GABA A en el cerebro de roedores

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the ...

El ensayo de reticulación química utilizando BS3 como reticulante ayudará a determinar el nivel de superficie celular del receptor de neurotransmisores, que es un determinante crítico de la eficacia de la neurotransmisión. Este ensayo es particularmente útil para la evaluación específica de la región cerebral de la dinámica del receptor en respuesta a diversos agentes psicotrópicos o modalidades de estrés psicógeno en modelos animales. Para comenzar, retire rápidamente el cerebro del cráneo del ratón C57BL / 6J sacrificado.Sumérjalo en una placa de Petri que contenga PBS helado durante 10 a 15 segundos. Coloque el cerebro frío en la matriz cerebral sobre hielo mirando hacia el lado ventral hacia arriba. Para cortar el cerebro coronalmente, inserte la primera hoja de afeitar a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo.Usando de tres a cuatro cuchillas de afeitar adicionales, corte en serie la parte anterior del cerebro coronalmente a intervalos de un milímetro. Mantenga juntas las hojas de afeitar insertadas para levantar los cortes coronales de la matriz cerebral, dejando atrás la parte posterior. Usando fórceps, separe las hojas de afeitar entre sí y colóquelas en la superficie plana y fría con el corte cerebral hacia arriba.Para tomar muestras de la corteza prefrontal, elija la segunda y tercera rebanadas posteriores a la primera rebanada que contiene el pedúnculo olfativo. Con un punzón de tejido o fórceps, retire la región deseada. Coloque el pañuelo en la hoja de afeitar fría y divídalo uniformemente en dos piezas.Use la punta fina de las pinzas para picar cada tejido en pedazos en la hoja de afeitar con múltiples movimientos verticales. Pinche el tubo preenfriado marcado que contiene líquido cefalorraquídeo artificial con 30 microlitros de solución BS3 o solución de vehículo E.Luego transfiera inmediatamente los tejidos picados al tubo deseado. Para tomar muestras del hipocampo, retire la parte posterior del cerebro de la matriz y colóquela en papel de filtro humedecido sobre una superficie plana fría con el lado dorsal hacia arriba.Con una sonda curva y fórceps acercándose desde el lado dorsal, disecciona el hipocampo desde ambos hemisferios, luego pica el tejido y transfiérelo a tubos con púas apropiados como se demostró anteriormente. Para la reacción de reticulación, invierta el tubo que contiene tejido y solución para romper los trozos de tejido en trozos pequeños. Incubar las muestras en el rotador del tubo a 4 grados centígrados durante 30 minutos a 2 horas y registrar la hora de inicio de la incubación BS3 para cada tubo.Luego apague la reacción con 78 microlitros de una glicina molar. Incubar más durante 10 minutos a 4 grados centígrados con rotación constante y registrar la hora de inicio y finalización para el enfriamiento. En el análisis de Western blot después de la reticulación de BS3, la proteína no reticulada mostró la cantidad total de subunidad alfa5 del receptor GABA-A en aproximadamente 55 kilodaltons.Sin embargo, la proteína reticulada BS3 mostró una subunidad alfa5 asociada a la endomembrana del receptor GABA-A migrando a aproximadamente 55 kilodaltons, junto con especies de proteínas de mayor peso molecular que representan complejos de proteínas reticuladas covalentemente a la subunidad alfa5 del receptor GABA-A. Además, se observó una reducción significativa y progresiva en la subunidad alfa5 de superficie de los niveles del receptor GABA-A en la corteza prefrontal a las tres semanas y cinco semanas de UCMS en comparación con los ratones de control sin estrés. Se sabe que los receptores se desplazan entre la superficie de la membrana plasmática y la membrana interna a temperatura ambiente.Por lo tanto, es importante realizar la disección de tejidos a baja temperatura. Al utilizar el ensayo de reticulación, se reveló que el estrés psicosocial puede modular significativamente los niveles superficiales de los receptores GABA, que en parte sirve como base molecular para la ansiedad, el comportamiento o los déficits cognitivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un modelo de rata de trastorno de estrés postraumático (TEPT), que revela las alteraciones persistentes en la función neuroendocrina y el retraso a largo plazo, la respuesta temor exagerado, característicos de pacientes con TEPT. El modelo animal y los métodos descritos aquí son útiles para la correlación de biomarcadores en núcleos cerebrales, que son mecanicista, pero no se puede medir en los pacientes, con biomarcadores en la sangre periférica de células blancas, que pueden.

Biomarcadores en un modelo animal para Revelar correlatos neurales, hematológicas y conductuales de estrés postraumático

Este video muestra la reticulación de proteínas de superficie neuronal usando suberato de bis-sulfosuccinimidil o BS3. El cerebro de ratón aislado y enfriado se secciona coronalmente. La región deseada se extrae de las secciones, se pica y se trata con BS3. BS3 se entrecruza con proteínas de superficie como los receptores GABA, dejando inalteradas las proteínas internas. La reacción se apaga con glicina antes de procesar las muestras para su posterior análisis.

Reticulación de proteínas de superficie neuronal en el cerebro de ratón mediante un ensayo de reticulación química

Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

El protocolo de estrés crónico leve impredecible (UCMS) es un método validado para estudiar los cambios conductuales y fisiológicos asociados con el estrés crónico y los síntomas depresivos. Ocho semanas de imposición del protocolo UCMS induce cambios de comportamiento y malos resultados de salud en roedores de ambos sexos.

Un protocolo de estrés leve crónico impredecible para los síntomas depresivos, instigar cambios de comportamiento y los resultados de salud negativos en los roedores

Aquí presentamos el protocolo de estrés leve crónico impredecible en ratones. Este protocolo induce un depresivo-como el fenotipo a largo plazo y permite evaluar la eficacia de los antidepresivos putativos en la reversión de los déficits depresivos-como comportamiento y neuromolecular.

El protocolo de estrés leve crónico impredecible para inducir la Anhedonia en ratones

Aquí, describimos el protocolo y la implementación de metil-Seq, una plataforma de epigenómica, utilizando un modelo de rata para identificar cambios epigenéticos asociados a la exposición de estrés crónico. Los resultados demuestran que la plataforma de metil-Seq de la rata es capaz de detectar diferencias de metilación que surgen de la exposición del estrés en ratas.

Una plataforma de metil-Seq de rata para identificar cambios epigenéticos asociados a la exposición de estrés

Este artículo proporciona un protocolo simplificado y estandarizado para la inducción de un comportamiento depresivo en ratones inmovilizados crónicamente mediante el uso de un restrainer. Además, se explican las técnicas fisiológicas y de comportamiento para verificar la inducción de la depresión.

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La tarea de barrera del laberinto Y es una prueba de comportamiento que examina la motivación para gastar esfuerzo para recompensar. Aquí, discutimos la prueba de múltiples factores de estrés crónicos bien validados, incluyendo la corticosterona crónica y el estrés de derrota social con este comportamiento, así como el nuevo estrés crónico crónico de la derrota social no discriminatorio (CNSDS), que es eficaz en las mujeres.

El estrés crónico cambia el comportamiento de la elección relacionada con el esfuerzo en una tarea de barrera del laberinto Y en ratones

Este protocolo describe un modelo de estrés leve crónico impredecible (CUMS) para la depresión basado en la teoría médica mongola, junto con métodos para validar las pruebas de comportamiento.

Estrés crónico impredecible leve en ratas basado en la medicina mongola

Mediante la integración de cuatro estresores sociales diarios, el presente estudio describe un modelo de estrés social integrado múltiple (MISS) para trastornos psiquiátricos en ratones hembra C57BL/6J. Después de diez días de exposición repetida a MISS, los ratones desarrollaron fenotipos depresivos y similares a la ansiedad, proporcionando así un modelo animal natural basado en la etiología para estudiar los trastornos psiquiátricos en sujetos femeninos.

Un modelo de estrés social integrado múltiple para trastornos psiquiátricos en ratones hembra C57BL/6J

Este artículo cubre los procedimientos para inducir respuestas al estrés utilizando el estrés de restricción física en ratones y ratas. Se discuten las consideraciones adicionales que deben observarse al seleccionar y usar el estrés de restricción en modelos de roedores.

Restricción para inducir estrés en ratones y ratas

Aprenda a evaluar la expresión de receptores GABA A en superficie celular mediante el ensayo de reticulación BS3 en cerebro de roedores. Este método revela adaptaciones moleculares del estrés psicosocial crónico.

BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celularPresentación del receptor GABA A en el cerebro de roedores (Video) | JoVE Journal

BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celular_{Presentación del} receptor GABA A en el cerebro de roedores

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