Name: Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende a medir la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans con este protocolo estandarizado. Ideal para investigadores noveles en biología del desarrollo y genética.

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El trabajo en el laboratorio Jaramillo-Lambert está respaldado por los Institutos Nacionales de Salud NIGMS R35GM142524. Todas las cepas de C. elegans fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis , financiado por los Institutos Nacionales de Salud, P40 OD010440. La figura 1D se creó utilizando Biorender.com.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales utilizados en este protocolo.
1. Preparación de placas experimentales
<ol><li>Prepare placas de Petri de 35 mm de diámetro con medios de Youngren's modificados, solo bacto-peptona (MYOB). Para hacer placas MYOB, añadir 20 g de agar Bacto, 2 g de NaCl, 0,55 g de Trizma-HCl, 0,24 g de Trizma-OH, 3,1 g de peptona de Bacto y 1,6 mL de colesterol a 1 L deddH2Oy autoclave durante 40 min a 121 °C. Dejar enfriar a 55 °C y, utilizando una técnica estéril, verter 4 ml del medio fundido en cada placa de Petri de 35 mm. NOTA: Un litro de MYOB hace ~ 250 placas, que se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses. Recomendamos un mínimo de 10 individuos por réplica con tres conjuntos de réplicas para cada cepa.</li>
	<li>Usando una técnica estéril, siembre las placas con una pequeña mancha (aproximadamente 50 μL) de bacterias OP50 en el centro de la placa. NOTA: Los céspedes pequeños son especialmente importantes para evaluar la fertilización cruzada, ya que el punto más pequeño conduce a un aumento de los encuentros entre machos y hermafroditas, lo que aumenta la posibilidad de apareamiento.</li>
</ol>2. Ensayos de viabilidad embrionaria (autofecundación hermafrodita)
<ol><li>Día 1<ol><li>Etiquete la parte posterior de cada plato. Asegúrese de realizar un seguimiento de cada placa y sus respectivos gusanos durante todo el experimento. NOTA: Técnica de etiquetado preferida-Día 1: gusano 1, Día 1: gusano 2, ... etc.</li>
		<li>Transfiera un hermafrodita individual de la etapa L4 a cada placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. Permita que los gusanos se conviertan en adultos y deposite su autoprogenie durante 24 h a la temperatura de cultivo estándar de 20 °C. Anota estos platos el día 3. NOTA: La temperatura de los experimentos puede ser alterada en el caso de mutaciones sensibles a la temperatura. Para mutaciones sensibles a la temperatura, los ensayos de viabilidad embrionaria deben realizarse tanto a temperaturas permisivas (15-16 °C) como no permisivas (24-26 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Etiqueta un conjunto de placas nuevas-Día 2: gusano 1, Día 2: gusano 2, ... etc.</li>
		<li>Transfiera los gusanos individuales del día 1 a las nuevas placas. NOTA: Estos gusanos deberían haber alcanzado la edad adulta, y los gusanos de tipo salvaje ya deberían haber comenzado a poner embriones.</li>
		<li>Dejar que los gusanos pongan embriones durante 24 h a 20 °C u otra temperatura adecuada. Anota estos platos el día 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3<ol><li>Etiquete un juego de platos nuevos. Día 3: gusano 1, Día 3: gusano 2, ... etc.</li>
		<li>Transfiera los gusanos individuales del día 2 a placas nuevas. Déjelos descendientes durante 24 h a 20 °C u otra temperatura apropiada. Anota estas placas el día 5. NOTA: En casos de temperaturas más bajas, los tiempos de eclosión aumentarán. Ajústese en consecuencia.</li>
		<li>Dibuje un patrón de cuadrícula en una tapa de 35 mm con un marcador fino. Coloque la tapa cuadriculada debajo de la placa de prueba para contar y realizar un seguimiento de los gusanos contados anteriormente (Figura 1A-B).<ol><li>Usando un contador de células diferenciales, puntúe las placas del día 1 para la presencia o ausencia de progenie. Cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados. NOTA: En este punto, ha transcurrido un tiempo suficiente para que cualquier embrión viable haya eclosionado. Cualquier embrión no eclosionado se presume muerto.</li>
			<li>Dentro de un cuadrado individual, cuente los embriones no eclosionados y las larvas vivas que están completamente dentro del cuadrado (Figura 1C-F).</li>
			<li>Para los gusanos que están en los bordes cuadrados, cuente según la ubicación de la cabeza del gusano. Cuente los gusanos con cabezas tocando los bordes superior e izquierdo del cuadrado (no cuente los que tocan los bordes inferior o derecho; Figura 1D). No contar ovocitos no fertilizados para este ensayo (Figura 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 4<ol><li>Puntuar las placas del día 2 contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados, como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 5<ol><li>Puntuar las placas del día 3 contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados, como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio. Analizar los datos obtenidos utilizando el método descrito en el análisis de datos. NOTA: Algunos mutantes genéticos pueden tener un ciclo reproductivo retrasado o expandido. Monitoree las cepas individuales para la puesta continua de embriones más allá de las placas del día 3. Si la producción de embriones no ha cesado para el día 4, continúe transfiriendo a los adultos a nuevas placas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensayos de viabilidad embrionaria (fecundación cruzada masculina/hermafrodita)
<ol><li>Día 1<ol><li>Etiquete la parte posterior de cada plato. Asegúrese de realizar un seguimiento de cada placa y sus respectivos gusanos durante todo el experimento.</li>
		<li>Transfiera un gusano hermafrodita L4 individual a cada placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. NOTA: Las cepas feminizadas, como los mutantes de pérdida de función fog-2 , que no producen espermatozoides, se pueden usar en lugar de hermafroditas.</li>
		<li>Transfiera un solo gusano macho L4 a cada placa etiquetada que contenga un hermafrodita L4. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. NOTA: Las cepas como los machos de la variante plg-1 se pueden usar para identificar si se ha producido apareamiento, ya que estos machos depositan un tapón copulatorio en la vulva hermafrodita después del apareamiento.</li>
		<li>Dejar que los gusanos se apareen y pongan descendencia durante 24 h a 20 °C, u otra temperatura apropiada. Puntúe estas placas para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el día 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera los gusanos, como en el día 2 anterior. En este caso, asegúrese de transferir tanto el hermafrodita como el macho a nuevas placas. Asegúrese de que el hermafrodita ha alcanzado la edad adulta.</li>
		<li>Permitir que los hermafroditas pongan descendencia durante 24 h a 20 °C, u otra temperatura apropiada. Puntúe estas placas para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el día 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3<ol><li>Etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera los gusanos, como en el día 3 anterior. Asegúrese de transferir tanto el hermafrodita como el macho a placas nuevas.</li>
		<li>Dejar que la progenie coloque durante 24 h a 20 °C, u otra temperatura adecuada. Puntúe estas placas para embriones vivos versus no eclosionados en el día 5.</li>
		<li>Utilizando un contador de células diferenciales, contar las larvas vivas y los embriones no eclosionados de las placas del día 1, como se describe en el paso 2.3.3.1. NOTA: No deseche las placas, ya que son necesarias para el día 4.</li>
		<li>Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 4<ol><li>Contar las placas de la progenie viva y los embriones no eclosionados del día 2, tal como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio.</li>
		<li>Verifique las placas del día 1 para hombres. Si se ha producido el apareamiento, la proporción genética esperada de hermafroditas a machos debe ser de 50:50. Si las placas del día 1 no contienen machos, no se produjo apareamiento entre el macho y el hermafrodita. Descarte este par de apareamiento y registre esta observación en el cuaderno de laboratorio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 5<ol><li>Contar las larvas vivas y los embriones no eclosionados a partir de las placas del día 3, como se describe en el paso 2.3.3.1. Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio. Analizar los datos obtenidos utilizando los métodos descritos en el análisis de datos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Calcular el porcentaje de viabilidad embrionaria de una réplica biológica dada de una cepa usando la ecuación (1). NOTA: El número de descendientes vivos y embriones no eclosionados se obtiene sumando el recuento diario durante todo el período experimental. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Calcule el tamaño de la cría por gusano de una cepa dada sumando el número de descendientes (embriones y larvas no eclosionados) producidos por el hermafrodita parental. Calcule el tamaño promedio de la cría usando la ecuación (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Informe el porcentaje de viabilidad embrionaria y el tamaño promedio de la cría con la desviación promedio y estándar entre réplicas biológicas. Realizar la prueba t de Student comparando los datos de control y experimentales.</li>
</ol>

<ol><li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li>
<li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities%3A+aneuploidies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Education%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172(2008).</li>
<li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li>
<li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li>
<li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li>
<li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li>
<li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La propagación de especies que se reproducen sexualmente requiere la formación de gametos haploides (es decir, óvulos y espermatozoides) a través de la meiosis, que luego se unifican en la fertilización, restaurando el número de cromosomas diploides e iniciando el desarrollo embrionario. Los errores en cualquiera de estos procesos pueden conducir a la infertilidad, letalidad embrionaria y / o defectos de nacimiento. C. elegans es un poderoso sistema modelo para estudiar la reproducción sexual. Los efectos de las mutaciones génicas o la eliminación de la expresión génica (por ejemplo, interferencia de ARN) se pueden evaluar con relativa rapidez y facilidad utilizando los ensayos de viabilidad embrionaria y tamaño de cría descritos anteriormente. Hemos utilizado estos métodos para la caracterización inicial de genes implicados en la segregación cromosómica meiótica y la fertilización/activación del óvulo10,11,12. Una reducción observada en la viabilidad embrionaria o el tamaño de la cría indica una interrupción en la meiosis, gametogénesis, fertilización o embriogénesis.
Como la viabilidad embrionaria y el tamaño de las crías se evalúan con relativa facilidad mediante el conteo de la progenie y un cálculo matemático simple, estos son experimentos introductorios óptimos para los principiantes en investigación, ya sea en el laboratorio o en el aula. La facilidad de cría de C. elegans y las ventajas económicas los hacen particularmente adecuados para las clases de biología experimental. Los estudiantes adquieren una valiosa experiencia de investigación a través de la cría de C. elegans , aprenden a usar microscopios de disección y pueden hacer preguntas biológicas en un sistema de desarrollo que se pueden responder en un período de tiempo relativamente corto (aproximadamente 5 días con el protocolo descrito en este documento).
El momento de los recuentos de progenie es muy importante para los ensayos de viabilidad embrionaria. A 20 °C, la embriogénesis dura aproximadamente 16 h, y los adultos reproductivamente maduros comienzan a poner huevos aproximadamente 60 h después de la eclosión como larvas L1. Como el ciclo de vida es rápido, es importante contar la progenie dentro de la ventana apropiada, dando tiempo suficiente para que los embriones eclosionen, pero antes de que la progenie comience a poner huevos. También es importante tener en cuenta que los períodos de crecimiento varían dependiendo de la temperatura. El crecimiento es aproximadamente 2,1 veces más rápido a 24-25 °C que a 15-16 °C, y aproximadamente 1,3 veces más rápido a 20 °C que a 15-16 °C13. En este protocolo, recomendamos que los recuentos ocurran 48 h después de que los adultos se colocan en un plato nuevo. Este período de tiempo asegura que todos los embriones con desarrollo de tipo salvaje tengan tiempo suficiente para eclosionar (>16 h), pero no envejecen hasta el punto de la capacidad reproductiva. Los ensayos realizados a temperaturas inferiores a 20 °C pueden necesitar ser extendidos (animales de transferencia durante 4 días) para que los embriones eclosionen y para que la progenie eclosionada alcance etapas larvales que son más fáciles de observar entre las bacterias en las placas MYOB (etapas L3-L4).
Una limitación para los ensayos de viabilidad embrionaria y el tamaño de las crías es que el proceso de desarrollo específico que se perturba no es evidente. Sin embargo, estos ensayos iniciales pueden ser seguidos con técnicas citológicas para determinar qué proceso está afectado. Por ejemplo, la disección de los gusanos adultos para liberar la gónada seguida de tinción de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y un análisis cuidadoso de la morfología del ADN dentro de la línea germinal pueden revelar si los procesos meióticos se interrumpen. Además, la tinción DAPI de embriones puede revelar en qué etapa se detiene la embriogénesis.
En conclusión, hemos descrito un protocolo para analizar el número de embriones producidos (cría) y el porcentaje de embriones que son viables para varios mutantes de C. elegans. Este ensayo se puede utilizar tanto para hermafroditas autofertilizantes como para cruces masculinos / hermafroditas. Con el corto ciclo de vida de C. elegans, este protocolo se puede completar en menos de 1 semana. Los ensayos de viabilidad embrionaria y los tamaños de cría se pueden utilizar como primeros análisis de genes involucrados en la meiosis, la fertilización o el desarrollo embrionario, y son protocolos apropiados para investigadores más avanzados y novatos en investigación (estudiantes de pregrado y posgrado de primer año) por igual.

La reproducción sexual en organismos eucariotas requiere la producción de gametos funcionales que se fusionan para formar un embrión a través del proceso de fertilización. Los gametos maternos y paternos, el óvulo (óvulos) y los espermatozoides se crean a través de los procesos especializados de división celular y diferenciación de la meiosis y la gametogénesis1. La meiosis comienza con una sola célula diploide y termina con la formación de células hijas que contienen la mitad del número de cromosomas de la célula parental original. Desde la reducción de la ploidía hasta la mezcla de material genético a través del surtido independiente y la recombinación cruzada, la meiosis cumple múltiples funciones importantes1. Los errores dentro de la meiosis pueden resultar en aneuploidía, en la que hay demasiados o muy pocos cromosomas dentro de un gameto. Las incidencias de aneuploidía tienen un tremendo impacto en la salud humana, ya que los desequilibrios cromosómicos son una causa importante de abortos espontáneos y trastornos del desarrollo como el síndrome de Down y el síndrome de Edwards2.
La fecundación es el proceso por el cual los gametos materno y paterno se fusionan para generar un nuevo organismo3. El reconocimiento de gametos-gametos es facilitado por proteínas en la superficie del gameto3. Los errores con la compatibilidad de gametos conducen a la infertilidad ya que la fusión de espermatozoides y óvulos no puede continuar. La fusión de espermatozoides con un ovocito desencadena una serie de eventos que conducen a la formación adecuada de un embrión activo que puede comenzar el viaje de desarrollo de un embrión unicelular a un organismo multicelular completamente funcional a través de divisiones mitóticas4. A lo largo de la embriogénesis, los eventos moleculares que regulan el desarrollo deben estar estrechamente regulados y cronometrados con precisión para permitir el crecimiento adecuado del organismo5. La diferenciación celular adecuada durante el desarrollo temprano es crucial a medida que el organismo pasa de un embrión pluripotente a un organismo de pleno derecho. Debido a las complejidades de estos eventos, las interrupciones pueden conducir a defectos de desarrollo que resultan en letalidad embrionaria.
Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para estudiar la meiosis, la fertilización y el desarrollo embrionario. C. elegans es un nematodo transparente que tiene dos sexos, machos y hermafroditas. C. elegans hermafroditas, capaces de autofecundarse, son el sexo predominante 6,7. La gónada hermafrodita primero produce espermatozoides durante la cuarta etapa larvaria (L4), que se almacenan en la espermateca. En la transición de L4 a la edad adulta, la línea germinal cambia a la producción de ovocitos, que luego se fertilizan a través de los espermatozoides almacenados. Los machos, que surgen en los hermafroditas a una tasa de menos del 0,2%, solo producen espermatozoides y pueden aparearse con hermafroditas. Tras la fecundación cruzada, los espermatozoides masculinos superan a los espermatozoides hermafroditas en la fecundación de los ovocitos8. Esto permite el mantenimiento relativamente fácil de mutantes homocigotos a través de poblaciones autofertilizantes y manipulaciones genéticas a través de cruces genéticos. Los dos sexos permiten estudios que exploran las diferencias entre la meiosis en las líneas germinales masculinas y femeninas. Además, debido a la naturaleza transparente de C. elegans y sus huevos, los procesos de meiosis, gametogénesis, fertilización y embriogénesis se pueden estudiar en animales vivos e intactos utilizando técnicas de imágenes de fluorescencia.
Al analizar nuevas mutaciones en genes que pueden desempeñar un papel en la meiosis, fertilización y / o desarrollo embrionario en C. elegans, un primer paso crucial es determinar la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría, ya que los errores en estos procesos a menudo conducen a una falla o reducción en la producción de progenie viable. Este documento describe un protocolo para evaluar la fertilidad, la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría de hermafroditas autofertilizantes o cruces entre hermafroditas y machos. Si bien este ensayo clásico se ha utilizado en muchos estudios de C. elegans , proporcionamos un protocolo estandarizado para la configuración y cuantificación precisa. En este protocolo, se aíslan gusanos individuales o pares macho/hermafrodita para permitir el apareamiento y la producción de progenie. La producción y viabilidad de la progenie se observa durante una serie de días para determinar el número de progenies viables y embriones no viables. Al concluir el experimento, se analizan las crías individuales para calcular el porcentaje de viabilidad embrionaria y el tamaño total de la cría.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placas de Petri</td><td>Tritech research</td><td>T3501</td><td>Semiapilable, sin ventilación.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson y compañía</td><td>214010</td><td>para MYOB</td></tr><tr><td>Bacto-Peptona</td><td>Gibco 211677</td><td></td><td>para MYOB</td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8503</td><td>para</td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td> MYOB <td>J.T. Baker</td><td>FW 58.440</td><td>para MYOB</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>para MYOB</td></tr><tr><td>Clorhidrato de Trizma</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>Para MYOB</td></tr><tr><td><fuerte>Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans wild cepa de tipo</td><td>Caenorhabditis Centro</td> <td>de GenéticaN2</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>him-5(e1490)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>DR466</td><td></td></tr><tr><td>spo-11(ok79)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>AV106</td><td></td></tr><tr><td>Equipment/software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células diferenciales</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-670-12</td><td></td></tr><tr><td>MicroSoft Excel o Prism</td>, <td>MicroSoft o GraphPad</td><td></td><td>Para registrar y crear representaciones gráficas de datos.</td></tr><tr><td>alambre de platino</td><td>Tritech research</td><td>PT9901</td><td>Para hacer picos de gusano. 99,5% Platino, 0,5% Iridium. Esto viene como 3 pies / paquete, que es suficiente para hacer 36 picos de gusano (~ 1 pulgada de alambre de platino por pico).</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ-745</td><td>Base diascópica con montura de enfoque, módulo LED integrado, cable de alimentación, rango de zoom de 6,7x a 50x [WD 115 mm], ocular de campo amplio C-15x/17 (Nota: hay microscopios estereoscópicos equivalentes disponibles en otros fabricantes.)</td></tr><tr><td>mango de pico de tornillo sin fin</td><td>Tritech research</td><td>TWPH1</td><td>Para hacer picos de gusano. Monte ~ 1 en alambre de platino en el mango de la púa helicoidal. Alternativamente, los picos de tornillo sin fin se pueden fabricar montando alambre de platino en una pipeta Pasteur de vidrio.</td></tr></tbody></table>

medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en caenorhabditis elegans

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para el estudio de la meiosis, la fertilización y el desarrollo embrionario. C. elegans existen como hermafroditas autofertilizantes, que producen grandes crías de progenie; cuando los machos están presentes, pueden producir crías aún más grandes de progenie cruzada. Los errores en la meiosis, la fertilización y la embriogénesis pueden evaluarse rápidamente como fenotipos de esterilidad, fertilidad reducida o letalidad embrionaria. Este artículo describe un método para determinar la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en C. elegans. Demostramos cómo configurar este ensayo recogiendo un gusano en una placa individual de Youngren's Only Bacto-peptone (MYOB), establecemos el marco de tiempo apropiado para contar la progenie viable y los embriones no viables, y explicamos cómo contar con precisión las muestras de gusanos vivos. Esta técnica se puede utilizar para determinar la viabilidad en hermafroditas autofertilizantes, así como la fertilización cruzada mediante parejas de apareamiento. Estos experimentos relativamente simples son fácilmente adoptables para nuevos investigadores, como estudiantes de pregrado y estudiantes de posgrado de primer año.

Realizamos ensayos de viabilidad embrionaria y tamaño de cría en N2 (tipo salvaje) y en dos cepas que albergan mutaciones en genes implicados en la meiosis, him-5(e1490) y spo-11(ok79). Como tanto him-5 como spo-11 juegan un papel en la formación del cruce meiótico, las mutaciones en estos dos genes dan lugar a la formación de gametos aneuploides. Este ensayo de viabilidad embrionaria para N2 arrojó un porcentaje de viabilidad del 98,9%, mientras que tanto him-5(e1490) como spo-11(ok79) mostraron una reducción en la viabilidad de la progenie con un porcentaje de 74,9% y 0,8%, respectivamente (Figura 2A; p &lt; 0,0005). Estos resultados son consistentes con los resultados publicados anteriormente 7,9. Se determinó que el tamaño promedio de cría de N2, him-5 (e1490) y spo-11 (ok79) era 217, 105 y 219, respectivamente (Figura 2B). De acuerdo con publicaciones anteriores, him-5 (e1490) tiene un tamaño de cría significativamente reducido en comparación con el tipo silvestre, mientras que spo-11 (ok79) no 7,9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> Figura 1: Demostración de la configuración del conteo y la morfología embrionaria en placas . (A) Imagen de una tapa con un patrón de cuadrícula rayada dibujada con un sharpie fino. (B) Una placa MYOB de 35 mm con la tapa estampada debajo para contar. (C) Imagen que muestra un campo de visión de bajo aumento (10x) que muestra múltiples cajas de la cuadrícula. Las puntas de flecha blancas señalan varias larvas dentro de este campo de visión. El conteo debe hacerse a un aumento mayor (solo un cuadrado en el campo) para observar tanto larvas como embriones. Barra de escala = 1.000 μm. (D) Caricatura de la tapa con el patrón de rejilla colocado debajo de una placa de 35 mm. El recuadro denota la técnica adecuada para determinar qué larvas se cuentan en un cuadrado dado. Cuenta de arriba a abajo, de izquierda a derecha. Cuente cualquier gusano que esté completamente dentro del cuadrado. Los gusanos que tocan el límite deben contarse en función de la posición de la cabeza del gusano, no de la cola. Cuente los gusanos frente a la cuadrícula actual o las cuadrículas que se han contado previamente (es decir, los bordes superior e izquierdo). No cuente los gusanos con cabezas tocando los bordes inferior o derecho. A partir del recuadro, los gusanos azules se contarán, mientras que los gusanos rojos no. (E) Imagen representativa de larvas sanas N2 L1 eclosionadas (punta de flecha blanca). (F) Imagen representativa de un ovocito no fertilizado (punta de flecha negra) y un embrión no eclosionado (punta de flecha roja). Los ovocitos no fertilizados no deben contarse para este ensayo. Barras de escala (E,F) = (100 μm). Nota: Las imágenes en C, E y F se tomaron con un microscopio Zeiss AxioZoom, con una cámara conectada con el propósito de demostrar la apariencia de larvas, embriones y ovocitos en placas de gusano. Para los ensayos de viabilidad embrionaria, los recuentos se realizan mientras se observan las placas utilizando un microscopio estereoscópico (sin cámara). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> Figura 2: Gráficos representativos que representan los resultados de los ensayos de viabilidad embrionaria y los tamaños de cría. (A) Porcentaje de viabilidad embrionaria de N2, him-5(e1490) y spo-11(ok79) a 20 °C. (B) Tamaños de cría de N2, him-5(e1490) y spo-11(ok79) a 20 °C. La progenie de al menos 28 hermafroditas fueron puntuados para cada cepa. El número total de embriones no eclosionados más larvas puntuadas fueron N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2,945 y spo-11 (ok79) = 7,230. Las barras de error indican la desviación estándar en tres réplicas individuales separadas. Estadística calculada mediante la prueba t de Student, n.s. = no significativa, *p &lt; 0,0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un método general para determinar la viabilidad embrionaria y el número total de embriones producidos (cría) utilizando el organismo modelo C. elegans.

Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Este protocolo para determinar el tamaño de la cría y la viabilidad embrionaria es utilizado por muchos laboratorios de C.elegans. Las disminuciones en el tamaño bruto y la viabilidad embrionaria pueden indicar defectos en procesos de desarrollo importantes como la miosis, la fertilización y la embriogénesis. Esta técnica proporciona instrucciones claras para los investigadores novatos de C.elegans.Es relativamente simple de configurar y ejecutar, y es un gran punto de partida cuando se trabaja con nuevas cepas mutantes. El mayor desafío para esta técnica es la identificación de embriones versus embriones no fertilizados. Los nuevos investigadores deben practicar la identificación de embriones, ovocitos y las diferentes etapas larvales antes de comenzar estos experimentos.Para comenzar, etiquete la parte posterior de la placa, transfiera un hermafrodita individual de la etapa L4 a la placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. Permita que los gusanos se conviertan en adultos y se autoprogenien durante 24 horas a la temperatura de cultivo estándar de 20 grados centígrados.Anota el plato en el tercer día. Al día siguiente, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera el día un gusano individual a la nueva placa. Permita que los gusanos pongan embriones durante 24 horas a 20 grados centígrados.Anota el plato en el cuarto día. En el tercer día, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera los gusanos individuales del día dos a la nueva placa. Permita que los gusanos pongan progenie durante 24 horas a 20 grados.Anota el plato en el quinto día. Dibuje un patrón de cuadrícula en una tapa de 35 milímetros usando un marcador fino. Coloque la tapa cuadriculada debajo de la placa de prueba para contar y realizar un seguimiento de los gusanos contados anteriormente.Usando un contador de células diferenciales, cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados dentro del cuadrado individual. Para los gusanos en los bordes cuadrados, cuente según la ubicación de la cabeza del gusano. Cuenta gusanos con cabezas tocando los bordes superior e izquierdo del cuadrado.Registre el número de larvas vivas y embriones no eclosionados en un cuaderno de laboratorio. En el cuarto día, anote la placa del día dos contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. En el quinto día, marque la placa del día tres contando las larvas vivas y los embriones no eclosionados, y regístrelos en un cuaderno de laboratorio.Después de etiquetar la parte posterior de la placa, transfiera un gusano hermafrodita L4 individual a la placa. Asegúrese de que no se transfieran embriones u otros gusanos a la placa. Transfiera un solo gusano macho L4 a la placa que contiene un hermafrodita L cuatro.Permita que los gusanos se apareen y pongan descendencia durante 24 horas a 20 grados centígrados. Puntúe la placa para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el tercer día. Al día siguiente, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera el hermafrodita y el macho a la nueva placa.Asegúrese de que el hermafrodita ha alcanzado la edad adulta. Permita que los hermafroditas pongan descendencia durante 24 horas a 20 grados centígrados. Puntúe la placa para larvas vivas versus embriones no eclosionados en el cuarto día.En el tercer día, etiquete un conjunto de placas nuevas y transfiera el hermafrodita y el macho a la nueva placa. Permita que los gusanos pongan progenie durante 24 horas a 20 grados. Puntúe el plato para embriones vivos versus no eclosionados en el quinto día.Usando un contador de células diferenciales, cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados desde el primer día y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. En el cuarto día, cuente la progenie viva y los embriones no eclosionados desde el plato del día dos y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. Verifique el plato del día uno para hombres.Si se ha producido el apareamiento, la proporción genética esperada de hermafroditas a machos es de 50 a 50. Si la placa del día uno no contiene machos, no se produjo apareamiento entre el macho y el hermafrodita. Descarte este par de apareamiento y registre la observación en el cuaderno de laboratorio.En el quinto día, cuente las larvas vivas y los embriones no eclosionados del plato del día tres y regístrelos en un cuaderno de laboratorio. El ensayo de viabilidad embrionaria para N2 arrojó un porcentaje de viabilidad del 98,9%, mientras que tanto him-5 (e1490) como spo-11 (ok79) mostraron una reducción en la viabilidad embrionaria con un porcentaje de 74,9% y 0,8% respectivamente. Se determinó que el tamaño promedio de cría de N2, him-5 (e1490) y spo-11 (ok79) era 217, 105 y 219 respectivamente.El reconocimiento de las diversas etapas del desarrollo de C.elegans es importante para obtener datos precisos y reproducibles. Recomendamos familiarizarse con el desarrollo de gusanos utilizando imágenes y un microscopio de disección. Este procedimiento es un gran primer paso para determinar si un gen está involucrado en un proceso de desarrollo y puede ser seguido por análisis citológicos para determinar qué proceso se interrumpe.

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Investigación

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