Name: Ferritinofagia: evaluación de la degradación selectiva del hierro por autofagia en fibroblastos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende a evaluar la ferritinofagia en fibroblastos humanos mediante inmunofluorescencia de alto rendimiento. Este protocolo cuantitativo permite diferenciar vías dependientes e independientes de autofagia para comprender la homeostasis del hierro en BPAN.

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><Líneas celulares fuertes></Fibroblastos humanos primarios derivados ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>la piel&nbsp;</td><td>Biopsia de piel, donante humano sano, Biobanco Clínica Universitaria T&uuml; bingen, Aprobación ética 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, pasaje 9</td><td></td></tr><tr><td>Tratamientos de cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td><fuerte>Concentración final (compuesto)</fuerte></td></tr><tr><td>Medio de control</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>(solo DMSO)</td></tr><tr><td>Medio de control + bafilomicina A1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>100 nM bafilomycin A1</td></tr><tr><td>Medio de control + deferasiox (DFX)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 y micro; M DFX</td></tr><tr><td>Control medio + DFX + bafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 &micro; M DFX, 100 nM bafilomicicina A1</td></tr><tr><td>Medio de control + citrato de amonio férrico (FAC)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC</td></tr><tr><td>Medio de control + FAC + bafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>albúmina [BSA] Fracción V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 cabra a-conejo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 cabra a-ratón</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Placas de 10 cm tratadas con cultivo celular</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin calcio ni magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amonio férrico (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITINA (Bazo humano)</td><td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.05%) con rojo de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos con fondo de vidrio #0 placas Cellvis</td><td></td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.7% paraformaldehído (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA disuelto en PBS, pH 7.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1 100 mM stock</td><td></td><td></td><td>Bafilomycin A1 diluida en DMSO</td></tr><tr><td>Citrato de amonio férrico (FAC) 100 mg/mL stock</td><td></td><td></td><td>FAC diluido en agua bidestilada esterilizada en autoclave</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS, suplementado con 10% Tween20&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, complementado con 10% Tween20, 1% BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel versión 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinofagia: evaluación de la degradación selectiva del hierro por autofagia en fibroblastos humanos

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

Se prepararon fibroblastos primarios derivados de la piel humana (F-CO-60) de donantes sanos (Figura 1A) para las evaluaciones de ferritinofagia utilizando el tratamiento con baflomycin A1 seguido de inmunotinción de ferritina endógena y LAMP2, análisis de imágenes automatizado y análisis basado en CellProfiler (Figura 1B).
La colocalización de la ferritina endógena y de la LAMP2 aumentó tras el bloqueo de la degradación lisosomal de la ferritina mediante la adición de bafilomycina A1, lo que es coherente con su capacidad para inhibir las enzimas V-ATPasa lisosomales y, por tanto, bloquear la ferritinofagia7 (Figura 2). Además, se muestran como ejemplo el reconocimiento celular basado en software, así como el reconocimiento de ferritina y LAMP2 (Figura 2).
En este sentido, debe tenerse en cuenta que la cartera de productos de CellProfiler descrita aquí es extremadamente versátil y se puede adaptar a lecturas adicionales y/o alternativas, como para evaluar los efectos de ciertas mutaciones de BPAN en el crecimiento celular, las mitocondrias u otros orgánulos en el contexto de sistemas funcionales de marcadores unicelulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> Figura 1: Resumen experimental. Representación gráfica de (A) el proceso de ferritinofagia y (B) el flujo de trabajo experimental para evaluar la ferritinofagia en fibroblastos humanos primarios derivados de la piel, tal y como se describe en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes representativas. Los fibroblastos humanos primarios derivados de la piel en medio control (condiciones de alimentación) en (A) ausencia o (B) presencia de bafilomycina A1 se sometieron a un análisis de inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos anti-ferritina y anti-LAMP2, mientras que los núcleos celulares se tiñeron con DAPI. Se presentan ejemplos de imágenes de fluorescencia adquiridas con la automatización de la microscopía de barrido láser confocal (barras de escala: 10 μm). Se observaron cambios en la abundancia y colocalización de ferritina y LAMP2 tras la inhibición lisosomal tras la administración de bafilomycin A1. También se muestra el análisis basado en CellProfiler, que muestra las superposiciones de imágenes derivadas del software de reconocimiento celular (púrpura), núcleos (azul), ferritina (verde), LAMP2 (rojo) y puncta de ferritina/LAMP2 (amarillo) de colocalización. (C) Secciones de imagen ampliadas (barra de escala = 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Configuración de la microscopía confocal de barrido láser utilizada en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Configuración numérica de CellProfiler utilizada en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Archivo complementario 1: La canalización de CellProfiler utilizada en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Visualización de la canalización de CellProfiler (consulte el archivo complementario 1) con capturas de pantalla tomadas en orden consecutivo (consulte la tabla 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Ferritinofagia: evaluación de la degradación selectiva del hierro por autofagia en fibroblastos humanos

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

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Investigación

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Biología

Se presenta un protocolo para la síntesis y cationización de magnetoferritina dopada con cobalto, así como un método para magnetizar rápidamente células madre con magnetoferritina catiónica.

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En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

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