Name: Caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario Clytia hemisphaerica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a caracterizar la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando Clytia hemisphaerica como organismo modelo. Este método permite visualizar la dinámica celular durante la reparación tisular en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.E.L.L. cuenta con el apoyo de una subvención de la National Science Foundation PRFB 2011010. Nos gustaría agradecer a Tsuyoshi Momose y Evelyn Houliston por ayudarnos a establecer nuestras colonias de Clytia, a Jean-Baptiste Reynier por la recopilación de las imágenes de curación de microheridas, a Harry Kyriazes por la construcción de los tanques pseudo-kreisel y a Elizabeth Baldo por mantener el hábitat de Clytia. La Figura 1B fue creada con BioRender.com.

Nada que revelar.

Aquí, se presenta la metodología para obtener imágenes de heridas in vivo en Clytia, un organismo modelo de invertebrados relativamente nuevo40,43,58. Hay varios factores que hacen de este sistema una herramienta de investigación única y poderosa, distinta de otros modelos utilizados para estudiar la cicatrización de heridas y la reepitelización. Primero, el epitelio monocapa se une a una ECM transparente, por lo tanto, se asemeja a los ensayos de cultivo de tejidos in vitro (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4). Al igual que en los ensayos in vitro, las células se pueden visualizar en alta resolución. Sin embargo, a diferencia del cultivo de tejidos, existe un entorno celular auténtico y ECM, por lo que la cicatrización de heridas se puede ver en el contexto de los complejos eventos de señalización que ocurren en un animal vivo lesionado. En segundo lugar, Clytia carece de respuestas inflamatorias, fibroblastos migratorios, vasculatura y sangre. Esto permite que el proceso de reepitelización sea estudiado in vivo en ausencia de los eventos superpuestos que ocurren en animales adultos más complejos durante la cicatrización de heridas59. En tercer lugar, el ECM es acelular (Película suplementaria 1) y grande, lo que permite un fácil acceso con una aguja de microinyección (Figura 5 y Figura 6). Usando este enfoque, los investigadores pueden probar el efecto de los reactivos farmacológicos que perturban la estructura o señalización de la ECM en la cicatrización de heridas in vivo. Los reactivos también se pueden introducir en las células epiteliales, y se pueden evaluar sus efectos sobre la cicatrización de heridas in vivo. En cuarto lugar, existen protocolos para la creación de mutantes y animales transgénicos en el sistema Clytia42,43,44,45. Por lo tanto, la cicatrización de heridas in vivo se puede observar en animales con expresión aumentada/disminuida de genes de interés.
Hay varios pasos críticos en esta técnica. Primero, como se muestra en la Figura 3, es necesario usar un microscopio que esté configurado correctamente para la microscopía DIC ya que las células epiteliales planas y transparentes son casi invisibles con la microscopía óptica estándar. También es importante desarrollar la habilidad de herir a los animales suavemente para que el epitelio se dañe sin arrancar la ECM. Un toque igualmente suave es necesario para microinyectar materiales en la ECM, ya que el daño extenso al animal durante la inyección podría comprometer un análisis posterior de la cicatrización de heridas. Si bien hay una curva de aprendizaje para estas técnicas, incluso los estudiantes principiantes las han dominado rápidamente en el laboratorio de Malamy. De hecho, estos protocolos se han utilizado para demostrar la migración celular en cursos de laboratorio de pregrado en la Universidad de Chicago.
Para obtener imágenes óptimas, es importante que el animal no se mueva y que el área de la herida elegida no se desvíe del campo de visión. Si los animales están pulsando, el tratamiento con tricaína como se describe es muy eficaz. Para la deriva, a menudo es necesario reposicionar manualmente la muestra. Estos movimientos se pueden eliminar de la película final utilizando la función de registro en FIJI/ImageJ.
Una limitación con este sistema es que no es posible crear heridas idénticas, ya que las heridas varían tanto en forma como en tamaño utilizando los métodos descritos aquí. Por lo tanto, puede ser difícil cuantificar la tasa exacta de cierre de heridas o migración celular. Los marcadores posicionales, como los granos de carbono, se adhieren a la ECM expuesta en un animal herido y se pueden usar para medir la tasa de migración celular colectiva en heridas grandes (no se muestra). Para el análisis de cierre de heridas pequeñas, incluso con tamaño y forma variables de la herida, existe un rango limitado de tasas de cierre entre las heridas de este tamaño (Figura 4). Por lo tanto, es posible detectar cuantitativamente los efectos de los reactivos farmacológicos propositivos o represivos.
Si bien este trabajo describe la caracterización de la cicatrización de heridas utilizando solo microscopía DIC, se pueden usar los mismos enfoques para la curación de imágenes utilizando microscopía fluorescente o confocal. Para ayudar en esto, existen protocolos para generar animales transgénicos en los que varias proteínas celulares y extracelulares están marcadas con fluorescencia. Las imágenes concurrentes con CID y fluorescencia, combinadas con la perturbación de la cicatrización de heridas utilizando agentes farmacológicos o líneas mutantes, serán un enfoque poderoso para comprender los mecanismos que subyacen al proceso de cicatrización de heridas en el epitelio.

Las láminas de células epiteliales cubren la superficie externa de todos los metazoos, alinean los órganos internos y dividen el cuerpo animal en compartimentos discretos. El epitelio también separa el cuerpo interno del ambiente externo y lo protege del daño y la infección. Por lo tanto, el advenimiento de las capas epiteliales fue una parte esencial de la evolución de los animales multicelulares, y las capas epiteliales se ven en todos los animales, desde los vertebrados hasta los metazoos más basales1. El epitelio de algunos órganos es una sola monocapa, como en los sacos de aire pulmonares, los vasos sanguíneos y el intestino2, así como en la epidermis de invertebrados como planaria y cnidarios3. En otros tejidos, como la piel4 y la córnea5 de los vertebrados, el epitelio está estratificado, lo que significa que hay múltiples capas de células epiteliales2. En todos los casos, la capa epitelial más basal está fijada a la membrana basal, una lámina de proteínas que forma una región especializada de la matriz extracelular (MEC)6,7,8.
Las brechas en el epitelio deben repararse rápidamente para recrear una lámina epitelial continua. El daño al epitelio ocurre durante procesos naturales, como el desprendimiento de células epiteliales en el intestino,9,10 y como resultado de una inflamación o trauma físico. Cuando una sola célula epitelial está dañada, debe repararse a sí misma o eliminarse para permitir que las células circundantes se unan entre sí y cierren el orificio11,12. En heridas más grandes que el tamaño de una sola célula, las células epiteliales deben moverse para alcanzarse entre sí y reparar la lámina13. Esto puede lograrse mediante la diseminación celular si las brechas son pequeñas o pueden requerir la migración de células epiteliales desde los márgenes de una herida para cerrar la brecha de la herida; Este último proceso se denomina reepitelización14,15. En los tejidos embrionarios, las células epiteliales se diseminan y migran para cerrar heridas o son arrastradas a través del espacio por la contracción de los cables de actomiosina que se forman entre las células en el margen de la herida, en un mecanismo que se asemeja a una cuerda de monedero16. En muchos tejidos adultos, la reepitelización implica la migración de láminas celulares coherentes, donde las células mantienen sus uniones con las células vecinas14,17,18. En otros tejidos, las conexiones célula-célula se desmantelan y las células epiteliales se comportan más como células mesenquimales, moviéndose de manera coordinada pero independiente hacia la región de la herida durante la reepitelización 14,19,20,21.
Los movimientos de las células epiteliales están regulados por interacciones complejas entre las células migratorias y entre las células y la ECM. Si bien existe una enorme cantidad de literatura experimental que aborda los mecanismos de activación de heridas de las células epiteliales y la posterior migración, aún queda mucho por descubrir. Por ejemplo, la señal inicial que activa las células epiteliales para migrar en respuesta a una herida no ha sido identificada definitivamente 22, ni se entiende completamente cómo se redistribuye la actina para crear lamelipodos en el lado de las células epiteliales más cercano a la herida 22,23,24,25,26,27. La migración celular colectiva requiere que la información de las células en la herida sea compartida con las células distales a la herida, y la vía de comunicación aún no está clara28. Las uniones célula:celda y celda:ECM deben desmontarse y reformarse a medida que las células de la lámina se reorganizan, pero la regulación de este proceso es poco conocida14,29. Avanzar en estas y otras preguntas relacionadas no solo es importante como problema biológico fundamental, sino también por la importancia clínica de la correcta cicatrización de heridas. Las enfermedades que comprometen la capacidad de las células epiteliales para migrar correctamente resultan en heridas crónicas; un ejemplo es la enfermedad genética epidermólisis ampollosa, donde los genes implicados en la unión de las células epiteliales a la ECM están mutados, dando lugar a una piel frágil que se despega y ampolla. La reepitelización también está comprometida en los tejidos naturalmente envejecidos30,31. Por lo tanto, una mejor comprensión es esencial para desarrollar intervenciones que mejoren los resultados de cicatrización de heridas.
La migración de células epiteliales en la cicatrización de heridas se ha estudiado utilizando enfoques in vitro y organismos modelo. La mayoría de los estudios de cicatrización de heridas y mecanismos de migración celular se han llevado a cabo en cultivo de tejidos, donde se cultivan monocapas de un solo tipo de célula epitelial sobre un sustrato que sustituye a la ECM. Las monocapas celulares se rayan o se cultivan con plantillas para crear huecos de formas y tamaños específicos y luego se observan32,33,34. El modelo in vitro permite una visualización ideal del comportamiento celular, así como la oportunidad de cambiar las cualidades del sustrato, exponer las células a fármacos y factores abióticos y bióticos, y transfectar células con construcciones que expresan o suprimen varios genes de interés. Sin embargo, este enfoque reduccionista puede no capturar algunos de los parámetros importantes involucrados en el comportamiento de las células epiteliales en un contexto in vivo, incluida la comunicación entre varios tipos de células y los eventos de señalización que ocurren en la ECM11. Los modelos in vivo proporcionan el contexto auténtico de una herida, con múltiples tipos de células, vías de señalización superpuestas y una ECMcompleja 35. Uno de estos modelos para estudios de cicatrización de heridas es el ratón19, en el que los avances recientes han permitido a los investigadores observar las células epidérmicas durante la cicatrización de heridas de espesor total en animales vivos36. Sin embargo, el ratón y otros sistemas in vivo presentan desafíos para estudiar la reepitelización. En primer lugar, la gran ventaja de observar el comportamiento celular en un contexto natural se equilibra con la complejidad de los eventos temporalmente superpuestos que ocurren durante la cicatrización de heridas de vertebrados, incluida la coagulación de la sangre, el reclutamiento de células inmunes y la inflamación, el reclutamiento de fibroblastos y la desdiferenciación celular, la revascularización y la remodelación de la ECM. Además, los tejidos opacos dificultan la obtención de imágenes. Los sistemas de epidermis de larva de Drosophila y pez cebra 37,38 han superado algunas de estas dificultades debido a su relativa simplicidad 39.
Nuestro laboratorio introdujo recientemente un nuevo modelo para estudiar la cicatrización de heridas epiteliales: la forma medusa (medusa) del cnidario hidrozoario Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia es un organismo modelo emergente con un genoma41 completamente secuenciado y anotado, un transcriptoma RNAseq unicelular42 y protocolos establecidos para la modificación del genoma (mutagénesis y transgénesis)43,44,45. Los cnidarios son uno de los linajes existentes más antiguos que tienen capas epiteliales, por lo que comprender la curación de heridas cnidarias proporciona información sobre las vías ancestrales que aseguraron la integridad epitelial. Para aquellas vías que se han conservado a lo largo del árbol de la vida, Clytia ofrece un nuevo y emocionante sistema para estudiar la dinámica de las células epiteliales y la regulación funcional de la cicatrización de heridas in vivo.
El epitelio que cubre la superficie superior de la Clytia medusa (exumbrella) es una monocapa de células epiteliales escamosas transparentes que miden aproximadamente 50 μm de ancho por 1-2 μm de espesor (Figura 1). Están unidos a una ECM llamada mesoglea, la "gelatina" de la medusa. La mesoglea es composicionalmente similar a la ECM encontrada en otros animales 46,47,48 incluyendo vertebrados, tiene una membrana basal 40, y es completamente transparente. La capa epitelial en la Clytia medusa puede ser fácilmente rayada o herida (ver más abajo). La simplicidad y transparencia del epitelio y la ECM permiten obtener imágenes de alta resolución de las células y sus movimientos durante la curación. Recientemente, Kamran et al. caracterizaron la cicatrización de pequeñas heridas en el epitelio de Clytia en detalle40. Se demostró que la curación en Clytia ocurre a través del rastreo celular basado en lamelipodios, la propagación celular y la migración celular colectiva, así como el cierre de la cuerda de la bolsa que es más típico de los sistemas embrionarios (aunque se vio anteriormente en estructuras de animales adultos como la córnea49). La cicatrización de heridas de Clytia es extremadamente rápida, como se ha visto en otros sistemas que carecen de una respuesta inflamatoria40,50. La curación en el exumbrella de Clytia depende completamente de los movimientos de las células epiteliales existentes: ninguna célula prolifera o migra a través de la ECM al sitio de la herida (Película suplementaria 1). Todos estos hallazgos sugieren que Clytia es un sistema modelo útil para estudiar la cicatrización de heridas epiteliales. De hecho, la facilidad de obtener imágenes de las células epiteliales en Clytia durante la cicatrización de heridas llevó al descubrimiento de que los lamellipodia de células epiteliales se extienden y se extienden sobre áreas de ECM expuestas siempre que haya una membrana basal intacta; Si la membrana basal está dañada, la curación epitelial cambia a un mecanismo de cuerda de monedero40. Esta fue la primera demostración de un mecanismo subyacente a la decisión de cerrar por rastreo basado en lamellipodia versus cierre de cuerda de bolsa, destacando la importancia de las interacciones específicas célula: ECM en la curación y de la observación de las células en su contexto natural.
A continuación, se describen los protocolos para crear e imágenes de microheridas unicelulares, heridas pequeñas que se cierran principalmente por propagación celular y heridas grandes que requieren migración celular colectiva para cerrarse. Además, se describe un protocolo para la introducción de moléculas pequeñas en la ECM y las células epiteliales, lo que permite perturbaciones experimentales de las vías reguladoras putativas de la cicatrización de heridas.

<table><tbody><tr><td>20500 ACE EKE Microscopio Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Kramer Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono</td><td>ZEISS</td><td>426557-0000-000-MA285</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW1004</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Abcam</td><td>ab143482</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de depresión</td><td>Amscope</td><td>BS-C12</td><td></td></tr><tr><td>DMR con opciones DIC y lámpara halógena de fluorescencia</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoato metanosulfonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16520-06</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Biotium</td><td>70022</td><td>Excitación/Emisión: 480/598 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Excitación/Emisión: 361/497 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Puntas</td> del microcargador <td>imageJ NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0.5-10 &mu; L /2-20 &mu; L)</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>3301R / M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de microscopio de vidrio (22X40-1.5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-BP</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB085713A</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Neumático PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Vacío de policarbonato, desecador</td><td>Bel-art</td><td>F42025-0000</td><td></td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMI Sv11 Osciloscopio de disección</td><td>ZEISS</td><td>STEMI SV11</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184</td><td>Dow Silicones</td><td>1024001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Z-Hab mini sistema</td><td>Pentair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN Software de microscopía</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario clytia hemisphaerica

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Todos los órganos animales, desde la piel hasta los ojos y los intestinos, están cubiertos con láminas de células epiteliales que les permiten mantener la homeostasis mientras los protegen de la infección. Por lo tanto, no es sorprendente que la capacidad de reparar heridas epiteliales sea crítica para todos los metazoos. La cicatrización de heridas epiteliales en vertebrados implica procesos superpuestos, incluidas las respuestas inflamatorias, la vascularización y la reepitelización. La regulación de estos procesos implica interacciones complejas entre las células epiteliales, las células vecinas y la matriz extracelular (ECM); la ECM contiene proteínas estructurales, proteínas reguladoras y moléculas pequeñas activas. Esta complejidad, junto con el hecho de que la mayoría de los animales tienen tejidos opacos y ECM inaccesibles, hace que la cicatrización de heridas sea difícil de estudiar en animales vivos. Por lo tanto, gran parte del trabajo en la cicatrización de heridas epiteliales se realiza en sistemas de cultivo de tejidos, con un solo tipo de célula epitelial plateada como una monocapa en una matriz artificial. Clytia hemisphaerica (Clytia) proporciona un complemento único y emocionante a estos estudios, permitiendo estudiar la cicatrización de heridas epiteliales en un animal intacto con una ECM auténtica. El epitelio ectodérmico de Clytia es una sola capa de grandes células epiteliales escamosas, lo que permite obtener imágenes de alta resolución utilizando microscopía de contraste diferencial interferente (DIC) en animales vivos. La ausencia de fibroblastos migratorios, vasculatura o respuestas inflamatorias permite diseccionar los eventos críticos en la reepitelización in vivo. Se puede analizar la curación de varios tipos de heridas, incluidas microheridas unicelulares, heridas epiteliales pequeñas y grandes y heridas que dañan la membrana basal. La formación de lamelipodios, la contracción de la cuerda de la bolsa, el estiramiento celular y la migración celular colectiva se pueden observar en este sistema. Además, se pueden introducir agentes farmacológicos a través de la ECM para modificar las interacciones célula:ECM y los procesos celulares in vivo. Este trabajo muestra métodos para crear heridas en Clytia vivo, capturar películas de curación y sondear mecanismos de curación mediante la microinyección de reactivos en la ECM.

Siguiendo los protocolos anteriores, se tomaron imágenes de microheridas unicelulares, heridas pequeñas y heridas grandes. Las pilas registradas de archivos de imagen se guardaron como archivos .avi.
En la película 1, se puede ver que las microheridas se cierran entre y dentro de las células (Figura 1 y Figura 2). Se observan pequeños lamellipodia durante el cierre, seguidos de contracción y curación. Los desechos se excluyen y se liberan en el agua. La curación se completa en un minuto o menos.
En las películas 2 y 3, pequeñas heridas de diferentes formas se curan a través de la formación de lamellipodia, la extensión de los contactos lamellipodiales y la propagación de células en el margen de la herida, como se describió anteriormente40 (Figura 1 y Figura 2). Las células en niveles detrás de las células marginales no participan en la curación de heridas de este tamaño ni hay migración celular colectiva. El cierre rápido y progresivo de las brechas epiteliales es seguido por la contracción del tejido a lo largo de la costura de la herida recién formada40. Se muestra la tasa normalizada de cicatrización de estas dos heridas, expresada como porcentaje del área original a lo largo del tiempo (Figura 4C, D). Si bien existe cierta variabilidad en la dinámica del cierre de heridas, promediar el porcentaje de cierre del área a lo largo del tiempo para 14 heridas de varias formas que van desde 0.02-0.125 mm2 permite el establecimiento de una curva promedio para la cicatrización de heridas en animales no tratados (Figura 4E).
El daño a la membrana basal se puede ver claramente cuando ocurre (Figura 2). En la película 4, las células en el margen de una pequeña herida en la que hay daño en la membrana basal se extienden alrededor del área dañada, y el cierre de la brecha se completa con una contracción de la cuerda del bolso.
Si el tejido está deshidratado o demasiado dañado para repararlo, los movimientos celulares pueden detenerse o toda la lámina de células puede estallar (Película 5 y Película 6). Esto generalmente ocurre después de largos períodos de imágenes (45 minutos o más). Si el estallido celular ocurre temprano en la toma de imágenes, la muestra se descarta.
Como se muestra en la película 7, las heridas grandes sanan en varias etapas. En primer lugar, el borde de la herida se vuelve liso y regular debido a las contracciones en el margen, como se informó anteriormente57. Luego, se observa que los lamellipodia se forman a partir de las células en el margen de la herida, con lamellipodia avanzando para maximizar el contacto con lamellipodia adyacente. El seguimiento de los núcleos en las células en el margen de la herida y varios niveles detrás de las células marginales muestra que grandes brechas se cierran por la migración celular colectiva40. Las células nunca se desprenden, sino que se mueven juntas como una hoja.
La introducción de colorantes y agentes farmacológicos puede ser una herramienta poderosa para diseccionar mecanismos biológicos. Muchas sustancias están excluidas de Clytia (no se muestra), probablemente debido a la capa de moco que recubre la superficie del animal. Sin embargo, la microinyección se puede utilizar para introducir moléculas directamente en la ECM, interrumpiendo la estructura de la ECM o perturbando las actividades reguladoras en la ECM. Además, los colorantes y otras moléculas pueden ingresar a las células epiteliales desde el lado basal. Por ejemplo, la Figura 6 muestra tinción nuclear con Hoechst, tinción de membrana con FM1-43 e inhibición de la formación de lamellipodia por citocalasina B después de que estos reactivos se microinyectan en la ECM. La introducción de estas moléculas en la ECM y las células epiteliales antes de la herida permite experimentos que prueban el efecto de las herramientas farmacológicas en el proceso de curación.
<img alt="Dinámica de la membrana celular; contraste de interferencia diferencial, microscopía de fluorescencia; comparación experimental." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Células epiteliales de la medusa tras microinyección de colorantes o agentes farmacológicos. (A) Células epiteliales mostradas en el panel superior 5 min después de la inyección con 20 μM Hoechst (núcleos) y 50 μM FM1-43 (membranas). (B,C) Cicatrización de heridas después de la inyección con 1:1.000 DMSO control (B) o 100 μM de citocalasina B (C). Las heridas se hicieron 15 minutos después de la inyección. Las imágenes fueron tomadas 5 min después de la herida. La formación de lamellipodia es inhibida por la citocalasina B. Se cree que las "fibras" aparentes que a menudo se ven entre las células en el área de la herida son el resultado de la tensión que estira la membrana basal: no se tiñen con faloidina (no se muestra). Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película 1: Película de lapso de tiempo de curación de microheridas de una sola célula. Tiempo transcurrido: 20 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 2: Película de lapso de tiempo de una pequeña cicatrización de herida epitelial. Tiempo transcurrido: 9 min 54 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 3: Película de lapso de tiempo de una pequeña herida epitelial que cicatriza. Esta herida es más grande y de forma más irregular que la herida en la película 2. Tiempo transcurrido: 20 min 54 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 4: Película de lapso de tiempo de una pequeña herida y una cicatrización de microherida con un desgarro de la membrana basal. Los lamellipodia se extienden alrededor del desgarro de la membrana basal, aunque pueden avanzar sobre el resto de la ECM. Una vez que se rodea la región de la herida con el daño de la membrana basal, una contracción de la cuerda del bolso tira de las células sobre la región. Tiempo transcurrido: 19 min 4 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 5: Células muriendo en una pequeña herida epitelial. La muerte celular es probablemente debido a la deshidratación del animal. Tiempo transcurrido: 4 min 24 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 6: Una pequeña herida epitelial no logra completar la curación. Tiempo transcurrido: 42 min 32 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Película 7: Cicatrización de heridas epiteliales grandes. Tiempo transcurrido: 25 min 29 s. Velocidad de fotogramas: 10 fps. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Figura suplementaria 1: Esquemas de dimensiones del tanque Clytia. Visualización 3D de los tanques Clytia hechos a medida. (A) Vista frontal y trasera. (B) Vista lateral. El recorte en la pieza que se muestra en verde está cubierto con malla de nylon. El agua entra en el tanque directamente sobre la malla, barre sobre la malla y crea una corriente circular. El agua sale del sistema a través del orificio en la pieza final que se muestra en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Película suplementaria 1: Matriz extracelular acelular en Clytia. Pila Z de Clytia tomada con microscopía confocal. La pila se enfoca inicialmente en el exumbrella y luego escanea cada 10 μm a través de la ECM hasta el endodermo y el subparaguas de la placa. Las imágenes que usan DIC (izquierda) y tinción nuclear de Hoechst (derecha) demuestran la falta de células en la ECM. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este artículo describe un método para crear heridas en el epitelio de una Clytia hemisphaerica medusa viva e imágenes de cicatrización de heridas a alta resolución in vivo. Además, se presenta una técnica para introducir colorantes y fármacos para perturbar los procesos de señalización en las células epiteliales y la matriz extracelular durante la cicatrización de heridas.

Caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

Este protocolo permite la visualización de células epiteliales durante la cicatrización de heridas en animales vivos. Nos permite ver cómo se comportan las células en su complejo entorno natural. Esta técnica introduce reactivos en la matriz extracelular y el citoplasma celular para estudiar el efecto de estos reactivos en la propagación y migración celular durante la cicatrización de heridas en animales vivos.La cicatrización de heridas epiteliales y Clytia se parece notablemente a la curación en animales más complejos. Por lo tanto, podemos aprender mucho de este sistema sobre los mecanismos de curación de heridas y cómo se originaron. Demostrando estos procedimientos estarán Elizabeth Lee y la técnica de investigación Emily Watto.Para comenzar el proceso de herido, prepare una pipeta de transferencia modificada cortando la punta de la pipeta con tijeras, creando una abertura ampliada que mide aproximadamente 0.5 a 0.7 centímetros de diámetro. Usando la pipeta de transferencia modificada, coloque la medusa recolectada de las colonias de pólipos establecidas en un portaobjetos de depresión, con el paraguas Medusa X hacia arriba. Asegúrese de que solo una cantidad suficiente de agua de mar artificial, o ASW, cubra al animal.Para crear micro heridas dentro y entre las células, coloque un cubreobjetos sobre el animal. El cubreobjetos comprime la mesoglea y el rebote del tejido comprimido fuerza a las células ligeramente separadas. Imagen del animal inmediatamente para observar las micro heridas creadas.Para crear pequeñas heridas epiteliales, coloque la medusa en un portaobjetos de depresión con el paraguas Medusa X hacia arriba, utilizando una pipeta de transferencia modificada, como se demostró anteriormente. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, raye suavemente la superficie de la medusa. El rascado suave puede crear rasgaduras en la membrana basal.Cubra al animal con un cubrebocas para obtener imágenes. Colocar el cubreobjetos a veces es suficiente para crear pequeñas heridas epiteliales incluso sin rascarse. Prepare una aguja de microinyección, utilizando un pilar de micropipeta y un tubo capilar de vidrio, siguiendo los pasos descritos en el texto.Coloque la aguja de microinyección vacía en un soporte de microinyección fijado a un micromanipulador y corte la punta de la aguja, de modo que la abertura sea de aproximadamente 20 a 40 micras. Ajuste la presión de retención en el microinyector a cero y la presión de eyección a aproximadamente 20 libras por pulgada cuadrada. Ajuste el microinyector para que emita un pulso de aire de dos segundos.Para crear grandes heridas epiteliales, coloque la medusa en un portaobjetos de depresión, como se demostró anteriormente. Usando el micromanipulador, ajuste la punta de la aguja de microinyección para que permanezca justo por encima del agua, sumergiendo cuidadosamente la punta en el agua y luego retrayéndola de tal manera que esté cerca de la superficie epitelial de la medusa. Pulse el aire presionando el botón de arranque en el inyector.Repita el pulso en el mismo lugar de dos a cuatro veces, dependiendo del ancho de la punta. Las puntas más grandes requieren menos pulsos. Cubra al animal herido con un cubreobjetos para obtener imágenes de heridas grandes.Ajusta el enfoque al paraguas x. Las celdas hexagonales deben ser claras. Identifique manualmente una herida para obtener una imagen de ella.Inicie un programa que recopile imágenes como una película en tiempo real, o uno que recopile una serie de imágenes a intervalos regulares. Supervise el progreso para asegurarse de que el área de la herida no se desvíe del campo de visión y que las células de interés permanezcan enfocadas. Para inyectarse tintes y drogas, haga una aguja de microinyección siguiendo los pasos descritos en el texto.Rellene la aguja de microinyección con una punta de pipeta larga con un exceso de volumen de tinte o medicamento para inyección en la medusa. Usando una pipeta de transferencia modificada, coloque una medusa con el subparaguas hacia arriba en el polidimetilsiloxano, o plato de inyección PDMS, con el ASW suficiente para cubrir al animal. Coloque el plato en una etapa de un microscopio de disección.Concéntrese en la punta de la aguja de microinyección y avance hacia el agua cerca de la medusa. Con el micromanipulador, presione la aguja en el plato hasta que se doble y se rompa. Creación de una abertura de punta de aproximadamente 10 a 20 micras.Usando el micro manipulador, inserte la punta de la aguja a través del subparaguas en la mesoglea sin perforar el paraguas X. En el microinyector, ajuste la presión de retención a cero y la presión de inyección por debajo o igual a 20 libras por pulgada cuadrada. Inyecte en uno o dos cuadrantes, llenando cada uno con una mancha de tinte o droga aproximadamente una cuarta parte del área de ese cuadrante.Dependiendo del tinte o droga que se inyecte, los animales se colocan en un vaso de precipitados de ASW fresco para permitir la difusión e incubación del tinte o la droga. Para obtener imágenes, monte la medusa en un portaobjetos de depresión con una pipeta de transferencia modificada, colocando al animal con el paraguas X hacia arriba. Los animales pueden ser heridos en esta etapa para probar el efecto de un reactivo inyectado.Las micro heridas dentro y entre las células formaron pequeños lamellipodia durante el cierre de la herida. Esto fue seguido por la contracción, y las heridas sanaron en menos de un minuto. Las pequeñas heridas epiteliales también se curaron a través de la formación de lamellipodia y la extensión de los contactos de lamellipodia.El cierre rápido y progresivo de la herida precedió a la contracción del tejido a lo largo de la costura de la herida recién formada. La tasa de cicatrización normalizada de dos heridas pequeñas expresada como porcentaje del área total de la herida a lo largo del tiempo indicó cierta variabilidad en la dinámica de cierre de la herida. Se utilizaron datos de 14 heridas diferentes para establecer una curva de cicatrización media de heridas en animales no tratados.En una pequeña herida que tiene daño en la membrana basal, las células marginales se extienden alrededor del área dañada y la brecha se cierra con una contracción de la cuerda del bolso. Cuando el tejido estaba deshidratado o demasiado dañado para repararlo, los movimientos celulares podían detenerse o toda la lámina de células podía estallar. Grandes heridas curadas en varias etapas.El alisamiento del borde después de las contracciones en el margen, la formación de lamellipodia y la extensión de los contactos de lamellipodia en la migración celular colectiva en, y varios niveles celulares lejos de, el margen cerró grandes brechas. La tinción nuclear y de membrana se logró mediante la microinyección de los reactivos en la ECM. La microinyección de citocalasina B inhibió la formación de lamellipodia después de la herida.Maneje a los animales con cuidado. Al inyectar reactivos, asegúrese de que la punta de la aguja de microinyección esté en la mesoglea y no haya atravesado completamente al animal. Actualmente, los animales transgénicos se están haciendo con proteínas de marcado fluorescente, la fluorescencia combinada y la microscopía de contraste interferente diferencial darán una imagen aún más clara de los eventos celulares en la cicatrización de heridas epiteliales.

characterizing-epithelial-wound-healing-vivo-using-cnidarian-model

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La piel adulta de C. elegans es un modelo manejable para estudios de las respuestas epiteliales a las heridas, incluyendo el cierre de la herida, la formación de cicatrices y la inmunidad innata.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en C. elegans

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

Aquí se describe el establecimiento de un modelo de cirugía de catarata simulada ex vivo clínicamente relevante que se puede utilizar para investigar los mecanismos de la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales dentro de su microambiente nativo.

Establecimiento de un punto de vista clínico relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Catarata Mock Modelo de Cirugía en Investigando epitelial reparación de heridas en un microambiente Nativo

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

La poliploidización inducida por heridas es una estrategia de reparación de tejido conservada donde las células crecen en tamaño en lugar de dividirse para compensar la pérdida celular. Aquí hay un protocolo detallado sobre cómo utilizar la mosca de la fruta como modelo para medir la ploidy y su regulación genética en la reparación epitelial de heridas.

Un modelo de Drosophila para estudiar la poliploidización inducida por heridas

Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.

Modelo de cicatrización de heridas excisionales de Murine y análisis de heridas morfométricas histológicas

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

El presente protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Las córneas regeneradoras o completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.

Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos

Este protocolo se centra en dañar la superficie ocular del pez cebra a través de la abrasión para evaluar el posterior cierre de la herida a nivel celular. Este enfoque explota una rebaba ocular para eliminar parcialmente el epitelio corneal y utiliza microscopía electrónica de barrido para rastrear los cambios en la morfología celular durante el cierre de la herida.

Cicatrización de heridas corneales de pez cebra: de la abrasión al análisis de imágenes de cierre de heridas

Aquí, describimos un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa Cladonema. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo con un marcador de células madre permite la detección de células madre, y el etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina permite la identificación de células en proliferación. Juntas,  se pueden detectar células similares a la proliferación activa.

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum

Aprende a caracterizar la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando Clytia hemisphaerica como organismo modelo. Este método permite visualizar la dinámica celular durante la reparación tisular en tiempo real.

Caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario Clytia hemisphaerica

Explorar más videos