Name: Aislamiento y caracterización de los ligamentos uterosacros murinos y órganos del suelo pélvico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar los ligamentos uterosacros murinos manteniendo las conexiones anatómicas con el cérvix, vejiga y recto. Este protocolo establece un modelo preclínico para estudiar el prolapso de órganos pélvicos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención del Programa de Oportunidades de Investigación Subterránea de Verano (UROP) de CU Boulder (CB), la Beca de Investigación de Posgrado de NSF (L.S.), la Beca de Ciencias Schmidt (CL), el Programa de Subvenciones de Semillas de Investigación e Innovación de la Universidad de Colorado (premio 2020 a V.F., S.C. y K.C.) y la Beca Anschutz Boulder Nexus Seed en la Universidad de Colorado (a V.F. y K.C.). Un reconocimiento especial para el Dr. Tyler Tuttle por su ayuda con el diseño de la cámara de carga, así como para los miembros del laboratorio Calve por sus útiles discusiones.

Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo #2705, aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Boulder. Se utilizaron ratones hembra C57BL / 6J de seis semanas de edad para el presente estudio. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de animales
<ol><li>Eutanasia al animal siguiendo el método aprobado institucionalmente. NOTA: El presente estudio utilizó la inhalación deCO2 en alineación con las pautas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (una tasa de desplazamiento del 30% al 70% del volumen de la cámara con CO2 por minuto), seguida de la dislocación cervical, para garantizar una eutanasia exitosa.<ol><li>Trabaje bajo una capucha, si es posible, para minimizar la propagación de alérgenos en ratones. Una vez que el ratón deje de moverse y respirar, espere 2 minutos o más para verificar la falta de respuesta. NOTA: Si el ratón está embarazada o después del parto, los cachorros deben ser sacrificados individualmente. Los cachorros E15.5 y mayores deben ser decapitados durante la disección.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare la configuración de disección con una almohadilla de disección, un bisturí de 11 hojas, tijeras delgadas y afiladas curvas, dos pares de fórceps, pinzas curvas, sutura de poliglactina 5-0, un microscopio de disección y seis alfileres (Figura 1, consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque el ratón sobre la almohadilla y fije las extremidades anteriores hacia abajo (Figura 2A). Hacer una incisión de aproximadamente 1-1,5 cm en el abdomen con tijeras (Figura 2B). Use suavemente las tijeras para separar la piel en los lados craneal, caudal y lateral de la incisión (Figura 2C, D).</li>
	<li>Gire el ratón hacia su lado dorsal y retire suavemente la piel hacia las extremidades posteriores para alejar la piel del sitio de disección (Figura 2E-H).</li>
	<li>Fije el ratón en las extremidades (Figura 2I) y haga una incisión de aproximadamente 1 cm en el abdomen desde el tórax hasta la pelvis (Figura 2J). NOTA: Asegúrese de no dañar los órganos subyacentes.</li>
	<li>Empuje suavemente los órganos hacia el tórax para despejar el campo de visión (Figura 2K). NOTA: Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación.</li>
	<li>Limpie todo el tejido graso del piso pélvico (Figura 2L-N). NOTA: Use fórceps para extraer suavemente y eliminar la grasa de los órganos y tejidos de interés.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig01.jpg"> Figura 1: Un espacio de trabajo limpio con todas las herramientas necesarias para realizar las disecciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig02.jpg"> Figura 2: Eliminación de la piel y apertura de las cavidades pélvica y torácica del ratón. (A) Fijación de todas las extremidades. (B) Incisión inicial. (C) Separar la piel de la fascia subyacente con tijeras. (D) Corte de la piel y preparación para la extracción. (E-G) Arrancar la piel dando vueltas alrededor del ratón. (H) Eliminar completamente la piel del lado dorsal. (I) Eliminación completa de la piel del torso y recolocación de las extremidades del ratón. (J) Abertura del abdomen. (K) Vista del abdomen abierto. (L) Mover los órganos fuera del campo de visión. (M) Eliminación de la grasa. (N) Vista del suelo pélvico despejado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Cosecha USL
<ol><li>Corte los cuernos uterinos de los ovarios (Figura 3B), retírese del campo de visión y corte en la conexión cervical (Figura 3C). NOTA: Los cuernos uterinos se pueden identificar siguiendo el esquema de la Figura 3A. Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación.</li>
	<li>Corte los uréteres lejos de la conexión de la vejiga (Figura 3D). NOTA: Esto es para evitar confusiones con la USL.</li>
	<li>Corte el colon lo más cerca posible del cuello uterino (Figura 3E, F). NOTA: Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación.</li>
	<li>Coloque el ratón junto con la almohadilla de disección debajo del ámbito de disección para visualizar los USL (Figura 3G).</li>
	<li>Use suavemente los fórceps para limpiar la grasa circundante de las USL. NOTA: Use un segundo par de fórceps para sostener el cuello uterino en un ángulo pequeño para mejorar la visualización de dónde se cruza el USL con el cuello uterino. Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación.</li>
	<li>Ate una sutura de poliglactina 5-0 alrededor del extremo cervical de ambas USL (Figura 4B, C). NOTA: Los USL se pueden identificar utilizando las imágenes esquemáticas y de ampliación (Figura 4I-K)</li>
	<li>En este estudio, se utiliza una USL para análisis morfológicos o bioquímicos (es decir, microscopía Raman, inmunohistoquímica, histología). Corte el extremo cervical de la USL, dejando un pedazo del cuello uterino unido, y corte un pedazo de músculo de la parte inferior de la USL (Figura 4D). Coloque el tejido disecado en un baño con 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 4G, H).</li>
	<li>Utilice el USL restante para pruebas mecánicas e imágenes. Corte el extremo cervical de la USL, dejando un pedazo de cuello uterino unido, para facilitar la configuración mecánica (Figura 4D). NOTA: El tejido cervical actuará como un anclaje para asegurar el USL durante la prueba mecánica.</li>
	<li>Una vez recolectados todos los tejidos de interés (pasos 3-5), dislocar los fémures de la pelvis (Figura 4E). NOTA: Uno debe escuchar un leve chasquido cuando la cabeza femoral se desarticula de la copa acetabular.</li>
	<li>Cortar el hueso pélvico de los extremos distal y proximal del hueso pélvico, dejando aproximadamente 10 mm de tejido total (Figura 4F). Coloque el tejido disecado en 1x PBS.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig03.jpg"> Figura 3: Suelo pélvico despejado para disección de USL . (A) Esquema de la anatomía. (B) Cortar los cuernos uterinos en la conexión ovárica. (C) Cortar cuernos uterinos. (D) Corte de los uréteres. (E) Corte del colon. (F) Una visión clara del recto y los USL. (G) Colocar el mouse y la almohadilla de disección debajo del alcance de disección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig04.jpg"> Figura 4: Vista del USL y los tejidos circundantes y disección de los USL. (A) Esquema de puntos de referencia anatómicos que rodean el USL. (B) Atar una sutura alrededor de los extremos cervicales. (C) Cortar los extremos cervicales de la USL. (D) Corte del USL para ser utilizado para los análisis bioquímicos en la conexión sacra. (E) Corte de los fémures del hueso pélvico. (F) Cortar el extremo proximal de la pelvis. (G) Disección del USL en una placa de Petri de 35 mm. (H) El USL con la pelvis unida en una placa de Petri de 35 mm. (I) El USL y el recto con un aumento de 0,75x. (J) Eliminación de grasa de la USL. (K) Limpieza de los USL con un aumento de 1,0x. Barra de escala = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Recolección de vejiga
<ol><li>Después de eliminar la grasa, sostenga la vejiga con los fórceps y levántela suavemente en un ángulo de aproximadamente 40° (Figura 5A).</li>
	<li>Con las tijeras, corte la vejiga desde el lado distal, justo encima del cuello uterino (Figura 5B).</li>
	<li>Coloque el tejido en un baño con 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 5H).</li>
</ol>4. Recolección del recto
<ol><li>Una vez que las USL se desconectan del cuello uterino y se disecciona la vejiga, levante el cuello uterino en un ángulo de aproximadamente 40 ° con los fórceps. Existe la fascia rectovaginal que conecta el recto y el cuello uterino. Con el bisturí, corte suavemente esta conexión (Figura 5C, D).</li>
	<li>Cortar el hueso púbico en la sínfisis púbica con tijeras. Amplíe suavemente el espacio de trabajo para aumentar el acceso visual a las inserciones de tejido.</li>
	<li>Con los fórceps, tire suavemente del recto hacia el tórax y use las tijeras para seguir el recto desde su lado posterior hasta el ano. Cortar el recto en el ano (Figura 5E).</li>
	<li>Coloque el tejido en 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 5I).</li>
</ol>5. Recolección del complejo cérvix-vagina
<ol><li>Después de extraer las USL del cuello uterino, use los fórceps para sostener el cuello uterino. Corte el cuello uterino lo más cerca posible de la vulva con tijeras (Figura 5F, G). NOTA: Asegúrese de cortar la sínfisis púbica para ver visualmente el extremo distal de la vagina.</li>
	<li>Coloque el tejido en 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 5J).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig05.jpg"> Figura 5: Disecciones de vejiga, recto y cuello uterino/vagina . (A) Sostener la vejiga en ángulo. (B) Cortar la vejiga. (C) Cortar el tendón que conecta el cuello uterino y el recto. (D) El tendón con un aumento de 1.0x. (E) Corte del recto. (F) Agarrar el cuello uterino con fórceps. (G) Corte en el extremo distal de la vagina. (H) La vejiga en una placa de Petri de 35 mm. (I) El recto en una placa de Petri de 35 mm. (J) El complejo tejido cérvix-vagina en una placa de Petri de 35 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
6. Preparación de la muestra para la caracterización tisular
<ol><li>Análisis mecánicos y visuales de la USL<ol><li>Coloque el USL con el accesorio pélvico sobre una pared en forma de T dentro de un pocillo de tinción personalizado para garantizar una inmersión total en la solución de tinción (los dibujos CAD del pozo se pueden encontrar en el Archivo de codificación suplementario 1 y en el Archivo de codificación complementaria 2). NOTA: Use sutura y fórceps para ayudar con la colocación.</li>
		<li>Diluir un colorante disponible comercialmente que tiñe grupos amina libres (5 μL, ver Tabla de materiales) en 2.5 ml de 1x PBS, agregar la solución al pozo de tinción personalizado y teñir el tejido durante 2 h en un balancín a 4 ° C. NOTA: Vortex la solución antes de agregarla al pozo de tinción.</li>
		<li>Durante los últimos 15 minutos de tinción, agregue 2.5 μL de una tinción de núcleos de células muertas disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) a la solución. NOTA: Vortex la solución antes de agregarla al pozo de tinción.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis Raman de los USL<ol><li>Fije el USL en línea recta en un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS) que está contenido en un pocillo personalizado. NOTA: El PDMS se utiliza como sustrato blando para permitir la fijación de la muestra en la configuración deseada. Se pueden hacer bloques de diferentes dimensiones mezclando los dos componentes siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), fundiendo en una placa de Petri y, después de la polimerización, cortando el PDMS en la geometría requerida con una cuchilla de bisturí.</li>
		<li>Pin con alfileres de insectos en el asa de sutura y en el músculo pélvico. Hidratar el tejido con 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Tejidos restantes<ol><li>Congele rápidamente los tejidos restantes con nitrógeno líquido o en un compuesto de incrustación apropiado, dependiendo de los análisis deseados.</li>
		<li>Guardar los tejidos a -80 °C hasta análisis posteriores (p. ej., ensayos inmunohistoquímicos o bioquímicos).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extracellular+matrix+protein+expression+and+apoptosis+in+the+uterosacral+ligaments+of+patients+with+or+without+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22International+Urogynecology+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse.</a> International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El efecto del daño estructural en los tejidos reproductivos femeninos está poco estudiado, y se necesita un modelo animal de fácil acceso para la investigación de COP. El ratón es un modelo rentable que puede imitar los estudios reproductivos humanos16. Debido al creciente interés en el estudio del sistema reproductor femenino, existe la necesidad de métodos que ayuden al estudio de estos tejidos. Para abordar esta necesidad, en este trabajo, se establece un método para diseccionar y preparar teji...

Aproximadamente 50% de las mujeres están afectadas por el prolapso de órganos pélvicos (POP)1,2. Alrededor del 11% de estas mujeres cumplen con los criterios para someterse a una reparación quirúrgica, que tiene una baja tasa de éxito (~ 30%)3,4. El POP se caracteriza por el descenso de cualquiera o todos los órganos pélvicos (es decir, vejiga, útero, cuello uterino y recto) de su posición natural debido a la falla de los músculos del USL y del piso pélvico para proporcionar un soporte adecuado5. Esta condición implica disfunción anatómica y alteración del tejido conectivo, así como lesión neuromuscular, además de factores predisponentes 3,6. El POP se asocia con múltiples factores como la edad, el peso, la paridad y el tipo de parto (es decir, partos vaginales o cesáreas). Se cree que estos factores afectan la integridad mecánica de todos los tejidos del suelo pélvico, y se cree que el embarazo y la paridad son los principales impulsores de la POP 5,7,8.
Los ligamentos uterosacros (USL) son estructuras de soporte importantes para el útero, el cuello uterino y la vagina y atan el cuello uterino al sacro4. El daño a los USL pone a las mujeres en mayor riesgo de desarrollar POP. Se cree que el embarazo y el parto imponen una presión adicional sobre el USL, lo que potencialmente induce lesiones y aumenta las posibilidades de POP. La USL es un tejido complejo compuesto de células musculares lisas, vasos sanguíneos y linfáticos distribuidos heterogéneamente a lo largo del ligamento, que se puede dividir en tres secciones distintas: cervical, intermedia y región sacra9. La integridad mecánica de la USL se deriva de componentes de la matriz extracelular (ECM) como colágenos, elastina y proteoglicanos 5,9,10. Se sabe que las fibras de colágeno tipo I son un componente de tracción importante que soporta la carga de los tejidos ligamentosos y, por lo tanto, es probable que estén involucradas en la falla de USL y POP11.
Hay una falta de conocimiento con respecto a las causas, la prevalencia y los efectos del POP en las mujeres. El desarrollo de un modelo animal apropiado de COP es necesario para avanzar en nuestra comprensión del suelo pélvico femenino. Los ratones y los humanos tienen puntos de referencia anatómicos similares dentro de la pelvis, como los uréteres, el recto, la vejiga, los ovarios y los ligamentos redondos9, así como puntos de intersección similares de la USL con el útero, el cuello uterino y el sacro. Además, los ratones ofrecen facilidad de manipulación genética y tienen el potencial de ser un modelo rentable y de fácil acceso para el estudio de POP9. 
Este estudio desarrolló un método para acceder y aislar el USL y los diferentes tejidos del suelo pélvico de ratones nulíparos (es decir, nunca embarazadas). Las USL extraídas se sometieron a digestión enzimática (es decir, para eliminar colágenos y glicosaminoglicanos), se probaron para determinar la respuesta mecánica bajo carga de tracción y se evaluó su composición bioquímica en un estudio de prueba de concepto. La capacidad de aislar tejidos intactos facilitará más caracterizaciones mecánicas y bioquímicas de los componentes del suelo pélvico, que es un primer paso crucial para mejorar nuestra comprensión de los riesgos de lesiones relacionados con el parto, el embarazo y el POP.

<table><tbody><tr><td>11 Cuchilla</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td>Cuchilla extraíble</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Diluido a partir de una concentración de 10x</td></tr><tr><td>Condroitinasa ABC</td><td>Sigma</td><td>C3667-10UN</td><td>Enzima&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Enzima LS004194 Bioquímica</td><td></td><td>de Worthington&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 5</td><td>Configuración vertical</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td>S9E</td><td>Con cámara</td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5 Pinzas</td><td>Fisher NC9626652</td><td></td><td>Punta fina</td></tr><tr><td>Hembra C57BL/6J</td> ratones <td>Jackson Laboratory</td><td>cepa #: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador FemtoTools</td><td>FemtoTools FT-RS1002</td><td></td><td>Célula de carga de 100 mN</td></tr><tr><td>Pinza Curva FST</td><td>Fisher</td><td>NC9639443</td><td>Punta Curva</td></tr><tr><td>FST Tijeras Afiladas 9 mm&nbsp;</td><td>Tijeras de disección</td> <td>Fisher</td><td>NC9639443</td></tr><tr><td>Ghost Dye 780&nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0865-T500</td><td>Libre de tinte de amina</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>Caja de 50 toallitas</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue Tek</td><td>4583</td><td>Se utiliza para la conservación de tejidos</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Thermo Fisher</td><td>044764.AK</td><td>Siga las instrucciones del fabricante Placas de</td></tr><tr><td>Petri 35 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875711A</td><td>Se utiliza para tejido disecado</td></tr><tr><td>Polyglactin 5-0 Suture</td><td>Veter.Sut</td><td>VS385VL</td><td>Con aguja</td></tr><tr><td>Microscopio Raman InVia</td> de <td>Renishaw Renishaw</td><td>PN192(ES)-02-A</td><td>Con objetivos confocales</td></tr><tr><td>Plataforma oscilante</td><td>VWR</td><td>10127-876 Plataforma de</td><td>2 niveles</td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos</td><td>Fisher</td><td>52818</td><td>Para disección&nbsp;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11381</td><td>Tinción nuclear&nbsp;</td></tr><tr><td>Clavijas</td><td>en T Fisher</td><td>S99385</td><td>para disección&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>para disección&nbsp;</td></tr><tr><td>Almohadillas</td><td>Fisher 22037950</td><td></td><td>Para cubrir la almohadilla de disección</td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de los ligamentos uterosacros murinos y órganos del suelo pélvico

Isolation and Characterization of the Murine Uterosacral Ligaments and Pelvic Floor Organs

El prolapso de órganos pélvicos (POP) es una afección que afecta la integridad, la estructura y el soporte mecánico del suelo pélvico. Los órganos en el piso pélvico están soportados por diferentes estructuras anatómicas, incluidos músculos, ligamentos y fascia pélvica. El ligamento uterosacro (USL) es una estructura crítica de carga, y la lesión del USL resulta en un mayor riesgo de desarrollar POP. El presente protocolo describe la disección de USL murinas y los órganos del suelo pélvico junto con la adquisición de datos únicos sobre la composición y función bioquímica de USL utilizando espectroscopia Raman y la evaluación del comportamiento mecánico. Los ratones son un modelo invaluable para la investigación preclínica, pero diseccionar el USL murino es un proceso difícil e intrincado. Este procedimiento presenta un enfoque para guiar la disección de los tejidos murinos del suelo pélvico, incluida la USL, para permitir múltiples evaluaciones y caracterización. Este trabajo tiene como objetivo ayudar a la disección de los tejidos del suelo pélvico por científicos e ingenieros básicos, ampliando así la accesibilidad de la investigación sobre el USL y las condiciones del suelo pélvico y el estudio preclínico de la salud de la mujer utilizando modelos de ratón.

Cada paso de la disección de un ratón de tipo salvaje se detalla en el vídeo asociado y las figuras relacionadas con el protocolo. Para este estudio, se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de 6 semanas de edad (Tabla suplementaria 1). Se analizaron tres grupos de muestra con USL tratados con diferentes enzimas: control (ningún tratamiento), tratados con colagenasa y grupos tratados con condroitinasa. El músculo liso, los nervios y los linfáticos en la USL están rodeados por una ECM rica en colágenos fibri...

Este artículo presenta un protocolo detallado para diseccionar ligamentos uterosacros y otros tejidos del piso pélvico, incluyendo el cuello uterino, el recto y la vejiga en ratones, para ampliar el estudio de los tejidos reproductivos femeninos.

Aislamiento y caracterización de los ligamentos uterosacros murinos y órganos del suelo pélvico

Pelvic organ prolapse (POP) is a condition that affects the integrity, structure, and mechanical support of the pelvic floor. The organs in the pelvic ...

Este protocolo ampliará la accesibilidad de la investigación sobre el ligamento uterosacro y las condiciones del piso pélvico, como el prolapso de órganos pélvicos o POP, y facilitará la disección del tejido del piso pélvico reflejado. Esta técnica permite el aislamiento de ambos ligamentos uterosacros de un ratón mientras se mantienen las uniones anatómicas y se recuperan los órganos circundantes del suelo pélvico. Nuestro método establece un modelo preclínico que permite este estudio de cómo el embarazo o la enfermedad influyen en el comportamiento mecánico de los tejidos.Este método establece una nueva herramienta para la investigación relacionada con la salud de la mujer. La lucha principal es identificar y manejar el ligamento uterosacro. Mi consejo es tomarse el tiempo y el cuidado adecuados porque estos tejidos son pequeños y frágiles.Comience colocando un ratón sacrificado en una almohadilla y sujetando las cuatro extremidades hacia abajo. Haga una incisión de uno a 1,5 centímetros de largo en el abdomen con tijeras. Separe suavemente la piel en los lados craneal, caudal y lateral de la incisión.Gire el ratón hacia arriba y retire suavemente la piel hacia las extremidades posteriores. Fije las extremidades y haga una incisión de un centímetro de largo en el abdomen desde el tórax hasta la pelvis. Empuje suavemente los órganos hacia el tórax para una visión clara.Después de la irrigación con PBS usando un par de fórceps, tire y limpie el tejido graso pélvico. Identifique los cuernos uterinos y luego córtelos de los ovarios. Ahora, sáquelos del campo de visión y corte la conexión cervical.Cortar los uréteres de la conexión de la vejiga. Corte el colon lo más cerca posible del cuello uterino. Coloque el ratón con la almohadilla bajo un endoscopio de disección para visualizar los ligamentos uterosacros.Use fórceps para eliminar suavemente cualquier grasa circundante de los ligamentos uterosacros. Ate una sutura 5-0 alrededor del extremo cervical de ambos ligamentos. Corte el extremo cervical del ligamento uterosacro, dejando un pedazo del cuello uterino unido.Ahora, corta un pedazo de músculo de la parte inferior del ligamento. Coloque el tejido disecado en un baño que contenga PBS para mantener la hidratación del tejido. Corte el extremo cervical del tejido restante, dejando un pedazo de cuello uterino unido para pruebas mecánicas e imágenes.Una vez que se haya eliminado la grasa, sostenga la vejiga con fórceps y levántela suavemente en un ángulo de aproximadamente 40 grados. Use tijeras para cortar la vejiga en el lado distal justo encima del cuello uterino. Coloque la vejiga en un baño con PBS para mantener la hidratación.Ahora, use los fórceps para levantar el cuello uterino en un ángulo aproximado de 40 grados. Identifique la fascia rectovaginal que conecta el recto y el cuello uterino y corte la conexión con el bisturí. Use tijeras para cortar el hueso púbico en la síntesis púbica.Ensanche suavemente el suelo pélvico para aumentar la visibilidad de las inserciones de tejido. Sostenga el cuello uterino con fórceps y córtelo lo más cerca posible de la vulva. Coloque el tejido en PBS para mantener la hidratación.Use los fórceps para tirar suavemente del recto hacia el tórax. Identifique el recto y córtelo en el ano. Coloque el recto en PBS para mantener la hidratación.Una vez cosechados todos los tejidos de interés dislocan los fémures de la pelvis. Cortar el hueso pélvico de los extremos distal y proximal. Coloque el tejido diseccionado en PBS.El tratamiento enzimático pareció reducir el pico axial promedio y relajó los factores estresantes que experimenta el ligamento uterosacro en los desplazamientos globales prescritos, lo que indica que el colágeno y los glicosaminoglicanos contribuyeron a la rigidez axial de los ligamentos. Las cepas axiales promedio para cada muestra probada mecánicamente indican que la deformación axial global en las muestras tratadas con enzimas fue similar o mayor que la muestra controlada, lo que sugiere que la reducción en el estrés macroscópico se debió al tratamiento enzimático, en lugar de cepas más pequeñas. La espectroscopia Raman de la sección intermedia del ligamento uterosacro sugiere que los tratamientos enzimáticos alteraron la composición bioquímica de los ligamentos uterosacros murinos.Los ligamentos uterosacros tratados con colagenasa habían disminuido el contenido de colágeno, así como la disminución del agua y el ácido hialurónico. Los ligamentos uterosacros tratados con condroitinasa tenían menos ácido hialurónico, así como un menor contenido de agua y colágeno. La atención al detalle es muy importante, especialmente cuando se aclara el hecho de que se necesitan depósitos alrededor de la USL y los órganos pélvicos aquí para evitar dañar la USL y sus tejidos circundantes.Se pueden realizar más investigaciones en el USL y otros tejidos del piso pélvico utilizando ratones que tienen variaciones genéticas que hipotetizan que afectan el POP. Nuestro protocolo ya está permitiendo una serie de nuevos estudios, incluida la investigación sobre cómo el comportamiento mecánico de las USL cambia una función del embarazo, que es un factor de riesgo clave para el POP.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aislar las células madre adultas de músculo esquelético tejidos blandos sobre la base de la velocidad de la adhesión de las células para matraz.

Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

Estamos midiendo la sensibilidad y la activación de las células mástil mecánica perigenital en la próstata de macho C57BL / 6 ratones que se sometieron a un paradigma principios de estrés de la vida - la separación materna neonatal, con el fin de inducir un modelo preclínico de síndrome de dolor pélvico / crónica prostatitis crónica.

Evaluación de perigenital Sensibilidad y Prostática mástil activación celular en un modelo de ratón de la separación materna neonatal

Este protocolo describe la implantación de malla en el septo rectovaginal ovino utilizando una única técnica de incisión vaginal, con y sin la inserción guiada por trocar de los brazos de anclaje.

Inserción de mallas transvaginales en el modelo ovino

Aquí presentamos un protocolo para estandarizar la medición de la talla de hiato del levator ani por resonancia magnética. El propósito es extraer inferencias biomecánicas de análisis de imágenes comparando descansando y filtrar valores en pacientes de ambos sexos con Prolapso pélvico, utilizando señales óseas anatómicas consistentes.

Cuantificación de la ampliación de hiato de Ani del Levator por resonancia magnética en hombres y mujeres con prolapso de órganos pélvicos

Este protocolo presenta un método estandarizado para cultivar células VX2 en cultivo y para crear un modelo ortotópico VX2 de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales en conejos. Los modelos de cáncer de endometrio ortotópico son importantes para el estudio preclínico de nuevas modalidades de diagnóstico por imágenes para el diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos.

Un modelo de cáncer de endometrio ortotópico con linfadenopatía retroperitoneal hecha de células VX2 cultivadas y cultivadas en Vivo

Las contracciones uterinas son importantes para el bienestar de las hembras. Sin embargo, el aumento patológicamente de la contractilidad puede resultar en dismenorrea, especialmente en las hembras más jóvenes. Aquí, describimos una preparación ex vivo simple que permite una evaluación rápida de la eficacia de los relajantes musculares lisos que se pueden utilizar para el tratamiento de la dismenorrea.

Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos

Los ganglios pélvicos principales contienen neuronas parasimpáticas y simpáticas que inervan órganos pélvicos. Aquí describimos un método de disección y proporcionamos esquemas para la identificación de estos ganglios y sus nervios asociados. Estos métodos se pueden aplicar a la manipulación experimental de estos ganglios in vivo o eliminación post-mortem para su estudio posterior.

Disección de Ganglia Autonómica Pélvica y Nervios Asociados en Ratas Masculinas y Femeninas

La técnica robótica descrita en este documento tiene como objetivo detallar un enfoque gradual para la escisión mesorrectal total asistida por robot y la disección lateral de ganglios linfáticos pélvicos para el cáncer rectal localmente avanzado (T3 / T4) ubicado debajo de la reflexión peritoneal.

Escisión mesorrectal total asistida por robot y disección lateral de ganglios linfáticos pélvicos para el cáncer de recto medio-bajo localmente avanzado

El prolapso de órganos pélvicos afecta a millones de mujeres en todo el mundo y, sin embargo, algunas intervenciones quirúrgicas comunes tienen tasas de fracaso de hasta el 40%. La falta de modelos animales estándar para investigar esta condición impide el progreso. Proponemos el siguiente protocolo como modelo para la suspensión del ligamento uterosacro y la prueba de tracción in vivo .

Desarrollo de un modelo de rata con suspensión del ligamento uterosacro

Aquí presentamos un enfoque novedoso conocido como pectopexia laparoscópica de cerclaje sin malla con preservación uterina para el prolapso de órganos pélvicos (LNMCPUP) para pacientes que desean preservar su útero. Las suturas de cerclaje permanente se utilizan para suspender el útero al ligamento iliopectíneo a través del ligamento redondo.

Pectopexia laparoscópica de cerclaje sin malla con preservación uterina para el prolapso de órganos pélvicos

Las adherencias intrauterinas (AIU), la consecuencia patológica más común de la lesión endometrial, afectan gravemente la función reproductiva. El trauma y la infección son ampliamente reconocidos como factores de riesgo clave para el desarrollo de AIU. Hemos establecido con éxito un modelo reproducible de AIU en ratas mediante la combinación de dos métodos de lesiones críticas: legrado mecánico e inducción infecciosa con lipopolisacáridos.

Establecimiento de un modelo de rata para adherencias intrauterinas a través de doble lesión: legrado e infección

Aprende a aislar y caracterizar los ligamentos uterosacros murinos manteniendo las conexiones anatómicas con el cérvix, vejiga y recto. Este protocolo establece un modelo preclínico para estudiar el prolapso de órganos pélvicos.

Aislamiento y caracterización de los ligamentos uterosacros murinos y órganos del suelo pélvico

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