Name: Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a identificar metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas mediante cultivo de callos vegetales. Este método permite evaluar la degradación metabólica de xenobióticos con mínima interferencia ambiental.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976160) y el Proyecto de Investigación de Aplicación de Tecnología de Bienestar Público (LGF21B070006) de la provincia de Zhejiang.

1. Diferenciación del callo de zanahoria
NOTA: Autoclave todo el equipo utilizado aquí y realice todas las operaciones en un banco de trabajo ultralimpio esterilizado por UV.
<ol><li>Vernalizar las semillas sumergiendo las semillas uniformes de zanahoria (Daucus carota var. sativus) en agua desionizada a 4 °C durante 16 h.</li>
	<li>Esterilizar las semillas vernalizadas con etanol al 75% durante 20 minutos y luego enjuagar tres veces con agua desionizada estéril en condiciones asépticas.</li>
	<li>Esterilizar las semillas con 20% de H 2 O2durante 20 min, y lavarlas con agua desionizada esterilizada seis veces en condiciones asépticas.</li>
	<li>Germinar asépticamente las semillas sembrándolas en un medio MS libre de hormonas (pH 5,8, esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min) que contenga agar-gel al 1%, e incubando a 26 °C con un fotoperiodo de 16 h (350 μmol/m2s) durante 15 días.</li>
	<li>Obtener los explantes cortando el hipocótilo y el cotiledón de las plántulas en trozos pequeños (0,5 cm).</li>
	<li>Transformar los explantes en placas de Petri (de dos a cuatro explantes por placa) que contengan 15-20 mL de medio MS aséptico suplementado con auximona (ácido 2,4-diclorofenoxiacético; 1 mg/L) y fitoquinina (6-bencilaminopurina; 0,5 mg/L) en condiciones asépticas.</li>
	<li>Incubar los explantes en la oscuridad a 26 °C durante 3-4 semanas para inducir el callo.</li>
	<li>Separe los tejidos callosos (alrededor de 1 cm de diámetro) formados a partir de los explantes iniciales con un bisturí estéril y fórzas. NOTA: Los tejidos de callo recién formados son de color blanco a amarillo cremoso y se adhieren libremente a los explantes iniciales.</li>
</ol>2. Tratamiento con 2,4-dibromofenol
<ol><li>Disolver 1 μg de 2,4-dibromofenol en 10 ml de medio MS líquido aséptico (la concentración final de 2,4-dibromofenol es de 100 ppb, pH 5,6-7,0).</li>
	<li>Añadir 3 g del callo de zanahoria fresca (paso 1.8) en frascos de vidrio que contengan la solución preparada de 2,4-dibromofenol (a partir del paso 2.1) en condiciones asépticas. Considéralo como el tratamiento con 2,4-dibromofenol. NOTA: Los frascos de vidrio se esterilizaron en autoclave y se sellaron con una película de parafina.</li>
	<li>Incluir un medio testigo que contenga únicamente la solución de 2,4-dibromofenol (preparada en el paso 2.1) para evaluar la degradación abiótica del 2,4-dibromofenol.</li>
	<li>Incluya un control en blanco que contenga solo el callo de zanahoria (sin solución de 2,4-dibromofenol) para verificar si hay cualquier contaminación potencial.<ol><li>Prepare el control en blanco que contiene zanahoria agregando 3 g de callo de zanahoria recién recolectado solo en 10 ml de medio MS estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar el tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles medio y blanco a 130 rpm y 26 °C en la oscuridad en una incubadora durante 120 h.</li>
	<li>Retire los matraces de vidrio de la incubadora para recoger las muestras del tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles después de 120 h de incubación. NOTA: Todas las muestras se prepararon por triplicado.</li>
</ol>3. Preparación de la muestra
<ol><li>Separe cuidadosamente el callo del medio MS mediante filtración con filtros de fibra de vidrio (0,45 μm) para el tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles. Recoja el callo después de lavarlo con agua ultrapura tres veces.</li>
	<li>Liofilizar el callo recogido con nitrógeno líquido y, posteriormente, homogeneizar el callo recogido (0,2 g) con una trituradora de tejidos de alto rendimiento a 70 Hz durante 3 min.</li>
	<li>Pinchar el callo homogeneizado añadiendo 50 μL de 4-n-NP-d4 sustituto de 25 mg/L con una microjeringa de vidrio y posteriormente vórtice durante 1 min.</li>
	<li>Sonicar las muestras con 5 mL de metanol/agua (1:1, v/v) en un ultrasonido (150 W, 40 kHz) lleno de agua helada durante 30 min, para extraer el 2,4-dibromofenol y los metabolitos.</li>
	<li>Centrifugar las suspensiones a 8.000 x g a 4 °C durante 10 min, y recoger los sobrenadantes mediante pipeteo.<ol><li>Repita los procesos de extracción de la muestra de callo tres veces y combine los extractos.</li>
	</ol></li>
	<li>Pasar los extractos a través de cartuchos de extracción en fase sólida balanceada lipofílica hidrófila (HLB SPE) con un caudal de 1 mL/min. NOTA: Los cartuchos HLB SPE fueron pretratados secuencialmente con 6 mL de metanol y 6 mL de agua para eliminar cualquier interferencia.</li>
	<li>Eluir los analitos pasando 6 mL de metanol a través de los cartuchos HLB SPE. A continuación, concentrar los eluyentes obtenidos a 1 mL bajo una suave corriente de nitrógeno gaseoso para su análisis instrumental.</li>
	<li>Inyectar 10 μL de eluyentes resultantes en la UPLC-Q-TOF-MS para el análisis de 2,4-dibromofenol y sus metabolitos15.<ol><li>Filtrar todas las muestras con una membrana de nailon de 0,22 μm antes del análisis instrumental.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis instrumental
NOTA: Los análisis de 2,4-dibromofenol y sus metabolitos se realizaron en un cromatógrafo líquido de ultra rendimiento (UPLC) en combinación con un espectrómetro de masas micrOTOF-QII equipado con ionización por electrospray (ESI), que funciona en modo de iones positivos y negativos.
<ol><li>Abra la puerta del calentador de columna e instale la columna UPLC conectando la entrada de la columna a la válvula de inyección y la salida de la columna a la entrada del espectrómetro de masas. NOTA: Se utilizó una columna C18 (50 mm x 2,1 mm; tamaño de partícula de 1,7 μm) para la separación de analitos a 40 °C.</li>
	<li>Conecte la fase móvil A (agua ultrapura) y la fase móvil B (metanol de grado cromatográfico) al instrumento insertando el extremo de los tubos de disolvente A y B en las botellas de disolvente correspondientes, respectivamente.<ol><li>Filtre todas las fases móviles (500 ml para cada una) a través de un filtro de 0,22 μm y sonique durante más de 30 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>En la ventana del software, haga clic en Instrumento | Método de entrada para editar las condiciones del cromatograma líquido.<ol><li>Establezca las condiciones de gradiente de la fase móvil B de la siguiente manera: un caudal de 1,0 ml/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% a 50%; 3,5-6,5 min, 50% a 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, del 100% al 5%.</li>
		<li>Ajuste la velocidad de inyección de las muestras en el UPLC-Q-TOF-MS como 0,2 ml/min. NOTA: La inyección de la muestra se programa utilizando un muestreador totalmente automático.</li>
	</ol></li>
	<li>En la ventana del software, seleccione Método MS y luego configure los parámetros de Q-TOF-MS: un caudal de gas de secado (N2) de 8 L/min, una temperatura de 300-350 °C; una tensión capilar de 4.500 V; una energía de colisión de 5-45 V; y un rango de escaneo completo de 40-800 Da.</li>
	<li>Coloque los viales de muestra en las ubicaciones correspondientes de las bandejas de muestras por número de serie y vuelva a insertar las bandejas de muestras en la cámara de muestras. NOTA: Mantenga las bandejas de muestras planas y asegúrese de que la puerta de la cámara de muestras esté cerrada.</li>
	<li>En la ventana de software, seleccione Archivo | Nuevo para crear una base de datos. Asigne un nombre a la base de datos.</li>
	<li>Cargue el programa de ejemplo creado anteriormente seleccionando Archivo MS | Archivo de entrada | Inyectar volumen.</li>
	<li>Guarde la base de datos en la carpeta de ejemplo del proyecto haciendo clic en Archivo | Guardar.</li>
	<li>Seleccione Ejecutar | Comience en la ventana principal del software y, a continuación, seleccione Adquirir datos de ejemplo y haga clic en Aceptar en la ventana de la lista de ejemplo de inicio para recopilar datos. NOTA: El cromatograma en tiempo real se puede ver haciendo clic en Cromatograma | Actualización en tiempo real durante el proceso de adquisición de datos.</li>
	<li>Procese los datos en el software seleccionando la fila de datos de destino y haciendo clic en la ventana Cromatograma para ver el cromatograma de MS Scan.</li>
	<li>En la ventana Cromatograma , haga clic en Visualización | TIC | ScanWaveDS | Agregar seguimiento | OK para obtener los espectros de masas de barrido secundarios.</li>
	<li>Identificar los metabolitos comparando los cromatogramas del tratamiento con 2,4-dibromofenol y los controles.</li>
	<li>Dilucidar los candidatos a metabolitos por el tiempo de retención, la masa y los patrones de fragmentación16,17. NOTA: El error de precisión de masa entre los valores experimentales m/z de los iones progenitores de los metabolitos candidatos a su correspondiente m/z teórico debe ser inferior a 10 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+investigation+on+plasticizers%2C+bisphenol+A%2C+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li>
<li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants%2C+bisphenol+A%2C+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).</li>
<li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232(2021).</li>
<li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta%2C+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li>
<li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li>
<li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li>
<li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li>
<li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole%2C+flurtamone%2C+fenhexamid%2C+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.%2C+Glycine+max+%28L.%29+Merr.%2C+Zea+mays+L.%2C+and+Triticum+aestivum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li>
<li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li>
<li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants%3A+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064(2021).</li>
<li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li>
<li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation%3A+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li>
<li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li>
<li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e%2C4-Dibromophenol+in+Carrot%3A+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li>
<li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li>
<li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment%3A+ready+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li>
<li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo fue desarrollado para identificar eficientemente la biotransformación de xenobióticos en plantas. El paso crítico de este protocolo es el cultivo del callo de la planta. La parte más difícil es la diferenciación y el mantenimiento del callo de la planta, porque el callo de la planta se infecta fácilmente y se convierte en tejidos vegetales. Por lo tanto, es importante asegurarse de que todos los equipos utilizados estén esterilizados en autoclave y que todas las operaciones se realicen en condiciones asépt...

Un número cada vez mayor de contaminantes orgánicos han sido descartados en el medio ambiente debido a las actividades antropogénicas 1,2, y el suelo se considera un importante sumidero de estos contaminantes 3,4. Los contaminantes del suelo pueden ser absorbidos por las plantas y potencialmente transferidos a organismos de nivel trófico superior a lo largo de las cadenas alimentarias, entrando directamente en el cuerpo humano a través del consumo de cultivos, lo que conduce a una exposición no intencionada 5,6. Las plantas utilizan diferentes vías para metabolizar los xenobióticos para la desintoxicación7; Dilucidar el metabolismo de los xenobióticos es importante, ya que controla el destino real de los contaminantes en las plantas. Dado que los metabolitos pueden ser excretados por las hojas (a la atmósfera) o las raíces, la determinación de los metabolitos en las primeras fases de la exposición ofrece la posibilidad de analizar un número prolongado de metabolitos8. Sin embargo, los estudios con plantas intactas requieren experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por diversos factores.
Los cultivos de callos vegetales, por lo tanto, son una buena alternativa para estudiar el metabolismo de los xenobióticos en planta, ya que pueden acortar en gran medida el tiempo de tratamiento. Estos cultivos excluyen la interferencia microbiana y la degradación fotoquímica, simplifican el efecto matriz de las plantas intactas, estandarizan las condiciones de cultivo y requieren menos esfuerzo experimental. Los cultivos de callos vegetales se han aplicado con éxito como un enfoque alternativo en estudios metabólicos de triclosán9, nonilfenol10 y tebuconazol8. Estos estudios mostraron que los patrones metabólicos en los cultivos de callos eran similares a los de las plantas intactas. Este estudio propone un método para la identificación eficiente y precisa de metabolitos de xenobióticos en plantas sin protocolos complejos y que requieren mucho tiempo. Aquí, utilizamos cultivos de callos vegetales en combinación con espectrometría de masas de alta resolución para el análisis de metabolitos con señales de baja intensidad11,12.
Con este fin, las suspensiones de callos de zanahoria (Daucus carota var. sativus) se expusieron a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol durante 120 h en un agitador a 130 rpm y 26 °C. Se eligió el 2,4-dibromofenol debido a su actividad endocrina disruptiva13 y su presencia generalizada en el suelo14. Los metabolitos fueron extraídos y analizados por espectrometría de masas de alta resolución. El protocolo aquí propuesto puede investigar el metabolismo in planta de otros tipos de compuestos orgánicos que pueden ser ionizados.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2,4-diclorofenoxiacético</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H2O<>2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP-d4</td><td>Pointe-Claire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-bencilaminopurina</td><td>WAKO</td><td>0,5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>1269101-500ML</td><td></td></tr><tr><td>7890A-5975&nbsp; cromatografía de gases</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQULTY ultra-performance&nbsp; cromatografía líquida</td><td>Aguas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio ámbar</td><td>Aguas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de clima artificial</td><td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaves</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>C18 columna</td><td>ACQUITY UPLC BEH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-5MS columna capilar</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40071190-4L</td><td></td></tr><tr><td>Liofiliz</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trituradora de tisú de alto rendimiento</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr> Espectrómetro de <tr><td>masas de metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicrOTOF-QII</td><td>Sistema Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Medio Skoog</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>N-hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H109658-4L</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de soplado de nitrógeno&nbsp;</td><td>AOSHENG</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>isómeros NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartuchos Oasis HLB</td><td>Waters</td><td>60 mg/3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Research plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>100-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Semillas de zanahoria Little Finger (Daucus carota var. sativus)&nbsp;</td><td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacudiendo &nbsp; Incubadoras</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., ltd.</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de fase sólida</td><td>AUTO SCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecógrafo</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>Banco de trabajo ultralimpio esterilizado por UV</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Los cultivos pueden estar ampliamente expuestos a contaminantes orgánicos, ya que el suelo es un sumidero importante para los contaminantes desechados en el medio ambiente. Esto crea una exposición humana potencial a través del consumo de alimentos acumulados con contaminantes. Esclarecer la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en los cultivos es esencial para evaluar el riesgo de exposición alimentaria en los seres humanos. Sin embargo, para tales experimentos, el uso de plantas intactas requiere experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por varios factores. Los cultivos de callos vegetales combinados con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) pueden proporcionar una solución para la identificación precisa y rápida de metabolitos de xenobióticos en plantas, ya que pueden evitar la interferencia del microambiente microbiano o fúngico, acortar la duración del tratamiento y simplificar el efecto matriz de las plantas intactas. El 2,4-dibromofenol, un retardante de llama y disruptor endocrino típico, se eligió como sustancia modelo debido a su presencia generalizada en el suelo y a su potencial de absorción por las plantas. En este trabajo, el callo vegetal se generó a partir de semillas de asepsia y se expuso a un medio de cultivo estéril que contenía 2,4-dibromofenol. Los resultados mostraron que se identificaron ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol en los tejidos de callos de la planta después de 120 h de incubación. Esto indica que el 2,4-dibromofenol se metabolizó rápidamente en los tejidos callosos de las plantas. Por lo tanto, la plataforma de cultivo de callos vegetales es un método eficaz para evaluar la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en las plantas.

Los pasos del protocolo se muestran en la Figura 1. Siguiendo el protocolo, comparamos el cromatograma del extracto de callo de zanahoria del tratamiento con 2,4-dibromofenol con los controles, y encontramos ocho picos distintos que están presentes en el tratamiento con 2,4-dibromofenol pero ausentes en los controles (Figura 2). Esto indica que un total de ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 y M187) se detectaron con éx...

El presente protocolo describe un método simple y eficiente para la identificación de metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas.

Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

El cultivo de callos vegetales proporciona una solución para la evaluación precisa, eficiente y rápida de la degradación metabólica de los xenobióticos en las plantas. El cultivo de callos vegetales puede excluir el microbioma o la interferencia fúngica y la degradación fotoquímica, simplificar el efecto matriz de las plantas intactas, estandarizar las condiciones de cultivo, acortar la duración del tratamiento y requerir menos esfuerzo experimental. El método aquí propuesto podría proporcionar información sobre el comportamiento de absorción y los mecanismos metabólicos de diferentes contaminantes orgánicos en los cultivos y es útil para los esfuerzos en las evaluaciones de riesgos ambientales.Para empezar, autoclave todo el equipo y realice todas las operaciones en un banco de trabajo ultra limpio esterilizado por UV. Esterilizar la superficie vernalizada de la semilla con etanol al 75% durante 20 minutos. Enjuáguelos con agua desionizada estéril tres veces y vuelva a esterilizarlos con peróxido de hidrógeno al 20% durante 20 minutos.Después de lavar las semillas con agua desionizada esterilizada seis veces, germinarlas asépticamente sembrando en medio Murashige y Skoog autoclave

elucidating-the-metabolism-of-24-dibromophenol-in-plants

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

La biomasa vegetal es uno de los principales de carbono-neutral recurso renovable que podría ser utilizado para la producción de biocombustibles. La biomasa vegetal se compone principalmente de las paredes celulares, un material compuesto estructuralmente complejos denomina lignocelulosa. Aquí se describe un protocolo para un análisis exhaustivo del contenido y la composición de la lignina polifenólicos.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

Este manuscrito describe cómo las tasas de metabolismo de herbicidas se pueden cuantificar de manera efectiva con hojas extirpadas de una maleza dicotiledónea, reduciendo así la variabilidad y eliminando cualquier posible efecto de confusión de la absorción o translocación de herbicidas típicamente observada en ensayos de plantas enteras.

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

Los poliésteres lipídicos constituyen los componentes estructurales de dos modificaciones de la pared celular, la cutícula de la planta y las barreras de difusión que contienen suberina. En este video, describimos un método para despolimerizar la cutina de hojas enteras desfiladas. El método se puede aplicar a la investigación de mutantes comprometidos en la biosíntesis de cutina o suberina.

Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Los protocolos descritos en este documento facilitan la investigación conveniente de las respuestas bacterianas al etileno mediante la utilización de ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA).  El etileno se produce in situ a través de la descomposición de CEPA en un medio acuoso de crecimiento bacteriano, eludiendo el requisito de gas etileno puro.

Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias

Este trabajo presenta un protocolo para establecer un cultivo de suspensión celular derivado del té (Camellia sinensis L.) hojas que se pueden utilizar para estudiar el metabolismo de los compuestos externos que pueden ser tomados por toda la planta, como insecticidas.

Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

Este método utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para comprender los procesos metabólicos en las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. El método permite la localización espacial de compuestos de interés y sus metabolitos predichos dentro de tejidos específicos e intactos.

Investigación Del Metabolismo De Xenobióticos En Hojas De Salix alba A Través De Imágenes Espectrometría De Masas

Presentamos el proceso de aislamiento, propagación y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos. El protocolo describe el aislamiento bacteriano, la identificación mediante el método de ARNr 16S y las pruebas de su potencial de degradación de hidrocarburos. Este artículo ayudaría a los investigadores a caracterizar la biodiversidad microbiana en muestras ambientales y, específicamente, a detectar microbios con potencial de biorremediación.

Aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas con propiedades metabolizadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos

La secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa a través del análisis metabolómico no dirigido.

Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos

El protocolo describe un nuevo método para evaluar la citotoxicidad integral de los metabolitos de los plaguicidas triazoles en plantas.

Evaluación de la citotoxicidad de los metabolitos de los plaguicidas triazoles típicos en las plantas

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

Aprenda a identificar metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas mediante cultivo de callos vegetales. Este método permite evaluar la degradación metabólica de xenobióticos con mínima interferencia ambiental.

Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas

Explorar más videos