Name: Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a cuantificar modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada. Este método permite el cribado de epigenética de alta eficiencia.

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Gracias a Yanyang Bai por ayudar con la inmunotransferencia en la Figura 5. Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud [CRC-RS 950-232402 a AC]; Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 a AC]; la Fundación Benéfica del Rito Escocés [21103 a AC] y la Fundación Brain Canada [AWD-023132 a AC]; Beca de posgrado para aborígenes de la Universidad de Columbia Británica (6481 a MT); Beca de Posgrado de Columbia Británica (6768 a MT); Premio Estudiantil Académico de la Plataforma Abierta de Neurociencia Canadiense (10901 a JK); Beca doctoral de cuatro años de la Universidad de Columbia Británica (6569 a JK). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Cuantificación de la modificación de histonas en el cerebro del ratón mediante citometría de flujo

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
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<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
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<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
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<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
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<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado permite la evaluación cuantitativa de los niveles globales de HPTM a través de la citometría de flujo. Si bien este protocolo presenta un método novedoso, estudios previos han realizado una evaluación cuantitativa de las proteínas utilizando un enfoque similar26. Los métodos anteriores utilizados para evaluar los niveles globales de HPTM incluyen inmunohistoquímica y Western blot 16,17,19,20. El método basado en citometría de flujo presentado es un método fácilmente cuantificable, mientras que el Western blot y la inmunohistoquímica son semicuantitativos y tienen un rendimiento más bajo. El Western blot se basa en la lisis celular y, por lo tanto, requiere tanto la normalización de la proteína como una proteína de control de carga que se supone que no ha cambiado en la condición experimental27. La inmunohistoquímica es semicuantitativa y de muy bajo rendimiento, ya que es difícil evaluar cuantitativamente la cantidad de proteína sin examinarla a nivel de una sola célula16. De manera similar, para la microglía aislada, existe un beneficio en el uso del método de citometría de flujo debido al rendimiento limitado, ya que el Western blot requiere un aporte de proteínas mucho mayor19. Los bajos requisitos de número de células permiten que se ejecuten varios paneles de tinción del mismo animal.
Sin embargo, al igual que con cualquier otro método, esta técnica tiene limitaciones, como el costo y la disponibilidad de anticuerpos, ya que no todos los anticuerpos funcionan bien en un entorno de citometría de flujo. Además, en comparación con el inmunoblot, la concentración de anticuerpos requerida es mucho mayor. Si bien la multiplexación permite el uso de múltiples anticuerpos en el mismo panel de células, las células no pueden ser despojadas del anticuerpo después del análisis, lo que limita el uso de células a una por especie de anticuerpo. Esto es diferente de la inmunotransferencia en la que se puede usar la misma transferencia repetidamente. Sin embargo, dependiendo de la disponibilidad de anticuerpos y del número de canales de detección en un citómetro, sería posible examinar hasta una docena de marcas simultáneamente.
El método actual captura solo los niveles globales de expresión de proteínas y no la ubicación genómica específica, y los cambios en los niveles globales pueden no reflejar los cambios en los loci genómicos individuales. Del mismo modo, la falta de cambios en los niveles globales puede no significar que no haya cambios en los loci genómicos, sino simplemente que los cambios globales no supongan diferencias entre los tratamientos. Como tal, esta técnica está destinada a ser utilizada como una pantalla para identificar HPTM de interés para el análisis genómico. Además, este método no permite la comparación entre diferentes marcas de proteínas, excepto cuando se evalúa como un cambio de pliegue para el control. Por lo tanto, esto es limitado en comparación con un método estándar basado en curvas, como ELISA, para la determinación de proteínas.
El protocolo presentado ofrece una estrategia para aislar la microglía cerebral viva. Este protocolo se basa en la expresión de la proteína P2RY12 para el aislamiento de la microglía. Sin embargo, P2RY12 es un marcador homeostático en la microglía y puede ser regulado a la baja en modelos de enfermedad, como 5XFAD22. Por lo tanto, cuando utilice un animal modelo de enfermedad, asegúrese de elegir otras proteínas marcadoras como TMEM119, CD11b o CD45 para ayudar en el aislamiento de la microglía23. Del mismo modo, presentamos este protocolo como aislamiento del hipocampo y/o de la corteza. Este protocolo funcionaría para aislar la microglía de otras regiones del cerebro, incluidas las regiones de la sustancia blanca, sin embargo, es posible que se requieran varios animales para obtener suficiente microglía dependiendo del tamaño de las regiones de interés.
El protocolo presentado puede aislar de forma robusta la microglía cerebral viva, pero hay varios pasos, que se describen a continuación, en la etapa de aislamiento que pueden disminuir el rendimiento celular si se realiza incorrectamente.
Las perfusiones para este protocolo dan como resultado un mayor porcentaje de microglía en el fragmento enriquecido inmunemente, lo que reducirá la cantidad de tiempo en el clasificador. Sin embargo, no se requiere perfusión, y se pueden usar otros métodos de eutanasia si es necesario.
Durante el aislamiento de la microglía, la mielina debe eliminarse por completo. Los citómetros de flujo dependen de que las células puedan viajar a través de tubos estrechos a un ritmo rápido. Debido a su viscosidad y tendencia a aglutinarse, la mielina causa problemas con los citómetros, a menudo causando obstrucciones que pueden dañar el equipo y destruir la muestra, reduciendo drásticamente el rendimiento. Tenga cuidado de eliminar toda la mielina durante la recolección de fragmentos enriquecidos con el sistema inmunológico para evitar tener problemas en el futuro.
Tinción en placa versus tinción con tubo: en este protocolo, describimos dos opciones para teñir células en tubos de 1,5 ml o en una placa de 96 pocillos. El caso de uso de cada uno depende del experimento; Sin embargo, en general, la tinción con tubos tiene un menor riesgo de afectar el rendimiento que la tinción con placas, ya que el flick corre el riesgo de perder células si se realiza incorrectamente. La tinción en placa es mucho más rápida, ya que aspirar el sobrenadante para cada tubo lleva mucho tiempo. Antes de la fijación (para clasificar, etc.), utilice la tinción del tubo para maximizar el rendimiento y reducir el riesgo de pérdida. Sin embargo, para el análisis HPTM, una vez que las células se fijan para la tinción intranuclear, el gránulo es más estable y se reduce el riesgo de pérdida con el parpadeo.
Establecimiento del gradiente de densidad discontinuo: A la hora de establecer las capas, la correcta disposición de las capas es fundamental para obtener la fracción inmunoenriquecida. Si las capas se alteran o se mezclan y parecen turbias, las células no se clasificarán en la ubicación deseada y habrá dificultades para obtener la fracción celular inmunoenriquecida. Si esto ocurre, centrifugar con el medio de densidad para eliminar la mielina y luego recolectar todas las fracciones restantes, diluir con 3 ml de tampón FACS a 1 ml de medio de densidad y mezclar bien (esto requerirá varios tubos). Girar a 500 x g durante 10 min con el freno en 0. Deseche el sobrenadante, dejando solo ~ 300 μL de solución. Recoja toda la muestra y la mancha. Esto producirá porcentajes de clasificación reducidos y una mayor cantidad de tiempo en el citómetro, pero el rendimiento aún puede ser comparable.
Cuando se utiliza el método de aislamiento, es beneficioso poder recolectar células para ARN y para la evaluación de HPTM del mismo cerebro de ratón. En esta situación, después de clasificar la microglía viva, las células se pueden dividir para asignar una parte a la evaluación del ARN (el número mínimo de células de entrada para obtener un rendimiento decente de ARN es de 75.000 células) y una parte para un análisis posterior de citometría de flujo (mínimo 10.000 células por pocillo para una buena determinación de MFI). En este caso, se requiere la clasificación por citómetro de flujo. Sin embargo, cuando solo se planea usar las células para el análisis de HPTM, no se requiere clasificación y la fracción inmune se puede teñir con el anticuerpo P2RY12 y el anticuerpo HPTM. A continuación, se puede configurar la compuerta del citómetro para la microglía P2RY12+, como se haría para la clasificación de flujo, para analizar solo la señal HPTM dentro de la microglía. La eliminación de la clasificación permite que el protocolo sea más rápido y rentable. Además, si se evalúan HPTM a partir de células cultivadas, basta con comenzar con el protocolo de tinción y no se requieren anticuerpos marcadores celulares, como se muestra en la Figura 6. El protocolo de evaluación HPTM se puede utilizar para muchos tipos de células, incluidas las células cultivadas, primarias y derivadas de IPSC.
Por último, aunque solo hemos presentado dos usos potenciales de la microglía después del aislamiento, hay muchos otros que incluyen técnicas epigenéticas como ChIP, CUT&Tag y CUT&RUN. En el caso de las técnicas epigenéticas genómicas, en las que la caracterización de los cambios en loci específicos es de interés, se deben elegir inhibidores específicos para los escritores y borradores de las marcas de cromatina11 adaptados a los experimentos, a fin de garantizar que las modificaciones epigenéticas microgliales perfiladas no sean artefactos técnicos de ninguna etapa del procedimiento de aislamiento, como la digestión enzimática. Al evaluar los cambios en los niveles globales de marcas epigenéticas, por ejemplo, mediante el uso de citometría de flujo cuantitativa, no se espera que los cambios inducidos por el procedimiento sean tan grandes como para que se detecten a nivel global.
En general, los métodos discutidos proporcionan un método novedoso de una sola célula para cuantificar los niveles globales de modificaciones de histonas y otros cambios epigenéticos mediante citometría de flujo. Demostramos que este método es lo suficientemente sensible como para detectar cambios globales en el marcador potenciador H3K27ac en microglía en respuesta a LPS in vivo. Esto es consistente con la secuenciación previa de ChIP de H3K27ac después de la estimulación de LPS que muestra una remodelación dramática de los potenciadores que responden a LPS28. Las aplicaciones de este método permitirán examinar los cambios epigenéticos globales en diferentes tipos de células cerebrales en desarrollo y enfermedad.

La epigenética es el estudio de los mecanismos que regulan la expresión génica sin alterar la secuencia de ADN subyacente. La regulación epigenética de la expresión génica es dinámica dentro de las células y puede permitir respuestas rápidas y coordinadas a diversos estímulos ambientales. La regulación dinámica ocurre en parte debido a cambios en la estructura de la cromatina a nivel del nucleosoma, que está compuesto por proteínas histonas (H2A, H2B, H3, H4) ensambladas en un núcleo octámero fuertemente enrollado por el ADN1. Las interacciones entre las proteínas histonas y el ADN pueden controlar la accesibilidad del ADN a la maquinaria de transcripción, que en última instancia puede controlar la expresión génica y otros aspectos de la biología de la cromatina. Las proteínas histonas tienen colas desestructuradas que presentan residuos cargados positivamente que forman interacciones electrostáticas con la columna vertebral del ADN cargada negativamente. Estas interacciones dan como resultado un empaquetamiento apretado del ADN y una menor accesibilidad al ADN. Las modificaciones covalentes de las colas de histonas, denominadas modificaciones postraduccionales de histonas (HPTM), pueden regular estas interacciones 3,4. Algunos de los HPTM mejor caracterizados incluyen la acetilación y la metilación de la cola de histonas, que pueden cambiar la afinidad de las interacciones electrostáticas entre las colas de histonas y el ADN, lo que resulta en una accesibilidad diferencial al ADN subyacente y al reclutamiento de factores de transcripción que reconocen estos HPTM en sitios específicos. Los HPTM están regulados por tres clases importantes de enzimas denominadas lectores, que reconocen, escritores, que depositan, y borradores, que eliminan los HPTM. Por lo tanto, el reclutamiento o la disolución de las enzimas lectoras, escritoras o borradoras pueden, en última instancia, cambiar el panorama de las HPTM y gobernar la estructura y función de la cromatina, lo que hace que su regulación y lectura sean esenciales para comprender la biología celular y su función 3,4.
Las células del sistema nervioso central (SNC) son epigenéticamente flexibles, ya que cambian su transcriptoma para adaptarse a los estímulos ambientales. La evidencia acumulada sugiere que los cambios en el epigenoma, como la metilación del ADN, los ARN no codificantes y los HPTM, juegan un papel esencial en la formación de la memoria y la función sináptica5. La interrupción de la dinámica de HPTM a través de la manipulación de los lectores, escritores o borradores relevantes puede bloquear o mejorar el aprendizaje asociativo y la potenciación a largo plazo 6,7,8. La microglía, la célula inmunitaria residente del SNC, regula rápidamente su transcriptoma en respuesta a la estimulación inmunitaria a través de cambios dinámicos en su epigenoma 9,10,11. Este alto nivel de adaptación a su entorno cerebral local hace que sean difíciles de examinar en un contexto aislado, ya que los estudios han demostrado que el epigenoma y el transcriptoma de la microglía se alteran después de unas pocas horas en los medios de cultivo después de la eliminación del entorno cerebral11. Además, dado que la microglía solo constituye el 10% de las células cerebrales, las medidas que examinan los cambios a nivel de todo el tejido carecen de sensibilidad y especificidad12,13. Como resultado, la microglía debe aislarse rápidamente para examinar los cambios epigenéticos, como los niveles de HPTM, ex vivo.
Los métodos comúnmente utilizados para examinar las HPTM incluyen la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) y la escisión bajo objetivos y la secuenciación de marcaje (CUT&Tag-seq)4. Si bien estas técnicas son altamente específicas para un HPTM individual y pueden informar la presencia de HPTM dentro de un contexto genómico específico, solo pueden examinar uno de los muchos HPTM posibles dentro de un solo experimento 11,14 Por lo tanto, antes de proceder con tales experimentos, que requieren una inversión significativa de tiempo y dinero, es muy valioso reducir la lista de HPTM potencialmente interesantes para una mayor investigación, examinando primero los cambios en el mercado global. niveles de HPTM. Los dos enfoques principales para examinar los niveles globales de HPTM son la inmunohistoquímica y el análisis de Western blot, pero ambos enfoques son solo semicuantitativos, de bajo rendimiento y requieren un gran número de secciones de tejido o células aisladas15,16. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar un método cuantitativo altamente sensible que pudiera utilizarse para examinar los niveles globales de HPTM rápidamente y a nivel de célula única.
El protocolo presentado permite la detección rápida de los niveles globales de HPTM mediante citometría de flujo intranuclear. Estudios previos en células cancerosas han justificado la importancia de examinar los niveles globales desde una perspectiva clínica17,18. También es común que los estudios utilicen niveles globales como método de cribado previo a la evaluación de la localización genómica de HPTM específicas de interés19,20. En el caso de la microglía, la evaluación de los niveles globales después del aislamiento es un reto debido al bajo rendimiento celular; Pan et al presentan niveles globales de HPTM a partir de microglía aislada, en la que se agrupó la microglía de tres animales para permitir la detección del nivel de proteínas mediante Western blot19. Utilizando nuestro protocolo, somos capaces de detectar cambios globales con entradas celulares mucho más bajas, lo que permite el cribado de múltiples marcas por animal y elimina la necesidad de agrupar muestras.
Aquí, describimos un protocolo para detectar rápidamente los niveles de HPTM a través de citometría de flujo intranuclear cuantitativa en microglía aislada. Si bien nos enfocamos específicamente en la cuantificación de HPTM en aras de la brevedad, este protocolo se puede usar de la misma manera para cuantificar los niveles globales de enzimas lectoras, escritoras y borradoras. El protocolo se entrega en dos partes: en primer lugar, el método de aislamiento de la microglía y, en segundo lugar, el método basado en citometría de flujo para determinar los niveles de HPTM. El método de aislamiento produce células que se pueden utilizar tanto para el aislamiento de ARN como para la evaluación del nivel de HPTM, lo que permite evaluar la expresión génica y los niveles de HPTM de la misma muestra. Además, el método para la evaluación de HPTM se puede utilizar en otros tipos de células, tal y como se indica en el protocolo.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga Falcon, polipropileno, estéril&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos Placas transparentes no tratadas</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Microplaca de poliestireno transparente, fondo redondo transparente, superficie no tratada</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Acetil Histone 3 K9 (C5B11)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9649S</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Acetilo Histona H4 K8 (2594)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2594S</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Acetil-histona H3 K27 (D5E4)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8173S</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Acetil-histona H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Actinomicina D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histona H3 (tri metilo K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Lactil-Histona H4 (Lys 12) Conejo</td><td>mAb PTM</td><td>PTM-1411RM</td><td>Dilución: 1:250</td></tr><tr><td>Anti-L-Lactilisina Conejo pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>Dilución: 1:250</td></tr><tr><td>Apc anti-P2RY12 Anticuerpo, Clon: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Cyto-Last</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido, estéril</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti Ratón AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>Dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Burro Anti Conejo AlexaFluor488</td><td>ABclonal</td><td>AS035</td><td>Dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Burro Anti Conejo AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Burro Anti Conejo Violeta Brillante 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>Dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia graduadas desechables Fisherbrand</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro PES desechable Fisherbrand, 250 ml;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>H3K18ac Anticuerpo policlonal</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X), sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histona 3 Trimetil K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>KONTES Dounce Trituradoras de Tejidos 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lactil-Histona H3 (Lys 18) Conejo mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>Dilución: 1:250</td></tr><tr><td>Lipopolisacárido&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads Compensaciones</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>PDS Kit, Vial de Papaína - Worthington</td><td>Biochemical Cedarlane LK003178</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Rojo Fenol</td><td>VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAtrituradora</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Partículas fluorescentes arco iris, 1 pico (3,0-3,4 uM - Intensidad de rango medio BioLegend</td><td></td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuge sin RNasa, 1,5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de fondo redondo con tapas, 5 mL</td><td></td><td></td> Triptólido de 352063 <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>Juego de tampones de factor de transcripción nuclear verdadero</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (anti-ratón CD16/32) Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidad Zombie Aqua Fixable BioLegend</td><td></td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

El control de la expresión génica se produce parcialmente por modificaciones en la estructura de la cromatina, incluida la adición y eliminación de modificaciones postraduccionales en las colas de histonas. Las modificaciones postraduccionales de histonas (HPTM) pueden facilitar la expresión génica o la represión. Por ejemplo, la acetilación de los residuos de lisina de la cola de histonas neutraliza la carga positiva y reduce las interacciones entre la cola y el ADN cargado negativamente. La disminución de las interacciones entre la cola de las histonas y el ADN da como resultado una mayor accesibilidad del ADN subyacente, lo que permite un mayor acceso al factor de transcripción. La marca de acetilación también sirve como un sitio de reconocimiento para los activadores transcripcionales que contienen bromodominios, lo que en conjunto da como resultado una mayor expresión génica. Las marcas de histonas pueden regularse dinámicamente durante la diferenciación celular y en respuesta a diferentes entornos y estímulos celulares. Si bien los enfoques de secuenciación de próxima generación han comenzado a caracterizar las ubicaciones genómicas para las modificaciones de histonas individuales, solo se puede examinar una modificación al mismo tiempo. Dado que hay cientos de HPTM diferentes, hemos desarrollado una medida cuantitativa de alto rendimiento de HPTM globales que se puede utilizar para detectar modificaciones de histonas antes de realizar enfoques de secuenciación genómica más extensos. Este protocolo describe un método basado en citometría de flujo para detectar HPTM globales y se puede realizar utilizando células en cultivo o células aisladas de tejidos in vivo . Presentamos datos de ejemplo de microglía cerebral de ratón aislada para demostrar la sensibilidad del ensayo para detectar cambios globales en HPTM en respuesta a un estímulo inmunológico derivado de bacterias (lipopolisacárido). Este protocolo permite la evaluación rápida y cuantitativa de HPTMs y se puede aplicar a cualquier regulador transcripcional o epigenético que pueda ser detectado por un anticuerpo.

Los ratones adultos fueron perfundidos transcardialmente y sacrificados para el aislamiento de la microglía. Las microglías se aislaron en hielo y se tiñeron con P2RY12-APC y 525 anticuerpos vivos muertos violetas. Las células que se determinaron como positivas para P2RY12 y negativas para la tinción violeta 525 de muertos vivos se clasificaron como microglía viva. El rendimiento medio de la microglía de un cerebro de ratón disecado fue de 1,28 x 105 ± 0,05 (media ± error estándar de la media (SEM), N = 100). No hay diferencia en el rendimiento de microglía de ratones hembra (1,25 x 105 ± 0,09 [media ± SEM, N=46]) y machos (1,32 x 105 ± 0,07 [media ± SEM, N=54]) (t(98)=0,6365, p=0,526). Cuando se aísla de regiones cerebrales específicas, el rendimiento medio de la microglía de las cortezas de ratón es de 8,3 x 104 ± 0,08 (media ± SEM, N = 15) y del hipocampo de ratón es de 4,1 x 104 ± 0,02 (media ± SEM, N = 16). Como era de esperar, existe una diferencia significativa en el rendimiento de la microglía de cada región del cerebro (F(2, 128)=25.25, P&lt;0.0001). Tras el aislamiento de la microglía, se extrajo el ARN de las células aisladas utilizando un kit de aislamiento de ARN de baja entrada. Consistentemente, la puntuación de integridad del ARN (RIN) fue superior a 9,0 (9,62 ± 0,05) y el rendimiento medio de ARN por célula fue de 0,25 ± 0,01 pg (media ± SEM, N=32; Expediente Complementario S2).
A los ratones adultos se les inyectó intraperitonealmente 1 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) 24 h antes del sacrificio. Los ratones se perfundieron transcardíacamente con HBSS y se aisló la microglía de todo el cerebro de acuerdo con el protocolo descrito (Figura 5A). Para cada tinción, se asignaron entre 20.000 y 30.000 células a cada panel de anticuerpos. Los niveles globales de acetilación de la histona 3 lisina 27 (H3K27Ac) se evaluaron en microglía aislada mediante citometría de flujo. Para ratones machos y hembras, el tratamiento con LPS indujo un aumento de H3K27Ac cuando la IMF se normaliza dentro del sexo (t(6)=9.676, p&lt;0.0001; Figura 5B). Al examinar los histogramas de las células teñidas, las poblaciones se distribuyen normalmente con una variación similar; sin embargo, las células han cambiado a un aumento de la fluorescencia, lo que resulta en el aumento de MFI (Figura 5C). Al examinar H3K9Ac en el mismo tratamiento, hay un aumento similar en H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figura 5D, E), sin embargo, el cambio de pliegue de LPS en relación con PBS de la señal H3K9Ac es menor que la señal H3K27Ac.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Figura 5: Cambios globales en la acetilación de histonas en microglía aislada. (A) A los ratones se les inyecta por vía intraperitoneal solución salina tamponada con fosfato (PBS) o 1 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) 24 h antes del sacrificio. La microglía se recolecta de la fracción inmunoenriquecida y se fija para la citometría de flujo y la evaluación de la modificación postraduccional global de histonas. La mediana de la intensidad fluorescente se evalúa como un indicador de la expresión de proteínas. Creado con BioRender.com. (B) Los niveles globales de H3K27Ac aumentaron en respuesta al tratamiento con LPS. El cambio de pliegue a PBS se normalizó dentro del experimento y el sexo. Prueba t de dos colas no apareadas, t(6)=9.676, p&lt;0.0001. El gráfico de barras representa la media ± SEM. N=8 animales; 2 por condición en 2 experimentos independientes. (C) Ejemplos de histogramas que representan el cambio de la intensidad fluorescente de H3K27Ac. El modal representa histogramas de ratones inyectados con PBS frente a ratones inyectados con LPS. (D) Ejemplos de histogramas que representan el cambio de la intensidad fluorescente de H3K9Ac. El modal representa histogramas de ratones inyectados con PBS frente a ratones inyectados con LPS. (E) Los niveles globales de H3K9Ac aumentaron en respuesta al tratamiento con LPS. El cambio de pliegue a PBS se normalizó dentro del experimento y el sexo. Prueba t de dos colas no apareadas, t(6)=7,299, p=0,0003. El gráfico de barras representa la media ± SEM. N=8 animales; 2 por condición en 2 experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para confirmar que el método descrito era comparable a otros métodos utilizados anteriormente para la cuantificación global de la modificación de histonas, nos propusimos utilizar el inmunoblot como herramienta comparativa. Sin embargo, el rendimiento de la microglía aislada es simplemente demasiado bajo para permitir una evaluación razonable. Por lo tanto, utilizamos células BV2 cultivadas para comparar el método de citometría de flujo intracelular con un Western blot (WB). Las células BV2 se cultivaron en medios completos (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicilina/estreptamicina y 1x L-glutamina) a 37 °C, 5% CO2. Las células se hicieron pasar con tripsina-EDTA al 0,25% y se sembraron a una densidad de 250.000 células/pocillo y se trataron en medios séricos reducidos (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicilina/estreptamicina y 1x L-glutamina) y se dejaron recuperar durante 12 h a 37 °C, 5% CO2. Las células se trataron con 25 ng/mL de LPS durante 24 h antes de la fijación, como se ha descrito anteriormente, o con lisis con un tampón de lisis WB. La señal de H3K27Ac se realizó por ambos métodos con GAPDH utilizado como control de carga para WB. Para cada grupo se determinó el análisis de la intensidad fluorescente normalizada en comparación con el control PBS (Figura 6A). Al examinar el cambio en la señal H3K27Ac normalizada por WB, hubo un aumento de 1,527 veces en la condición tratada con LPS en relación con el control H2O, que se determinó como significativo mediante la prueba t no apareada (t = 3,024, df = 5; p = 0,0293). Al examinar el cambio mediante citometría de flujo, hubo un aumento de 1,482 veces en la condición tratada con LPS que se determinó como significativa (t = 7,843, df = 10; p&lt;0,0001). Utilizando un ANOVA de 2 vías para comparar los métodos, se determinó que había un efecto significativo del tratamiento (F(1,15)=45,21,p&lt;0,0001), pero no del método (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) ni de la interacción (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Además, aquí verificamos que no hay cambios en los niveles de histonas H3 tanto por Western blot como por citometría de flujo, ya que el ANOVA de 2 vías no reveló ningún efecto significativo del tratamiento con LPS (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), el método (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) o la interacción (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figura 6B). También se muestran ejemplos de manchas y cambios de histograma para estos datos (Figura 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Figura 6: Comparación de métodos para la cuantificación del cambio global de modificación de histonas entre citometría de flujo y Western blot. (A) Las células BV2 se tratan con 25 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) oH2O durante 24 h antes del análisis. La intensidad fluorescente de H3K27Ac se representa como un cambio de pliegue en el control del vehículo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), tanto para la citometría de flujo como para la Western blot. El ANOVA de 2 vías reveló un efecto significativo del tratamiento con LPS (F(1,15)=45,21, p&lt;0,0001), pero no del método (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) ni de la interacción (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Para los residuos se aplicó la corrección de Tukey para la prueba de hipótesis múltiples. * presenta 0,0332, ** presenta 0,0021. (B) La intensidad fluorescente de la histona H3 se representa como un cambio de pliegue a PBS tanto para la citometría de flujo como para la Western blot. El ANOVA de 2 vías no reveló ningún efecto significativo del tratamiento con LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) ni del método (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ni de la interacción (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Se muestran ejemplos de transferencias y (D) cambios en la citometría de flujo. El tamaño del histograma se normaliza al porcentaje en función del número de células presentes en la intensidad fluorescente del modo. El gráfico de barras representa la media SEM. n=2 experimentos independientes, 2 por condición por experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En conjunto, estos resultados muestran que esta técnica se puede utilizar para evaluar cuantitativamente los niveles globales de HPTM en microglía aislada. Además, se demostró que el método era comparable a las técnicas anteriores, pero que requería entradas de células mucho más bajas. Además, aunque no se ha demostrado, con una compensación adecuada, la presente técnica se puede utilizar con múltiples anticuerpos en el mismo panel evaluando diferentes HPTM.
Archivo complementario S1: Archivos de análisis de ejemplo. Este archivo contiene un archivo de análisis wsp y 7 archivos fcs que incluyen el sin tinción, P2RY12FMO, 568FMO, dos animales tratados con PBS y dos animales tratados con LPS teñidos con H3K27Ac. El propósito de este archivo es demostrar el análisis y la activación de un experimento que podría representar cómo se veía un experimento exitoso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario S2: Datos de aislamiento. El archivo incluido contiene los datos relevantes después de la clasificación de la microglía que contiene el rendimiento de microglía y ARN del protocolo descrito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>POBLACIÓN CERRADA</td>
			<td>Frecuencia de los padres</td>
			<td>Frecuencia de Total</td>
			<td>Contar</td>
		</tr><tr><td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2&gt;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ &gt; APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: El gráfico de linaje de muestra de ejemplo muestra los números de porcentaje y eventos necesarios para una detección precisa de proteínas.

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Nuestra investigación tiene como objetivo comprender los mecanismos reguladores fundamentales que controlan la expresión génica en el cerebro, y estamos particularmente interesados en comprender cómo la interrupción de estos mecanismos contribuye a las afecciones neuropsiquiátricas y del neurodesarrollo. Nos enfocamos en comprender cómo los factores de riesgo genéticos y ambientales se combinaron para alterar la función celular y producir alteraciones del comportamiento. Este protocolo incluye métodos para el cribado de alto rendimiento de las modificaciones de histonas en microglía aislada, lo que nos permite cribar docenas de modificaciones epigenéticas diferentes antes de comprometernos con la secuenciación de alto rendimiento y los estudios de seguimiento funcional.Nuestro protocolo proporciona medidas de modificaciones globales de histo similares a la trama occidental. Sin embargo, nuestra técnica es más rápida, requiere menos celdas de entrada, es más cuantitativa y se puede multiplexar.

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Investigación

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Neurociencia

Este protocolo describe un método para cultivar neuronas primarias del hipocampo a partir del cerebro embrionario del ratón. La expresión de la clase I importante del complejo de la histocompatibilidad en la superficie extracelular de neuronas cultivadas entonces es evaluada por análisis cytometric del flujo.

Evaluación De La Expresión Del Complejo De Histocompatibilidad Mayor Clase I En Las Neuronas Primarias Murinas Del Hipocampo Por Citometría De Flujo

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

Este protocolo combina la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular para aislar y caracterizar los estados de las células microgliales en el cerebelo de los cerebros de ratones postnatales tempranos. Utiliza la disociación enzimática, la centrifugación de Percoll y la inmunotinción para revelar la heterogeneidad de la microglía y mejorar la comprensión de sus funciones en el desarrollo y la enfermedad del cerebelo.

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

La citometría de flujo es una herramienta poderosa que permite el aislamiento y estudio de poblaciones celulares específicas. Este protocolo describe los pasos para aislar células que expresan LacZ a partir de tejidos cocleares de ratones transgénicos neonatos. Las células cocleares disociadas se marcaron utilizando sustratos conjugados con fluoróforos de β-galactosidasa antes de la separación mediante citometría de flujo.

Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Describimos un protocolo que permite la purificación del compartimento vascular del cerebro del ratón. Los vasos cerebrales aislados incluyen células endoteliales unidas por uniones estrechas y rodeadas por una lámina basal continua, pericitos, células musculares lisas vasculares, así como membranas astrogliales perivasculares.

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Análisis cuantitativo de contenido de la celda dentro del nervio ciático murino es difícil debido a la escasez del tejido. Este protocolo describe un método para la digestión del tejido y la preparación que proporciona suficientes células para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células inmunitarias de los nervios de los ratones.

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Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

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El propósito de este artículo es proporcionar a una guía completa y sistemática a la purificación eficiente de las histonas H3 y H4 y la cuantificación de residuos de histona acetilado.

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Aprende a cuantificar modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada. Este método permite el cribado de epigenética de alta eficiencia.

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Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

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