Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Este método nos ayudará a revelar las propiedades electrofisiológicas y los mecanismos de los frotis de parada ventricular asociados a enfermedades como la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Con esta técnica, podemos obtener el potencial de membrana y las señales de calcio intercelular simultáneamente bajo varios protocolos de estimulación eléctrica programada, lo que es especialmente adecuado para explorar los mecanismos subyacentes y la dinámica de la enfermedad arrítmica cardíaca como la TVPC. Para realizar este experimento con éxito, asegúrese de tener un corazón bien perfundido, una carga de tinte adecuada, un desacoplamiento de excitación-contracción y una configuración cuidadosa de la cámara.

Para comenzar, configure el sistema de mapeo óptico y encienda la cámara para obtener una temperatura de muestreo estable a menos 50 grados Celsius. Coloque el corazón de ratón cosechado en la solución fría de CREB para ralentizar el metabolismo y proteger el corazón. Extirpar el tejido circundante de la aorta.

Use una aguja de canulación hecha a medida para canularlo y fíjelo con una sutura de seda 4-0. Ahora perfunde el corazón con el sistema Langendorff a una velocidad constante de 3,5 a 4,0 mililitros por minuto. Inserte un pequeño tubo de plástico en el ventrículo izquierdo para liberar la congestión de la solución en la cámara para evitar la sobrecarga y fije el tubo de plástico en la aguja de canulación.

A continuación, coloque dos cables en la perfusión de la bañera y encienda las potencias de la caja del amplificador del electrocardiograma y del controlador de estimulación eléctrica. A continuación, inicie el software de electrocardiograma o ECG al que se hace referencia y controle continuamente el ECG. Realice los pasos siguientes en la oscuridad cuando el corazón alcance una condición de estado estable.

Perfundir la mezcla de solución de blebbistatina CREBs constantemente en el corazón durante 10 minutos para desacoplar la contracción de la excitación y evitar artefactos de contracción durante la filmación. Luego, con una linterna roja, examine el corazón para confirmar el cese completo de las contracciones. Perfundir el corazón con la solución de trabajo Rhod-2 AM durante 15 minutos en el sistema de perfusión de Langendorff después de desacoplar la contracción de la excitación.

Mantener el suministro de oxígeno durante la carga intracelular del colorante de calcio. Para evitar la formación de burbujas del F-127 plurónico, inserte una trampa de burbujas en el sistema de perfusión. Diluir 10 microlitros de solución madre RH 237 en 50 mililitros de perfusión y cargar durante 10 minutos.

Al completar la carga de tinte dual, capture una secuencia de fotos. Confirme que las señales de voltaje y calcio son adecuadas para el análisis. Encienda los dos LED para las luces de excitación y ajuste su intensidad a un rango adecuado.

Coloque el corazón debajo del dispositivo de detección, asegurándose de que esté bien iluminado por los dos LED que ajustan el diámetro del punto de luz a dos centímetros. Establezca la distancia de trabajo entre la lente y el corazón en 10 centímetros para lograr la frecuencia de muestreo y la resolución espacial deseadas. Abra el software de muestreo de señal para controlar simultáneamente la cámara y capturar señales de voltaje y calcio.

Inicie el estimulador de campo MyoPacer y establezca el patrón de estimulación en la lógica del transistor de transistores con dos milisegundos de duración de estimulación por pulso. Ajuste la intensidad inicial a 0,3 voltios. Coloque un par de electrodos de platino unidos al epicardio del ápice del ventrículo izquierdo.

Aplique 30 estímulos consecutivos S1 de 10 hercios para probar el umbral de voltaje diastólico del corazón utilizando el software de registro de ECG. Aumente gradualmente la amplitud del voltaje hasta lograr la captura uno a uno. Implementar el protocolo S1-S1 para medir el calcio o las alternativas de potencial de acción y las propiedades de restitución.

Marca el ritmo del corazón consecutivamente a partir de una duración básica del ciclo de 100 milisegundos. Disminuya la duración del ciclo en 10 milisegundos en cada secuencia posterior hasta que alcance los 50 milisegundos. Iniciar simultáneamente el mapeo óptico antes de la estimulación.

Para medir el período refractario efectivo ventricular utilizando el protocolo de estímulo S1-S2, comience con una duración del ciclo de estimulación S1-S1 de 100 milisegundos. Acople S2 a los 60 milisegundos y disminuya con una disminución de paso de dos milisegundos hasta que S2 no pueda capturar el complejo QRS ectópico. Para la inducción de arritmias, administre estimulación de ráfaga perpetua de 50 hercios y realice el mismo episodio de estimulación después de esperar un intervalo de dos segundos de reposo.

Monitoree cuidadosamente las grabaciones del electrocardiograma durante el período continuo de estimulación de alta frecuencia para comenzar rápidamente las grabaciones simultáneas de mapeo óptico cuando se genere una onda arrítmica interesante. Proceda a capturar imágenes utilizando la cámara del dispositivo acoplado a la carga multiplicadora de electrones. En el software de adquisición de imágenes, presione Seleccionar carpeta y cargue imágenes para comenzar el proceso semiautomático de análisis masivo de datos de video.

Introduzca los parámetros de muestreo correctos para el análisis. Establezca manualmente el umbral de la imagen y seleccione la región de interés. Aplique un filtro espacial gaussiano de tres por tres píxeles, un filtro de Savitzky-Golay y una corrección de línea de base de sombrero de copa.

A continuación, pulse Imágenes de proceso para eliminar la línea de base y calcular parámetros electrofisiológicos como APD-80 y CATD-50. Establezca el tiempo de inicio de la duración del potencial de acción en el pico y el punto terminal en 80% de repolarización para calcular APD-80. De manera similar, defina el tiempo de inicio de la duración transitoria del calcio como el pico, siendo el punto terminal el 80% de relajación.

Se muestran trazas típicas en los mapas de calor de APD-80 y CATD-80. El isoproterenol acorta el APD-80 y los ratones de tipo salvaje y taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica o CPVT, pero no se encontraron diferencias después de la exposición con isoproterenol. Los ratones CATD-80 y CPVT fueron más prolongados que en el tipo salvaje después de la provocación con isoproterenol, mientras que no hubo significación antes del tratamiento.

De acuerdo con las señales de voltaje, los corazones de tipo salvaje y CPVT poseían la misma capacidad de conducción a través del epicardio al inicio y después de la intervención con isoproterenol. Los mapas de calor demostraron que los ratones CPVT tienen la misma capacidad de conducción que los ratones de tipo salvaje antes y después del desafío con isoproterenol. El análisis de alternativas de amplitud de calcio mostró que las señales de calcio en los corazones de tipo salvaje se mantuvieron estables al inicio durante la estimulación consecutiva S1-S1 a 14,29 y 16,67 hercios, mientras que los corazones CPVT mostraron alternancias dependientes de la frecuencia.

Después de la provocación con isoproterenol, los corazones de CPVT mostraron alternancias dependientes de la frecuencia y señal de calcio durante la estimulación S1-S1, mientras que los corazones de tipo salvaje no se vieron afectados. El análisis de arritmias taquimétricas sugirió que tanto los corazones de tipo salvaje como los de CPVT exhiben una conducción normal durante la estimulación de ráfagas de 50 hercios al inicio del estudio. Después de la profusión con isoproterenol, los corazones de CPVT mostraron rotores de alta frecuencia después de una estimulación de ráfaga de 50 hercios, mientras que los corazones de tipo salvaje mantuvieron la conducción normal.

Siguiendo este procedimiento, se utilizan ratones de tipo adogen y ratones de tipo salvaje para ilustrar las propiedades electrofisiológicas y funcionales en estos modelos o en la invención de productos farmacéuticos. El mapeo óptico es una herramienta poderosa para el estudio de arritmias cardíacas, sin embargo, no se puede utilizar clínicamente debido a la limitación del colorante fluorescente bajo el desacoplamiento de la excitación y la contracción. Con el desarrollo de fluorescentes adecuados para diferentes moléculas objetivo bajo el desarrollo de la tecnología de computación de altas revoluciones, la técnica de mapeo óptico cardíaco está destinada a lograr solo aplicaciones.