Name: Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende el mapeo óptico de doble colorante para estudiar arritmias cardíacas en corazones de ratón con taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Este método permite registrar simultáneamente voltaje transmembrana y calcio intracelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81700308 a XO y 31871181 a ML, y 82270334 a XT), el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología (CN) de la provincia de Sichuan (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 y 2022YFS0607 a XT, y 2022NSFSC1602 a TC) y el Laboratorio Estatal Clave de Química e Ingeniería Molecular de Recursos Medicinales (Universidad Normal de Guangxi) (CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE en Oxford (ML) subvenciones.

Para los experimentos se utilizaron ratones machos de tipo salvaje de 10 a 14 semanas de edad o ratones RyR2-R2474S/+ (fondo C57BL/6) con un peso de 20-25 g. Todos los procedimientos han sido aprobados por el comité de cuidado y uso de animales de la Universidad Médica del Sudoeste, Sichuan, China (aprobación NO:20160930) de conformidad con las directrices nacionales bajo las que opera la institución.
1. Preparación
<ol><li>Soluciones de stock<ol><li>Solución madre de blebistatina: Añadir 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% en el matraz original que contiene 2,924 mg de (-) blebbistatina en polvo hasta alcanzar una concentración de 10 mM.</li>
		<li>Indicador de voltaje RH237 solución madre: Añadir 1 mL de DMSO al 100% en el matraz original con 1 mg de polvo RH237 para lograr una concentración de 2,01 mM.</li>
		<li>Solución madre indicadora de calcio Rhod-2 AM: Agregue 1 mL de DMSO al 100% en 1 mg de polvo Rhod-2 AM para alcanzar una concentración de 0.89 mM.</li>
		<li>Solución madre de Pluronic F127: Añadir 1 ml de DMSO al 100 % en 200 mg de Pluronic F127 para alcanzar una concentración del 20 % p/v (0,66 mM).</li>
		<li>Aliquotar las soluciones madre en tubos de PCR de 200 μL en 21-51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM y 51 μL de blebbistatina) para uso único o doble para evitar la congelación y descongelación repetidas. A continuación, envuelva las soluciones con papel de aluminio y guárdelas a -20 °C, excepto la solución madre Pluronic F127 colocada en una habitación oscura a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de perfusión<ol><li>Solución de Krebs (en mM): Prepare 1 L de solución de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 y glucosa 10).</li>
		<li>Filtrar la solución con un filtro de aguja aséptico de 0,22 μm y oxigenar con 95% Ø 2/5% CO2.</li>
		<li>Tome 40 ml de solución de Krebs en un tubo centrífugo de 50 ml y guárdelo a 4 °C para el aislamiento cardíaco de seguimiento.</li>
	</ol></li>
	<li>El sistema de perfusión y el dispositivo de mapeo óptico de Langendorff<ol><li>Configure el sistema de perfusión de Langendorff.<ol><li>Abra el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 °C.</li>
			<li>Lavar el sistema de perfusión Langendorff con 1 L de agua desionizada.</li>
			<li>Perfundir la solución del tracto de admisión y ajustar la velocidad de salida a 3,5-4 ml/min. A continuación, oxigenar la perfusión con gas O 2/CO2 (95%/5%) a 37 °C. NOTA: Nunca se permite una burbuja en el sistema de perfusión.</li>
		</ol></li>
		<li>Prepare el sistema de mapeo óptico.<ol><li>Instale la cámara del dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD), la cámara (512 × 512 píxeles), la lente (aumento de 40x), los diodos emisores de luz (LED) divisores de longitud de onda, el monitor de electrocardiograma (ECG) y el electrodo de estimulación (Figura 1).</li>
			<li>Ajuste la distancia de trabajo adecuada desde la lente hasta la posición del corazón.</li>
			<li>Coloque dos LED en la posición diagonal del baño termostático para una iluminación uniforme, proporcionando una longitud de onda de 530 nm para generar luz de excitación. Utilice un filtro con recubrimiento catódico ET525/50 para eliminar cualquier luz fuera de banda de los LED.</li>
			<li>Ajuste el interruptor de la manija para lograr un cuadrado igual de la superficie objetivo, haciendo que las imágenes de voltaje y calcio aparezcan adecuadamente en la interfaz de adquisición.</li>
			<li>Gire la apertura de la lente al diámetro máximo para evitar cualquier fuga de señales de voltaje o calcio.</li>
			<li>Ajuste la lente de la cámara a una altura adecuada, ya que sirve una distancia de trabajo fina al baño termostático, se usa principalmente 10 cm.</li>
			<li>Encienda la cámara para obtener una temperatura de muestreo estable a -50 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Procedimientos
<ol><li>Extracción de corazón de ratón, canulación y perfusión<ol><li>Inyectar intraperitonealmente a los animales con solución de avertina (1,2%, 0,5-0,8 mL) y heparina (200 unidades) para minimizar el sufrimiento y el reflejo del dolor y prevenir la formación de coágulos sanguíneos. Después de 15 minutos, sacrifique a los animales por luxación cervical.</li>
		<li>Abra el cofre con unas tijeras, extraiga el corazón con cuidado y colóquelo en la solución fría de Krebs (4 °C, 95%Ø2, 5% CO2) para ralentizar el metabolismo y proteger el corazón.</li>
		<li>Extraer el tejido circundante de la aorta, canular la aorta con una aguja de canulación hecha a medida (diámetro exterior: 0,8 mm, diámetro interior: 0,6 mm, longitud: 27 mm) y fijarla con una sutura de seda 4-0.</li>
		<li>Perfundir el corazón con el sistema Langendorff a una velocidad constante de 3,5-4,0 mL/min y mantener la temperatura a 37 ± 1 °C. NOTA: Todos los procedimientos posteriores se realizan en esta condición.</li>
		<li>Inserte un pequeño tubo de plástico (0,7 mm de diámetro, 20 mm de longitud) en el ventrículo izquierdo para liberar la congestión de la solución en la cámara y evitar la sobrecarga.</li>
	</ol></li>
	<li>Desacoplador de excitación-contracción y carga de doble colorante<ol><li>Coloque dos cables en la perfusión en el baño, encienda las potencias de la caja del amplificador de ECG y el controlador de estimulación eléctrica, y luego inicie el software de ECG de referencia y monitoree el ECG continuamente.</li>
		<li>Realice los pasos siguientes en la oscuridad cuando el corazón alcance una condición de estado estable (el corazón late rítmicamente a ~ 400 lpm).</li>
		<li>Mezcle 50 μL de solución madre de blebbistatina de 10 mM con 50 mL de solución de Krebs para alcanzar una concentración de 10 μM. Perfunda constantemente la mezcla de solución de blebbistatina-Krebs en el corazón durante 10 minutos para desacoplar la contracción de la excitación y evitar artefactos de contracción durante la filmación.</li>
		<li>Use una linterna roja para verificar si la contracción del corazón se detiene por completo, ya que la contracción influirá en la calidad de la carga de tinte.</li>
		<li>Después de desacoplar la excitación-contracción, mezcle 15 μL de solución madre Rhod-2 AM con 15 μL de solución madre Pluronic F127 en 50 ml de solución Krebs para lograr las concentraciones finales de 0,267 μM Rhod-2 AM y 0,198 μM Pluronic F127. A continuación, perfundir el corazón de forma continua con la solución de trabajo Rhod-2 AM durante 15 minutos en el sistema de perfusión de Langendorff.</li>
		<li>Mantenga el suministro de oxígeno durante la carga del colorante de calcio intracelular. Dado que las burbujas se forman fácilmente en Pluronic F127, inserte una trampa de burbujas en el sistema de perfusión para evitar la embolización gaseosa de las coronarias.</li>
		<li>Diluir 10 μL de solución madre RH237 en 50 mL de perfusión para alcanzar la concentración final a 0,402 μM y realizar la carga durante 10 minutos.</li>
		<li>Al final de la carga de doble colorante, tome una secuencia de fotos para asegurarse de que tanto las señales de voltaje como las de calcio sean adecuadas para el análisis (sin interacción entre dos señales).</li>
	</ol></li>
	<li>Mapeo óptico e inducción de arritmias NOTA: El mapeo óptico comienza después del cese de la contracción y una carga de tinte adecuada, y el corazón se perfunde consecutivamente como en los pasos descritos anteriormente en 2.1 (4).<ol><li>Encienda los dos LED para las luces de excitación y ajuste su intensidad en un rango adecuado (lo suficientemente fuerte para la iluminación y una filmación relativamente sencilla, pero no demasiado robusto para la sobreexposición).</li>
		<li>Coloque el corazón debajo del dispositivo de detección, asegúrese de que esté bajo la iluminación adecuada de dos LED y ajuste el diámetro del punto de luz a 2 cm.</li>
		<li>Ajuste la distancia de trabajo desde la lente hasta el corazón en 10 cm, lo que proporciona una frecuencia de muestreo de casi 500 Hz y una resolución espacial de 120 x 120 μm por píxel.</li>
		<li>Abra el software de muestreo de señal para controlar la cámara digitalmente y capturar señales de voltaje y calcio simultáneamente.</li>
		<li>Inicie el estimulador de campo miopacer y establezca el patrón de estimulación en Lógica de transistor de transistores (TTL), 2 ms de duración de estimulación para cada pulso y 0,3 V como intensidad inicial.</li>
		<li>Utilice 30 estímulos consecutivos de 10 Hz S1 para probar el umbral de tensión diastólica del corazón impulsado por el software de registro de ECG. Aumente gradualmente la amplitud del voltaje hasta que se realice la captura 1:1 (verifique la onda QRS del monitor de ECG, el potencial de acción (AP) y las señales transitorias de calcio (CaT).</li>
		<li>Después de determinar el umbral de voltaje, marque el ritmo del corazón a una intensidad de 2 veces el umbral de voltaje diastólico con un par de electrodos de platino conectados al epicardio del ápice del ventrículo izquierdo (VI).</li>
		<li>Implementar el protocolo S1S1 para medir el calcio o el potencial de acción de las alternativas y las propiedades de restitución. Mantenga el ritmo del corazón consecutivamente a una duración de ciclo básico de 100 ms, disminuyendo 10 ms de la duración del ciclo cada secuencia siguiente hasta alcanzar los 50 ms. Cada episodio incluye 30 estímulos consecutivos con un ancho de pulso de 2 ms. Al mismo tiempo, inicie el mapeo óptico antes de la estimulación (el tiempo de muestreo incluye ~ 10 ritmos sinusales y la duración de la estimulación).</li>
		<li>Para medir el período refractario efectivo (ERP) ventricular mediante el protocolo de estímulo S1S2, comience con una duración del ciclo de estimulación S1S1 de 100 ms con un S2 acoplado a 60 ms con una disminución de paso de 2 ms hasta que S2 no pueda capturar el complejo QRS ectópico.</li>
		<li>Para la inducción de arritmias, realice estimulación continua perpetua de 50 Hz (50 estimulaciones eléctricas continuas con un ancho de pulso de 2 ms) y realice el mismo episodio de estimulación después de un intervalo de reposo de 2 s.</li>
		<li>Observe cuidadosamente los registros de ECG durante el período continuo de estimulación de alta frecuencia para que los registros de mapeo óptico simultáneos puedan comenzar rápidamente cuando se genere una onda de ECG arrítmica interesante (dado que la mayoría de las arritmias cardíacas son inducidas por estimulación eléctrica, las señales ópticas se muestrean 2-3 s antes de la estimulación de ráfaga en caso de pérdida de eventos cardíacos importantes).</li>
		<li>Imagen con cámara EMCCD (frecuencia de muestreo: 500 Hz, tamaño de píxel: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol><li>Carga de imágenes y procesamiento de señales<ol><li>Presione Seleccionar carpeta y cargar imágenes para cargar las imágenes en el software de adquisición de imágenes para el análisis de datos de video masivo semiautomático de acuerdo con la configuración y el protocolo descritos anteriormente15,16.</li>
			<li>Introduzca los parámetros de muestreo correctos (como el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas).</li>
			<li>Establezca el umbral de la imagen mediante la entrada manual y seleccione la región de interés (ROI).</li>
			<li>Implemente un filtro espacial gaussiano de 3 x 3 píxeles, un filtro Savitzky-Goaly y una corrección de línea de base de sombrero de copa.</li>
			<li>Pulse Imágenes de proceso para eliminar la línea de base y calcular los parámetros electrofisiológicos, como APD80 y CaTD50.</li>
		</ol></li>
		<li>Análisis de parámetros electrofisiológicos<ol><li>Establezca el tiempo de inicio de APD en el pico y el punto terminal en 80% de repolarización (APD80) para el cálculo de APD80. Del mismo modo, la hora de inicio de CaTD se define como el pico, y el punto terminal se define como la relajación del 80%.</li>
			<li>La medición de la velocidad de conducción (CV) depende del tamaño del píxel y del tiempo de conducción del potencial de acción entre dos píxeles o más. Calcule la velocidad promedio de todos los píxeles elegidos: esta es la velocidad media de conducción de la región seleccionada. Genere simultáneamente los mapas isócronos correspondientes para obtener una visión clara de la dirección de conducción. NOTA: O'Shea et al.15 reportaron la medición CV en detalle.</li>
			<li>Para el análisis de alternancias y arritmias, las alternancias de calcio se definen como una amplitud de pico grande y pequeña continua que aparece alternativamente. Utilice la relación de amplitud de pico para evaluar la gravedad de las alternancias dependientes de la frecuencia (1-A2/A1). Aplicar mapas de fase para analizar arritmias complejas como la taquicardia ventricular (TV). Busque los rotores que aparecen claramente en una región específica a medida que los rotores se desplazan.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li>
<li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+%28RyR2%29+gene+in+genetically+modified+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li>
<li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Ca2%2B+homeostasis%2C+atrial+arrhythmogenesis%2C+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).</li>
<li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+%28hRyR2%29+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li>
<li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CACNA1C-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).</li>
<li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+%28CALM3-A103V%29+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li>
<li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li>
<li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2%2B+release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li>
<li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger%3A+molecular+partners+in+pacemaker+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ElectroMap%3A+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).</li>
<li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool%2C+%28-%29-blebbistatin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li>
<li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li>
<li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Basándonos en nuestra experiencia, las claves para un mapeo óptico de doble colorante exitoso de un corazón de ratón incluyen una solución y un corazón bien preparados, la carga de colorante, lograr la mejor relación señal-ruido y reducir el artefacto de movimiento.
Preparación de la solución La solución de Krebs es esencial para el éxito de un experimento cardíaco. Las soluciones madre de MgCl 2 y CaCl2 (1 mol/L) se preparan de antemano teniendo en cu...

La taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) se manifiesta como episodios de taquicardia ventricular polimórfica (TVP) después de la actividad física, el estrés o la provocación con catecolaminas, que pueden deteriorarse hasta convertirse en una fibrilación ventricular potencialmente mortal 1,2,3,4 . La evidencia reciente después de su primer informe como un síndrome clínico en 1995 implicó mutaciones en siete genes, todos involucrados en la liberación de Ca2+ del almacén reticular sarcoplásmico (SR) en esta condición: el receptor de rianodina 2 (RyR2) que codifica el receptor de rianodina 2 (RyR2) de los canales de liberación de Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 que codifica la calsequestinacardíaca 8, TRDN codificando la proteína SR de unión triadina 9, y CALM1 9, CALM2 10 y CALM3 codificando de manera idéntica la calmodulina11,12. Estos patrones genotípicos atribuyen los eventos arrítmicos a la liberación patológica no regulada del almacén de SR Ca2+12.
La liberación espontánea de Ca 2+ de SR se puede detectar como chispas de Ca 2+ u ondas de Ca 2+, lo que activa el intercambiador de Na+/Ca 2+ (NCX). El intercambiador de un Ca2+ por tres Na+ genera una corriente hacia adentro, que acelera la despolarización diastólica y conduce el voltaje de la membrana al umbral del potencial de acción (AP). En ratones knock-in de RyR2, el aumento de la actividad de RyR2R4496C en el nódulo sinoauricular (SAN) conduce a una disminución imprevista de la automaticidad de la SAN por la disminución dependiente de Ca 2+ de la depleción de ICa,L y SR Ca2+ durante la diástole, identificando alteraciones fisiopatológicas subcelulares que contribuyen a la disfunción de la SAN en pacientes con CPVT13,14. La aparición de las ondas Ca 2+ citosólicas cardiomiocíticas relacionadas es más probable después de los aumentos en el citosólico de fondo [Ca2+] después de la sensibilización a RyR por catecolamina, incluido el isoproterenol (ISO).
Quedan por determinar los cambios cinéticos detallados en la señalización de Ca 2+ después de la liberación de Ca2+ mediada por RyR2 en respuesta a la activación del potencial de acción (PA) que puede ser la causa de las arritmias ventriculares observadas en modelos de CPVT cardíaca intacta para toda la gama de genotipos de RyR2 notificados12. Este artículo presenta la configuración de la instrumentación y el procedimiento experimental para el mapeo de alto rendimiento de las señales de Ca2+ y los potenciales transmembrana (Vm) en corazones murinos de tipo salvaje (WT) y heterocigotos RyR2-R2474S/+, combinados con estimulación eléctrica programada antes y después del desafío con isoproterenol. Este protocolo proporciona un método para el estudio mecanicista de la enfermedad CPVT en corazones aislados de ratón.

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu; m filtro de jeringa</td><td>Fábrica de equipos médicos de Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>Para filtrar la solución</td></tr> tubo <tr>de<td>centrífuga de 15 mL</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011150</td><td></td>pipeta</tr><tr><td>Pasteur de 1 mL</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Tubo de PCR</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote las soluciones de stock &nbsp; para evitar la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50</td><td>mL Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011500</td><td>Tienda Tyrode solución a 4 &deg; C para el aislamiento cardíaco de seguimiento</td></tr><tr><td>Filtro de 585/40 nm</td><td>Tecnología Chroma</td><td>N/A</td><td>Filtro para señal de calcio</td></tr><tr><td>Filtro de paso largo de 630 nm</td><td>Tecnología Chroma</td><td></td><td>G15604AJ Filtro para señal de voltaje</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Reino Unido</td><td>T48402-100G</td><td>Para minimizar el sufrimiento y el reflejo del dolor</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Estados Unidos</td><td>SLBV5564</td><td>Desacoplador de excitación-contracción para eliminar el artefacto de movimiento durante el mapeo</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBK1794V</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>Baño termostático hecho a medida</td><td>MappingLab, Reino Unido</td><td>TBC-2.1</td><td>Para mantener la temperatura de la solución</td></tr> <tr><td>de perfusiónDimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>Disolvente para tintes Pinzas</td></tr><tr><td>Dumont</td><td>Fábrica de equipos médicos de Shanghái Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghái, China</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>Software ElectroMap</td><td>Universidad de Birmingham</td><td>N/A</td><td>Cuantificación de parámetros eléctricos</td></tr><tr><td>Cámara EMCCD</td><td>Evolve 512 Delta, Fotometría, Tucson, AZ, Estados Unidos</td><td>A18G150001</td><td>Adquisición de imágenes para señales ópticas</td></tr><tr><td>ET525/36 filtro con recubrimiento catódico</td><td>Tecnología Chroma 319106</td><td></td><td>Filtro de excitación</td></tr><tr><td>Glucosa Sigma-Aldrich</td><td>, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBT4811V</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>Heparina Sódica</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>(H51021209)</td><td>Para prevenir los coágulos de sangre en la arteria coronaria</td></tr><tr><td>&nbsp; Pinzas de iris</td><td>Fábrica de equipos médicos de Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, Estados Unidos</td><td>HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBS5003</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Reino Unido</td><td>7355/7356</td><td>La luz de excitación de las sondas de fluorescencia Fuente de</td></tr><tr><td>luz MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Reino Unido</td><td>7352</td><td>Controle los LED</td></tr><tr><td>Tijeras Mayo Fábrica</td><td>de equipos médicos de Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Muestreo de señales ópticas</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>BCBS6841V</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Reino Unido</td><td>M5337</td><td>Conecte el estimulador eléctrico y el software Spike2</td></tr><tr><td>Estimulador de campo MyoPacer EP</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, Estados Unidos</td><td>S006152</td><td>Estimulador eléctrico</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados</td> <td>UnidosSLBS2340V</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>BCBW9042</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBX3605</td><td>Para la solución de Tyrode</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td> Para amplificador de <td>ECG</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, Reino Unido</td><td>N/A</td><td>Alternantes de calcio y análisis de arritmias</td></tr><tr><td>Tijeras oftálmicas</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Reino Unido</td><td>6970</td><td>Divida la luz de emisión para detectar Ca2 + y Vm&nbsp; simultáneamente</td></tr><tr><td>Bomba peristalica</td><td>Bomba de precisión más larga Co., Ltd., Baoding, China, </td><td>BT100-2J</td><td>Para bombear la solución</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>BIOFIL TCD010060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos</td><td>1899021</td><td>Para mejorar la carga con Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Estados Unidos</td><td>1971387</td><td>Tinte sensible al voltaje</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos</td><td>1890519</td><td>Indicador de calcio</td></tr><tr><td>Tubo de gel de sílice</td><td>Bomba de precisión más larga Co., Ltd., Baoding, China,96402-16</td><td></td> <td>Conéctese con la bomba peristáltica</td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, China</td><td>20172650032</td><td>Para arreglar la aorta</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Reino Unido</td><td>N/A</td><td>Para registrar y analizar datos de ECG</td></tr><tr><td>Estimulación electrodo</td><td>MappingLab, Reino Unido</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>para fuente de luz</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology 321343</td><td></td><td>Para fuente de luz</td></tr></tbody></table>

mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in ryr2r2474s de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

El trastorno cardíaco proarrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) se manifiesta como episodios de taquicardia ventricular polimórfica después de la actividad física, el estrés o la provocación con catecolaminas, que pueden deteriorarse hasta convertirse en una fibrilación ventricular potencialmente mortal. El corazón de ratón es una especie muy extendida para modelar enfermedades arrítmicas cardíacas hereditarias, incluida la CPVT. El mapeo óptico simultáneo del potencial transmembrana (Vm) y los transitorios de calcio (CaT) de corazones de ratón perfundidos por Langendorff tiene el potencial de dilucidar los mecanismos subyacentes a la arritmogénesis. En comparación con la investigación a nivel celular, la técnica de mapeo óptico puede probar algunos parámetros electrofisiológicos, como la determinación de la activación, la velocidad de conducción, la duración del potencial de acción y la duración de CaT. En este artículo se presenta la configuración de la instrumentación y el procedimiento experimental para el mapeo óptico de alto rendimiento de CaT y Vm en corazones murinos de tipo salvaje y heterocigotos RyR2-R2474S/+, combinados con estimulación eléctrica programada antes y durante el desafío con isoproterenol. Este enfoque ha demostrado ser un método factible y fiable para el estudio mecánico de la enfermedad por TVPC en una preparación cardíaca de ratón ex vivo.

El mapeo óptico ha sido un enfoque popular en el estudio de arritmias cardíacas complejas en la última década. La configuración de mapeo óptico consiste en una cámara EMCCD, que proporciona una frecuencia de muestreo de hasta 1.000 Hz y una resolución espacial de 74 x 74 μm para cada píxel. Permite una relación señal-ruido bastante alta durante el muestreo de la señal (Figura 1). Una vez que el corazón perfundido por Langendorff alcanza un estado estable y finaliza la carga de colorante, el ...

Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Este método nos ayudará a revelar las propiedades electrofisiológicas y los mecanismos de los frotis de parada ventricular asociados a enfermedades como la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Con esta técnica, podemos obtener el potencial de membrana y las señales de calcio intercelular simultáneamente bajo varios protocolos de estimulación eléctrica programada, lo que es especialmente adecuado para explorar los mecanismos subyacentes y la dinámica de la enfermedad arrítmica cardíaca como la TVPC. Para realizar este experimento con éxito, asegúrese de tener un corazón bien perfundido, una carga de tinte adecuada, un desacoplamiento de excitación-contracción y una configuración cuidadosa de la cámara.Para comenzar, configure el sistema de mapeo óptico y encienda la cámara para obtener una temperatura de muestreo estable a menos 50 grados Celsius. Coloque el corazón de ratón cosechado en la solución fría de CREB para ralentizar el metabolismo y proteger el corazón. Extirpar el tejido circundante de la aorta.Use una aguja de canulación hecha a medida para canularlo y fíjelo con una sutura de seda 4-0. Ahora perfunde el corazón con el sistema Langendorff a una velocidad constante de 3,5 a 4,0 mililitros por minuto. Inserte un pequeño tubo de plástico en el ventrículo izquierdo para liberar la congestión de la solución en la cámara para evitar la sobrecarga y fije el tubo de plástico en la aguja de canulación.A continuación, coloque dos cables en la perfusión de la bañera y encienda las potencias de la caja del amplificador del electrocardiograma y del controlador de estimulación eléctrica. A continuación, inicie el software de electrocardiograma o ECG al que se hace referencia y controle continuamente el ECG. Realice los pasos siguientes en la oscuridad cuando el corazón alcance una condición de estado estable.Perfundir la mezcla de solución de blebbistatina CREBs constantemente en el corazón durante 10 minutos para desacoplar la contracción de la excitación y evitar artefactos de contracción durante la filmación. Luego, con una linterna roja, examine el corazón para confirmar el cese completo de las contracciones. Perfundir el corazón con la solución de trabajo Rhod-2 AM durante 15 minutos en el sistema de perfusión de Langendorff después de desacoplar la contracción de la excitación.Mantener el suministro de oxígeno durante la carga intracelular del colorante de calcio. Para evitar la formación de burbujas del F-127 plurónico, inserte una trampa de burbujas en el sistema de perfusión. Diluir 10 microlitros de solución madre RH 237 en 50 mililitros de perfusión y cargar durante 10 minutos.Al completar la carga de tinte dual, capture una secuencia de fotos. Confirme que las señales de voltaje y calcio son adecuadas para el análisis. Encienda los dos LED para las luces de excitación y ajuste su intensidad a un rango adecuado.Coloque el corazón debajo del dispositivo de detección, asegurándose de que esté bien iluminado por los dos LED que ajustan el diámetro del punto de luz a dos centímetros. Establezca la distancia de trabajo entre la lente y el corazón en 10 centímetros para lograr la frecuencia de muestreo y la resolución espacial deseadas. Abra el software de muestreo de señal para controlar simultáneamente la cámara y capturar señales de voltaje y calcio.Inicie el estimulador de campo MyoPacer y establezca el patrón de estimulación en la lógica del transistor de transistores con dos milisegundos de duración de estimulación por pulso. Ajuste la intensidad inicial a 0,3 voltios. Coloque un par de electrodos de platino unidos al epicardio del ápice del ventrículo izquierdo.Aplique 30 estímulos consecutivos S1 de 10 hercios para probar el umbral de voltaje diastólico del corazón utilizando el software de registro de ECG. Aumente gradualmente la amplitud del voltaje hasta lograr la captura uno a uno. Implementar el protocolo S1-S1 para medir el calcio o las alternativas de potencial de acción y las propiedades de restitución.Marca el ritmo del corazón consecutivamente a partir de una duración básica del ciclo de 100 milisegundos. Disminuya la duración del ciclo en 10 milisegundos en cada secuencia posterior hasta que alcance los 50 milisegundos. Iniciar simultáneamente el mapeo óptico antes de la estimulación.Para medir el período refractario efectivo ventricular utilizando el protocolo de estímulo S1-S2, comience con una duración del ciclo de estimulación S1-S1 de 100 milisegundos. Acople S2 a los 60 milisegundos y disminuya con una disminución de paso de dos milisegundos hasta que S2 no pueda capturar el complejo QRS ectópico. Para la inducción de arritmias, administre estimulación de ráfaga perpetua de 50 hercios y realice el mismo episodio de estimulación después de esperar un intervalo de dos segundos de reposo.Monitoree cuidadosamente las grabaciones del electrocardiograma durante el período continuo de estimulación de alta frecuencia para comenzar rápidamente las grabaciones simultáneas de mapeo óptico cuando se genere una onda arrítmica interesante. Proceda a capturar imágenes utilizando la cámara del dispositivo acoplado a la carga multiplicadora de electrones. En el software de adquisición de imágenes, presione Seleccionar carpeta y cargue imágenes para comenzar el proceso semiautomático de análisis masivo de datos de video.Introduzca los parámetros de muestreo correctos para el análisis. Establezca manualmente el umbral de la imagen y seleccione la región de interés. Aplique un filtro espacial gaussiano de tres por tres píxeles, un filtro de Savitzky-Golay y una corrección de línea de base de sombrero de copa.A continuación, pulse Imágenes de proceso para eliminar la línea de base y calcular parámetros electrofisiológicos como APD-80 y CATD-50. Establezca el tiempo de inicio de la duración del potencial de acción en el pico y el punto terminal en 80% de repolarización para calcular APD-80. De manera similar, defina el tiempo de inicio de la duración transitoria del calcio como el pico, siendo el punto terminal el 80% de relajación.Se muestran trazas típicas en los mapas de calor de APD-80 y CATD-80. El isoproterenol acorta el APD-80 y los ratones de tipo salvaje y taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica o CPVT, pero no se encontraron diferencias después de la exposición con isoproterenol. Los ratones CATD-80 y CPVT fueron más prolongados que en el tipo salvaje después de la provocación con isoproterenol, mientras que no hubo significación antes del tratamiento.De acuerdo con las señales de voltaje, los corazones de tipo salvaje y CPVT poseían la misma capacidad de conducción a través del epicardio al inicio y después de la intervención con isoproterenol. Los mapas de calor demostraron que los ratones CPVT tienen la misma capacidad de conducción que los ratones de tipo salvaje antes y después del desafío con isoproterenol. El análisis de alternativas de amplitud de calcio mostró que las señales de calcio en los corazones de tipo salvaje se mantuvieron estables al inicio durante la estimulación consecutiva S1-S1 a 14,29 y 16,67 hercios, mientras que los corazones CPVT mostraron alternancias dependientes de la frecuencia.Después de la provocación con isoproterenol, los corazones de CPVT mostraron alternancias dependientes de la frecuencia y señal de calcio durante la estimulación S1-S1, mientras que los corazones de tipo salvaje no se vieron afectados. El análisis de arritmias taquimétricas sugirió que tanto los corazones de tipo salvaje como los de CPVT exhiben una conducción normal durante la estimulación de ráfagas de 50 hercios al inicio del estudio. Después de la profusión con isoproterenol, los corazones de CPVT mostraron rotores de alta frecuencia después de una estimulación de ráfaga de 50 hercios, mientras que los corazones de tipo salvaje mantuvieron la conducción normal.Siguiendo este procedimiento, se utilizan ratones de tipo adogen y ratones de tipo salvaje para ilustrar las propiedades electrofisiológicas y funcionales en estos modelos o en la invención de productos farmacéuticos. El mapeo óptico es una herramienta poderosa para el estudio de arritmias cardíacas, sin embargo, no se puede utilizar clínicamente debido a la limitación del colorante fluorescente bajo el desacoplamiento de la excitación y la contracción. Con el desarrollo de fluorescentes adecuados para diferentes moléculas objetivo bajo el desarrollo de la tecnología de computación de altas revoluciones, la técnica de mapeo óptico cardíaco está destinada a lograr solo aplicaciones.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Este informe proporciona una descripción detallada de la metodología y los resultados del mapeo simultáneo óptico endocárdico y epicárdico de excitación eléctrica de la aurícula izquierda intacta de un corazón de oveja Langendorff perfundidos durante el estiramiento inducido por fibrilación auricular.

Cartografía de alta resolución óptica endocárdicos y epicárdicos en un modelo de ovejas inducidas por el estiramiento de la fibrilación auricular

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Este trabajo informa un método para controlar el ritmo cardíaco de corazones murinos intactos de ratones transgénicos con canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulación local con una matriz de micro-LED y mapeo óptico simultáneo del potencial de la membrana epicárdica.

Manejo avanzado del ritmo cardíaco mediante la aplicación de fotoestimulación optogenética multisitio en corazones murinos

Aprende el mapeo óptico de doble colorante para estudiar arritmias cardíacas en corazones de ratón con taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Este método permite registrar simultáneamente voltaje transmembrana y calcio intracelular.

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (Video) | JoVE Journal

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2^R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Explorar más videos