Name: Un procedimiento conforme a las GMP para la generación de células T modificadas genéticamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende un protocolo conforme a GMP para la transducción de células T humanas primarias con genes de interés. Este método rentable facilita la generación de terapias celulares modificadas genéticamente como las CAR-T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Esta investigación ha sido cofinanciada por la Unión Europea y fondos nacionales griegos a través del Programa Operativo Competitividad, Emprendimiento e Innovación, bajo la convocatoria RESEARCH - CREATE - INNOVATE (código del proyecto: T2EDK - 00474). También nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a la Fundación Choose Life por brindar apoyo continuo al Laboratorio GMP "Dimitris Lois" del Instituto de Terapia Celular.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Patras y por el Comité de Revisión Institucional del Hospital General Universitario de Patras. Antes de obtener especímenes biológicos, se obtuvo el consentimiento informado de individuos sanos. La evaluación de elegibilidad de los participantes se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos institucionales y de acuerdo con los estándares JACIE para leucoféresis. Si este protocolo se va a implementar en un entorno clínico de ACT, todos los procedimientos deben cumplir con las pautas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) y realizarse en salas limpias que cumplan con las GMP. Es necesario tomar precauciones especiales de seguridad cuando se trabaja con vectores virales, y estos procedimientos deben llevarse a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad dedicado. En este estudio, los procedimientos descritos se llevaron a cabo dentro de una hipoxiestación HEPA H35 validada (ver Tabla de Materiales) para garantizar un entorno controlado y monitoreado. La descontaminación de todos los líquidos peligrosos debe llevarse a cabo con una solución de lejía al 10%.
1. Aislamiento de PBMC y activación de células T (Día 0)
<ol><li>Recoja las células de la bolsa de aféresis del donante (leucopakos, consulte la tabla de materiales) en tubos de 50 ml, según el volumen inicial.</li>
	<li>Realice dos lavados de la bolsa celular mediante la infusión de 15 ml de medio hematopoyético completo (+5% HSA, medios hematopoyéticos comerciales sin suero, consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Realice una centrifugación en gradiente de densidad a base de polisacáridos a una dilución de 1:2 (reactivo:muestra). Centrifugar a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente con pausas (A/D, 9/0).</li>
	<li>Con una micropipeta, recoja las PBMC en un tubo limpio de 50 ml.</li>
	<li>Lave las celdas dos veces con 1x PBS, llenando hasta 50 ml por cada lavado (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). Resuspender las células en 5 mL de medio completo.</li>
	<li>Cuente las células usando azul de tripano usando un hemocitómetro estándar o un contador de células automatizado (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Diluir las células con medios completos para lograr una concentración de 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Active 20 x 106 PBMC añadiendo 10 μL de reactivo de estimulación de células T (consulte la Tabla de materiales) por cada 2 x 106 células iniciales. NOTA: Este protocolo está diseñado para la activación de 20 x 106 PBMC, pero se puede ajustar para números de celdas más grandes según sea necesario.</li>
	<li>Agregue rhIL-2 (20 U/mL) (consulte la Tabla de materiales), mezcle suavemente y transfiera la mezcla a un recipiente apropiado (p. ej., una placa de 6 pocillos).</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C, 5% CO2 durante 72 h.</li>
</ol>2. Transducción de lentivirus de células T (Día 3)
<ol><li>Transfiera el cultivo celular a un recipiente adecuado, como un tubo cónico de 50 ml. Mezclar bien y centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para eliminar el reactivo de activación. Deseche cuidadosamente el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de medio completo. NOTA: En esta etapa, es posible descongelar el virus en hielo.</li>
	<li>Cuente las celdas usando azul de tripano.</li>
	<li>Resuspender las células en medio completo para lograr una concentración que permita sembrar0,5 x 10 6 células en un volumen total de 400 μL por pocillo en una placa de 24 pocillos. Agregue rhIL-7 (155 U/mL) y rhIL-15 (290 U/mL) (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Asegúrese de tener en cuenta el volumen de virus que se agregarán. Consulte el paso 2.4.</li>
	<li>En un tubo aparte, añadir vectofusina-1 (ver Tabla de Materiales) al medio Opti-MEM a una concentración de 10 μg/mL, con un volumen igual al volumen viral que se va a utilizar. NOTA: Tenga en cuenta el volumen total de cultivo celular al calcular la concentración de vectofusina-1. Consulte el paso 2.3. Alternativamente, Vectofusin-1 GMP se puede utilizar como reactivo de grado GMP.</li>
	<li>Combine el virus concentrado a una multiplicidad de infección (MOI) de 40 con la mezcla de Vectofusina-1/Opti-MEM (proporción 1:1) y mezcle bien. Agregue esta mezcla al cultivo celular y ajuste el volumen total a 400 μL por pocillo utilizando medio completo, si es necesario.</li>
	<li>Coloque la tapa en la placa, séllela con una película de parafina y centrifuga a 1000 x g durante 2 h a 32 °C. Posteriormente, incubar la placa a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche.</li>
</ol>3. Eliminación del virus y expansión de las células T (Día 4)
<ol><li>Recoja las células y acompájelas en un recipiente adecuado, como un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar las celdas a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de medio completo.</li>
	<li>Cuente las celdas usando azul de tripano. Resuspender las células en medios completos a una concentración de 1 x 106 células/mL. Agregue rhIL-7 (155 U/mL) y rhIL-15 (290 U/mL) (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Transferir las células a un recipiente apropiado, como un matraz T25, a una concentración de 0,3-0,5 x 106 células/cm2 e incubarlas a 37 °C, 5% CO2, durante 2 días. NOTA: Si se requiere una población celular más grande, las células se pueden subcultivar (1:2) en presencia de rhIL7 y rhIL-15 cada 2 días, siguiendo las mismas condiciones de incubación mencionadas anteriormente, hasta lograr el número de células deseado.</li>
</ol>4. Criopreservación (Día 14)
NOTA: Se requerirá hielo para transferir los crioviales al lugar de almacenamiento durante este paso. El momento de la criopreservación depende del número de células deseado. Para este protocolo, la criopreservación se realiza en el día 14 después de lograr una expansión de 25 veces.
<ol><li>Una vez que se alcance el número de células deseado, recoja las células y transfiéralas a tubos de 50 ml (ajuste el número de tubos en función del volumen total).</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en 10 ml de medio. Si es necesario, agrupe las células de varios tubos.</li>
	<li>Cuente las celdas usando azul de tripano. Mantenga una alícuota de 1 x 106 celdas para cada prueba de control de calidad (QC) (consulte la Sección 5) para evaluar el número de copias vectoriales y la eficiencia de transducción.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 400 x g durante 10 min a RT. En este punto, etiquete los crioviales en consecuencia.</li>
	<li>Retire completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en una solución de criopreservación que consista en 50% de HSA y 40% de HBSS a una concentración de 1 x 107 células por ml por criovial. Transfiera la suspensión celular al número adecuado de crioviales y agregue un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada criovial.</li>
	<li>Coloque los crioviales en hielo y transfiéralos rápidamente a un congelador de velocidad controlada para su criopreservación. Después de la criopreservación, transfiera los crioviales a un tanque de nitrógeno líquido monitoreado para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>5. Control de calidad (Día 14)
NOTA: Para las pruebas de liberación, el producto se sometió a varias pruebas, incluidas pruebas de esterilidad para el crecimiento microbiano y la evaluación del nivel de endotoxinas. Estas pruebas se llevaron a cabo en laboratorios certificados del Hospital General Universitario de Patras y de la Universidad de Patras. La presencia de micoplasma se determinó internamente mediante un ensayo de detección bioquímica y se midió en un luminómetro siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). El fenotipo celular (Figura 1), así como el número de células y la viabilidad, se evaluaron internamente mediante citometría de flujo (ver sección 5.1) y un contador celular automatizado (ver Tabla de materiales), respectivamente. Los criterios de liberación se establecieron sobre la base de los datos publicados y las recomendaciones10,11 para los productos celulares producidos por GMP (Tabla 1).
<ol><li>Realizar la tinción de citometría de flujo de eficiencia de transducción (día 14) NOTA: Se teñirá una alícuota de 1 x 106 células para determinar su viabilidad (7-AAD) y el marcador CD32 para evaluar la eficiencia de la transducción (ver Tabla de Materiales). Si es necesario detectar el gen de interés, como en el caso de las células CAR-T, el anticuerpo específico debe ser de un color diferente al del marcador CD3 y 7-AAD para evitar la compensación. Deben tenerse en cuenta las muestras de control adecuadas.<ol><li>Coloque la muestra en un tubo FACS y agregue 500 μL de tampón FACS.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 400 x g a RT durante 5 min.</li>
		<li>Deseche completamente el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el gránulo en una solución diluida 1:5 de tampón CD3:FACS (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Agitar la muestra e incubar durante 30 minutos en hielo en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 500 μL de tampón FACS. Centrifugar a 400 x g durante 5 min (RT).</li>
		<li>Deseche completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en una solución diluida 1:20 de tampón 7-AAD:FACS (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Agitar la muestra e incubar durante 10 minutos en hielo en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón FACS y analizar la muestra con un citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+quality%2C+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Medicines+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).</li>
<li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+CAR+T-Cell+production+%28ARI-0001%29+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor%3A+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li>
<li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+International%22%5BJournal%5D)">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li>
<li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li>
<li>Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+choice%3A+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).</li>
<li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34%2B+cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li>
<li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li>
<li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes%2C+enabling+robust%2C+automated+closed-system+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li>
<li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li>
<li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions%3A+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>Wang, R. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+%CE%B3%CE%B4+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
</ol>

N.S. desarrolló el protocolo y escribió el manuscrito que fue revisado y supervisado por A.S.; K.S., G.A. realizó experimentos adicionales; D.K., M.L. proporcionó un valioso apoyo en los experimentos y, junto con V.Z., N.T. en el proceso de revisión. N.T. es miembro de ProtATonce Ltd. Todos los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Los vectores lentivirales como vehículos de administración de genes son herramientas importantes en el campo de la terapia celular y génica debido a su capacidad para transducir células que se dividen y no se dividen12. Sin embargo, la producción a gran escala de vectores lentivirales utilizando métodos compatibles con GMP sigue siendo un desafío debido a varios parámetros, como los métodos de transfección y los pasos de purificación, que pueden dar lugar a variabilidad en los lotes de lentivirus....

La aparición de las terapias celulares adoptivas (ACT) y las células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han provocado un cambio revolucionario en la práctica clínica moderna, estableciendo un nuevo paradigma de medicina personalizada. En particular, las células CAR-T dirigidas a CD19 han demostrado respuestas clínicas excepcionales y representan la terapia de células T más avanzada para las neoplasias malignas de células B 1,2,3,4,5. Sin embargo, las terapias de células T modificadas genéticamente comercializadas actualmente dependen en gran medida de los vectores virales para la transferencia de genes. La implementación de vectores virales en ACT, especialmente en condiciones de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) dentro de un entorno académico, presenta desafíos significativos debido a las limitaciones de escalabilidad, los requisitos de equipos especializados, la necesidad de personal altamente calificado y el uso de reactivos que cumplen con GMP para la producción de partículas virales mediadas por plásmidos 6,7,8.
En consecuencia, el proceso de fabricación de las terapias de células T modificadas genéticamente es intrincado y, por lo general, comienza con el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un producto de leucoféresis. Las células T a menudo se enriquecen a partir del grupo de PBMC y se activan mediante microcomplejos anti-CD3/CD28 7,9. Posteriormente, las células T se modifican genéticamente con vectores virales o no virales, que pueden producirse in situ o subcontratarse. Para alcanzar el número de células requerido para la infusión, las células modificadas genéticamente se expanden antes de la formulación final y/o la criopreservación. Por último, el producto celular debe satisfacer varios criterios de liberación basados en múltiples ensayos de control de calidad9.
Este protocolo presenta una metodología integral que utiliza técnicas simples para la manipulación ex vivo de PBMC sanos para fabricar un producto de células T modificadas genéticamente en condiciones que cumplen con las GMP. El protocolo incorpora el uso de un vector lentiviral, que puede ser subcontratado a una empresa de producción viral que proporcione todas las pruebas cuantitativas/funcionales, de pureza y de seguridad necesarias (por ejemplo, título viral, detección de lentivirus competente para la replicación del ADN de la célula huésped). Para este estudio, el vector empleado es un vector lentiviral de segunda generación basado en VSV-g (Proteína G del Virus de la Estomatitis Vesicular) con Proteína Verde Fluorescente (GFP), como gen de interés, en expresión constitutiva.

<table><tbody><tr><td>Placa Corning de 24 pocillos tratada con TC</td><td></td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>tubo FACS de 5 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>placa tratada con TC de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter&nbsp;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>Cryoviales</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Tampón FACS (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' s Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hipoxiestación</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Luminómetro portátil</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Kit de cuantificación de provirus</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano&nbsp; CD3 (Clon: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus Kit de detección</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm cinta de película de cierre ultraexpandible 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (bolsa de aféresis)</td><td>Biomed Device</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Cepilladora Kryo10 Serie III</td><td>Cepilladora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 matraces</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán, solución al 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

un procedimiento conforme a las gmp para la generación de células t modificadas genéticamente

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

El campo de la Terapia Celular Adoptiva (ACT) se ha visto revolucionado por el desarrollo de células modificadas genéticamente, concretamente las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). Estas células modificadas han mostrado respuestas clínicas notables en pacientes con neoplasias malignas hematológicas. Sin embargo, el alto costo de producir estas terapias y realizar evaluaciones exhaustivas de control de calidad ha limitado su accesibilidad a una gama más amplia de pacientes. Para abordar este problema, muchas instituciones académicas están explorando la viabilidad de la fabricación interna de células modificadas genéticamente, al tiempo que se adhieren a las directrices establecidas por las agencias reguladoras nacionales e internacionales.
La fabricación de productos de células T modificadas genéticamente a gran escala presenta varios desafíos, particularmente en términos de las capacidades de producción de la institución y la necesidad de cumplir con los requisitos de cantidad de infusión. Uno de los principales desafíos consiste en producir vectores virales a gran escala bajo las pautas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP), que a menudo se subcontratan a empresas externas. Además, la simplificación del proceso de transducción de células T puede ayudar a minimizar la variabilidad entre los lotes de producción, reducir los costos y facilitar la capacitación del personal. En este estudio, describimos un proceso simplificado para la transducción lentiviral de células T humanas primarias con un marcador fluorescente como gen de interés. Todo el proceso se adhiere a los estándares que cumplen con las GMP y se implementa dentro de nuestra institución académica.

Evaluación de la eficiencia de la transducción Las células transducidas se evaluaron para determinar la expresión del gen de interés (GFP) mediante citometría de flujo. Los resultados representativos se muestran en la Figura 1. En el día 14, más del 95% de las células eran CD3+, lo que indica una activación y expansión exitosa de las células T. La eficiencia de transducción dentro de la población CD3+ se midió en un 58,7% (TD, <strong clas...

Este protocolo describe el proceso de transducción de células T humanas primarias con un gen de interés, lo que garantiza la compatibilidad con los estándares de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Un procedimiento conforme a las GMP para la generación de células T modificadas genéticamente

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

Este protocolo describe un proceso simplificado y compatible con GNP de transducción de células T primarias humanas con genes de interés. Esta técnica en particular ha sido diseñada para ser rentable y cumplir con GNP sin el uso de costosas plataformas de fabricación de sistemas cerrados actualmente disponibles en muchos centros académicos. Este método podría aplicarse potencialmente a la generación de terapias celulares modificadas genéticamente, incluidas, entre otras, las células T con CAR, que han supuesto un cambio de paradigma para abordar las neoplasias malignas hematológicas.Para aislar PBMC de las células recogidas tras la leucoféresis de la sangre del donante, se realiza una centrifugación en gradiente de densidad de la muestra basada en polisacáridos, manteniendo una relación reactivo/muestra de 1:2, centrifugando la mezcla a 800 G durante 30 minutos a temperatura ambiente con los frenos apagados. Luego, con una micropipeta, recoja los PBMC en un tubo limpio de 50 mililitros. Lavar las células dos veces con PBS por centrifugación.Antes de resuspender las células lavadas en medios hematopoyéticos completos. Activar alrededor de 20 millones de células obtenidas añadiendo 1

a-gmp-compliant-procedure-for-the-generation-of-gene-modified-t-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

El video describe un proceso para crear células CAR-T modificadas genéticamente a través del sistema CRISPR-Cas9. La infección de las células T con lentivirus CRISPR y CAR da lugar a modificaciones en el gen diana y a la síntesis de un receptor de antígeno quimérico o CAR, lo que en última instancia conduce a la formación de células CAR-T modificadas genéticamente.

Modificación genética de células CAR-T mediante un sistema CRISPR-Cas9

Este video muestra un ensayo para realizar la edición de genes en células T humanas utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Una mezcla de linfocitos T primarios CD4+ y CD8+ se combina con un complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9, dirigiéndose a genes específicos para su eliminación. Tras la electroporación, el sgRNA guía a Cas9 a la secuencia de ADN objetivo, creando cortes precisos. Estos cortes son reparados por el mecanismo de unión de extremos no homólogos de la célula, lo que lleva a...

Una técnica CRISPR-Cas9 para la edición de genes en células T

Las células T que expresan un receptor CD19 específico de antígeno quimérico (CAR) se infunden como tratamiento de investigación de células B malignas en nuestros primero en humanos ensayos de terapia génica. Se describe la modificación genética de las células T utilizando...

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

Los efectos linfodepletorios e inmunomoduladores de la quimioterapia y la radiación estándar pueden aprovecharse para mejorar la eficacia antitumoral de la inmunoterapia con células T. Describimos un método para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas de EGFRvIII y administrarlas en el contexto del tratamiento estándar del glioblastoma.

Generación de células T CAR para realizar la terapia adoptiva en el contexto de Glioblastoma estándar de cuidado

Aquí se describe un nuevo método para generar receptores de células T específicas de antígeno (TCR) por el emparejamiento de la TCRα o TCR de un TCR existente, que posee la especificidad de antígeno de interés, con hemichain complementaria del repertorio de receptores de células T periféricas. Los TCR de novo generados conservan especificidad de antígeno con afinidad variable.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

Aquí, presentamos un protocolo para editar genéticamente las células CAR-T a través de un sistema CRISPR/Cas9.

Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T

En este artículo se detalla el proceso de fabricación de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos para uso clínico, concretamente utilizando un procesador celular automatizado capaz de realizar la transducción viral y el cultivo de linfocitos T. Proporcionamos recomendaciones y describimos los escollos que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo del proceso y la implementación de un ensayo clínico de fase inicial.

Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo describe un método escalable para la expansión de productos de Terapias Celulares Adoptivas (ACT), concretamente células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR)-T y células Killer inducidas por citocinas (CIK), utilizando dispositivos de expansión rápida permeable a gas (G-Rex), demostrando un crecimiento eficiente y robusto en un entorno clínicamente relevante.

Generación eficiente y rápida de células asesinas inducidas por CAR-T e citocinas en dispositivos escalables por GMP

Aprende un protocolo conforme a GMP para la transducción de células T humanas primarias con genes de interés. Este método rentable facilita la generación de terapias celulares modificadas genéticamente como las CAR-T.

Un procedimiento conforme a las GMP para la generación de células T modificadas genéticamente

Explorar más videos