Name: Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende una técnica de imagen bioortogonal sin etiquetas para visualizar el metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos con alta especificidad química y resolución subcelular.

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Agradecemos al Dr. Yajuan Li y Anthony Fung por su apoyo técnico, y al laboratorio Fraley por la línea celular. Agradecemos los fondos iniciales de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 y Hellman Fellow Award.

1. Preparación de los medios
<ol><li>Prepare 10 mL de control y exceso de AAA en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 50% de D2O.<ol><li>Para el medio de control, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de agua bidestilada (ddH2O) en un tubo cónico de 15 ml. El polvo de DMEM contiene todos los aminoácidos en concentraciones estándar. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir 4,7 mL deD2O, 0,5 mL de suero fetal bovino (5% FBS) y 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.</li>
		<li>Para el medio de tratamiento 15x Phe, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de ddH2O, 0,5 ml de FBS (5%) y 0,1 ml de penicilina/estreptomicina (1%) en un tubo cónico de 15 ml. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir el exceso de polvo de Phe a una concentración de 924 mg/L al medio. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.</li>
		<li>Para el medio de tratamiento 15x Tryp, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de ddH2O, 0,5 ml de FBS (5%) y 0,1 ml de penicilina/estreptomicina (1%) en un tubo cónico de 15 ml. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir el exceso de polvo de Tryp a una concentración de 224 mg/L al medio. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada.</li>
		<li>Añadir metionina y treonina a 30,0 mg/mL y 95,0 mg/mL, respectivamente, a todos los tubos cónicos de los pasos anteriores. Vórtice completamente e invierta el tubo. No es necesario añadir piruvato de sodio a los medios de cultivo.</li>
		<li>Filtre los medios de control y tratamiento con un filtro de jeringa de 25 mm con filtros de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.</li>
		<li>Selle todos los tubos cónicos contenidos en medios con parafilm y guárdelos a 4 °C durante un máximo de 3 semanas. Antes de tratar las células con medios, caliente todos los medios a 37 °C. NOTA: Los reactivos en polvo y líquidos deben medirse y combinarse en función del volumen total de medios de tratamiento y control.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de la muestra celular
<ol><li>Mantener las células de cáncer de cuello uterino (HeLa) en un matraz de cultivo (es decir, T10, T25, etc.) utilizando DMEM estándar suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2).</li>
	<li>Sub-cultivo de las células HeLa en una proporción de división de 1:10 hasta alcanzar el 80% o más de viabilidad celular.</li>
	<li>Una vez que las células alcancen el 80% o más de confluencia, proceda a sembrar 2 x 10 5 células por pocillo en una placa de 24 pocillos utilizando DMEM suplementado con0,5 % de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.<ol><li>Antes de la siembra celular, prepare una placa de 24 pocillos con cubreobjetos redondos esterilizados, de poli-d-lisina, recubiertos de laminina, de 12 mm de diámetro. Sumerja los cubreobjetos en etanol al 70% y séquelos suavemente con toallitas sin pelusa. Coloque los cubreobjetos limpios en los pocillos apropiados de la placa.</li>
		<li>Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia en el paso 2.2, lávelas una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x sin iones de magnesio y calcio.</li>
		<li>Añadir tripsina al 0,25% para disociar las células adherentes del matraz e incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 3 min.</li>
		<li>Añadir DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, y recoger las células por centrifugación a 300 x g a temperatura ambiente (RT) durante 3 min.</li>
		<li>Resuspender las células en DMEM suplementado con 0,5% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Cuente las células usando un hemocitómetro, un microscopio óptico y azul de tripán, y siembre una densidad de 2 x 105 células por pocillo de una placa de 24 pocillos. Alternativamente, se puede utilizar un contador de células automatizado para contar las células.</li>
		<li>Regrese las células a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2, y agite suavemente la placa para distribuir las células de manera uniforme.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de 8 h, sustituya el medio de cultivo antiguo por un 50% de D 2 O/exceso de Phe o un 50 % de D2O/exceso de medios Tryp. Devolver las células a la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 36 h.</li>
	<li>Después de 36 h, fije las células en portaobjetos de microscopio.<ol><li>Antes de la fijación, prepare los portaobjetos del microscopio con espaciadores de imagen de 9 mm de diámetro y coloque 15 μL de PBS 1x suplementado con iones de calcio y magnesio.</li>
		<li>Enjuague las células con 1x PBS suplementado con iones de calcio y magnesio.</li>
		<li>Agregue 0,5 ml de solución de paraformaldehído (PFA) al 4% libre de metanol y deje la placa debajo de la cubierta de bioseguridad durante aproximadamente 15 minutos.</li>
		<li>Aspire la solución de PFA y enjuague con 1x PBS suplementado con iones de calcio y magnesio dos veces.</li>
		<li>Agregue 1.5 mL de 1x PBS suplementado con iones de calcio y magnesio en cada pocillo.</li>
		<li>Use pinzas estériles para agarrar suavemente los cubreobjetos de cada pocillo. Invierta y coloque el lado que contiene la célula de los cubreobjetos en los espaciadores de imagen para entrar en contacto con el PBS preparado en el paso 2.5.1. Asegúrese de que el lado que no contiene células esté expuesto al aire.</li>
		<li>Con un esmalte de uñas transparente, selle la capa exterior del cubreobjetos con el espaciador de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Guarde los portaobjetos del microscopio a 4 °C cuando no esté tomando imágenes.</li>
</ol>3. Medición de espectroscopía Raman espontánea (Figura 2)
<ol><li>Utilice un microscopio Raman confocal para obtener espectros Raman espontáneos (Figura 2A).</li>
	<li>Encienda el láser girando la llave a la posición ON .</li>
	<li>Haga doble clic en el icono del software LabSpec6 para abrir el software de adquisición.</li>
	<li>Cargue la muestra biológica en el portamuestras directamente debajo de la lente del objetivo.</li>
	<li>En el software, haga clic en el icono de la cámara para encender la cámara de video.</li>
	<li>Ajuste el plano de enfoque para identificar una región de interés con la lente del objetivo de 50x. Mueva el joystick para controlar la traslación del cepillo de la platina XY y gire el joystick para cambiar la profundidad de enfoque.</li>
	<li>Después de elegir la posición para la medición, cambie a la lente del objetivo de 100x con 40 mW de potencia de excitación. Haga clic en el icono rojo Detener para apagar la cámara de video.</li>
	<li>Seleccione una rejilla de 1800 líneas/mm y ajuste el rango de adquisición de 400 cm-1 a 3.150 cm-1.</li>
	<li>Establezca el Tiempo de adquisición en 90 s, la Acumulación en 3 y la Agrupación en 4 para obtener el menor ruido y el espectro más preciso. NOTA: Estos parámetros de imagen se pueden optimizar para que se ajusten al experimento.</li>
	<li>Haga clic en el icono de flecha para activar la visualización en tiempo real.</li>
	<li>Ajuste el desplazamiento Raman (cm-1) a un valor de elección para ajustar con precisión el plano de enfoque. NOTA: En este experimento, el láser Raman se enfocó en las gotas de lípidos, que contenían una alta concentración de enlaces CH2 . Por lo tanto, se seleccionó para ello un desplazamiento Raman de 2.850 cm-1 que coincidiera con los modos de estiramiento del enlace CH2 .</li>
	<li>Ajuste el plano de enfoque con el joystick para optimizar la mejor relación señal-ruido.</li>
	<li>Después de elegir el plano de enfoque, haga clic en el icono rojo Detener para una visualización en tiempo real.</li>
	<li>Seleccione el icono Círculo para iniciar la adquisición del espectro.</li>
	<li>Una vez tomada la región celular, utilice el mismo plano de enfoque para medir el fondo con PBS. Reste el espectro de fondo de cada espectro objetivo subcelular utilizando una aplicación de software de computadora separada, como Origin (Figura 1B).</li>
</ol>4. Experimentos de imagen con 2PEF y SRS
NOTA: Las descripciones detalladas de la alineación láser SRS se pueden encontrar en un informe anterior28. Este protocolo se centra en el funcionamiento de un sistema multimodal de imágenes SRS y 2PEF (Figura 2C, D).
<ol><li>Haga clic en Iniciar para calentar el láser.</li>
	<li>Siga el orden para encender los interruptores principales de la unidad de control y el monitor: 1) presione el interruptor principal de la caja de control IX3-CBH en On, 2) presione el interruptor principal del controlador del panel táctil en On, 3) presione el interruptor principal del adaptador de CA de la fuente de alimentación para LD OBIS 6 Laser Remote conectado al combinador láser principal FV31-SCOMB en Ony 4) presione el interruptor principal del adaptador de CA de la fuente de alimentación para el control remoto láser LD OBIS 6 conectado al combinador láser secundario FV31-SCOMB a On.</li>
	<li>Presione los interruptores principales del detector de fotodiodos de Si y encienda el amplificador de bloqueo.</li>
	<li>Establezca el haz de Stokes en 1.031 nm, el ancho de pulso en 6 ps y la velocidad de repetición en 80 MHz.</li>
	<li>Acoplado al microscopio, configure el sistema picoEmerald suministrado con el haz de bomba sincronizado con una longitud de onda sintonizable de 720-990 nm, un ancho de pulso de 5-6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz. La potencia de excitación media tanto de la bomba como de Stokes es de 450 mW. Optimice la potencia de excitación para minimizar el fotodaño de la muestra.</li>
	<li>Utilice un condensador de aceite de alta apertura numérica (NA) (es decir, 1,4 NA) para recoger los Stokes y bombear los haces donde se monta la muestra emitiendo unas gotas en el condensador.</li>
	<li>Monte la muestra en el aceite y coloque una gota de agua grande en la parte superior del portaobjetos del microscopio donde se fija la muestra. Esto es para la lente del objetivo de inmersión en agua.</li>
	<li>Ajuste el amplificador de bloqueo a 20 MHz. Procese la imagen ahora usando el módulo de software de súper resolución.</li>
	<li>Seleccione 512 píxeles x 512 píxeles y 80 μs/píxel para el tiempo de permanencia.</li>
	<li>Una vez que la región celular deseada esté enfocada correctamente, adquiera la imagen. Utilizando el software de adquisición del microscopio, guarde las imágenes como un archivo gráfico .oir de Olympus.</li>
	<li>Adquiere una imagen de fondo a 1.900 cm-1 y resta de todas las imágenes celulares.</li>
	<li>Para realizar la obtención de imágenes de 2PEF, utilice el mismo láser de picosegundos sintonizable y establezca la autofluorescencia sin etiquetas de flavina y NADH en 800 nm y 780 nm, respectivamente.</li>
	<li>Utilice un cubo de filtro de 460 nm/515 nm para recoger la emisión retrodispersada de autofluorescencia de flavina y NADH.</li>
	<li>Ajuste el tiempo de permanencia a 8 μs/píxel y el tamaño de píxel a 512 píxeles x 512 píxeles. Ajuste el parámetro de potencia del obturador láser a 150 mW.</li>
	<li>Para la reconstrucción de imágenes en 3D, ajuste la pérdida Raman estimulada a 2.850 cm-1 (797 nm).</li>
	<li>Una vez que se hayan identificado las células individuales deseadas, registre el láser para escanear desde el plano de enfoque superior para detectar las capas superior e inferior de esas células. NOTA: Los modelos 3D se generan y guardan como archivos .oir.</li>
</ol>5. Análisis de espectros e imágenes
<ol><li>Análisis de espectros<ol><li>Utilice el software Origin u otras aplicaciones relevantes para restar el espectro de fondo de todos los espectros objetivo subcelulares.</li>
		<li>Utilice las operaciones de modelado matemático de MATLAB para procesar los espectros Raman con las funciones integradas del software. Python también se puede utilizar para el procesamiento de espectros.<ol><li>El preprocesamiento espectral comienza con la conversión de los archivos en una matriz. Los espectros se interpolan en cada centímetro recíproco.</li>
			<li>Para la validación, grafique los datos sin procesar. Realice la corrección de la línea de base en los espectros sin procesar mediante la función integrada msbackadj en MATLAB. En resumen, la función integrada estima los puntos de línea base en los valores de unidad de separación identificados por los usuarios y devuelve la distancia entre ventanas adyacentes. A partir de los puntos de la línea base, estime y dibuje una línea de regresión. Aplique Suavizado para suavizar la línea de regresión y restar la línea de base de cada espectro sin formato individual.</li>
			<li>Realice la normalización mínima-máxima dividiendo la intensidad Raman de la proteína a 2.930 cm-1 por la intensidad de cada desplazamiento Raman. La señal de 2.930 cm-1 suele ser la intensidad más alta del espectro Raman. Con esta normalización, el valor máximo se transforma en un 1, mientras que el valor mínimo se transforma en un 0. Todos los demás valores se transforman en un decimal entre 0 y 1.</li>
			<li>Promedie los espectros individuales de la misma condición en un solo espectro para reducir el ruido.</li>
		</ol></li>
		<li>Una vez procesado, utilice aplicaciones, como Origin, para mostrar todos los espectros simultáneamente. Los picos que se muestran en los espectros representan un enlace químico específico o un grupo funcional.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de imágenes 3D de gotas lipídicas<ol><li>Utilice el software FIJI-ImageJ para procesar todas las imágenes 3D</li>
		<li>Realice las funciones Filtros de paso de banda y Suavizado para las pilas de imágenes 3D.</li>
		<li>Para el análisis de imágenes en 3D, asigne cada gota de lípido a una puntuación esférica calculada midiendo la distancia entre su centro de masa y la superficie. Compara cada partitura esférica con una partitura esférica de una esfera perfecta en el mismo plano euclidiano. Deseche las gotas de lípidos con puntuaciones esféricas bajas y evalúe las gotas de lípidos restantes para determinar su volumen y recuentos.</li>
		<li>Analice el volumen y los recuentos de gotas de lípidos entre diferentes tratamientos para determinar la significación estadística en una aplicación de software estadístico adecuada. En este caso, se utilizó GraphPad Prism.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de imágenes hiperespectrales 2D<ol><li>Utilice el software FIJI-ImageJ para procesar todas las imágenes hiperespectrales 2D.</li>
		<li>Seleccione el canal 2.930 cm-1 para crear una imagen de máscara que contenga valores 0 y 1. Asigne el fondo a 0 y la región celular a 1.</li>
		<li>Reste el canal de proteína marcado con deuterio (2.175 cm-1) al canal de fondo (1.900 cm-1) para eliminar los efectos fluorescentes.</li>
		<li>Divida el canal proteico resultante marcado con deuterio por el canal proteico (2.930 cm-1) para obtener imágenes radiométricas de la tasa de recambio proteico.</li>
		<li>A continuación, multiplique la imagen de máscara realizada en el paso 5.3.2 por las imágenes radiométricas para eliminar los ruidos de fondo restantes. Como resultado, se genera un fondo oscuro en cada imagen radiométrica.</li>
		<li>Utilice la herramienta Selección a mano alzada en FIJI-ImageJ para segmentar y calcular manualmente las intensidades de píxeles que se muestran en celdas individuales. Las intensidades de píxeles corresponden a las concentraciones del enlace químico que se está visualizando.</li>
		<li>Analice las intensidades de píxeles para determinar la significación estadística en una aplicación de software estadístico adecuada. En este caso, se utilizó GraphPad Prism. Repita este análisis con el análisis radiométrico restante.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+lipid+metabolic+changes+in+drosophila+ovary+during+aging+using+DO-SRS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy.</a> Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).</li>
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<li>Hoang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+resolution+DO-SRS+and+2PEF+imaging+of+metabolic+dynamics+regulated+by+L-methionine+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Biopsy+XXI%3A+Toward+Real-Time+Spectroscopic+Imaging+and+Diagnosis.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).</li>
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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+metabolic+imaging+uncovers+sex-+and+diet-dependent+lipid+changes+in+aging+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-molecular+hyperspectral+PRM-SRS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

Las imágenes DO-SRS y 2PEF se han aplicado para investigar la dinámica metabólica en varios modelos ex vivo, incluyendo Drosophila y tejidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. La modalidad de imagen utilizada en este estudio integra DO-SRS y microscopía 2PEF, que puede superar a otros mé...

Al ser aminoácidos aromáticos esenciales (AAA), la fenilalanina (Phe) y el triptófano (Tryp) pueden ser absorbidos por el cuerpo humano para sintetizar nuevas moléculas para mantener las funciones biológicas normales1. La Phe es necesaria para la síntesis de proteínas, melanina y tirosina, mientras que Tryp es necesaria para la síntesis de melatonina, serotonina y niacina 2,3. Sin embargo, el consumo excesivo de estos AAA puede aumentar la diana de la vía de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos, inhibir la proteína quinasa activada por AMP e interferir con el metabolismo mitocondrial, alterando colectivamente la biosíntesis de macromoléculas y conduciendo a la producción de precursores malignos, como las especies reactivas de oxígeno (ROS) en células sanas 4,5,6. La visualización directa de la dinámica metabólica alterada bajo un exceso de regulación de AAA es esencial para comprender el papel de los AAA en la promoción del desarrollo del cáncer y el crecimiento de células sanas 7,8,9.
Los estudios tradicionales de AAA se basan en la cromatografía de gases (GC)10. Otros métodos, como la resonancia magnética (RM), tienen resoluciones espaciales limitadas, lo que dificulta la realización de análisis celulares y subcelulares de muestras biológicas11. Recientemente, se ha desarrollado la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) para dilucidar el papel de los AAA en la síntesis de lípidos y proteínas en la proliferación del cáncer con biomarcadores no invasivos12,13,14. Sin embargo, esta técnica todavía adolece de profundidades de imagen poco profundas, poca resolución espacial y una amplia preparación de la muestra. A nivel celular, los isótopos estables no tóxicos, como el nitrógeno-15 y el carbono-13, se pueden rastrear con imágenes de isótopos múltiples y espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala para comprender su incorporación en macromoléculas. Sin embargo, estos métodos son destructivos para las muestras biológicas vivas15,16. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es otra técnica poderosa que puede visualizar la dinámica metabólica17. Por otro lado, la lentitud de la exploración durante las imágenes AFM puede provocar una distorsión de la imagen del resultado debido a la deriva térmica.
Desarrollamos una modalidad de imagen biortogonal no invasiva mediante el acoplamiento de la microscopía de dispersión Raman estimulada por sonda de óxido de deuterio (D2O) y la microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones sin marcaje (2PEF). Esta modalidad logra una alta resolución espacial y especificidad química al tomar imágenes de muestras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo presenta las aplicaciones de DO-SRS y 2PEF para examinar la dinámica metabólica de los lípidos, las proteínas y los cambios en la proporción redox durante la progresión del cáncer. Dado que elD2Oes una forma isotópica estable del agua, las biomoléculas celulares pueden marcarse con deuterio (D) debido a su rápida compensación con el agua corporal total en las células, formando enlaces carbono-deuterio (C-D) a través del intercambio enzimático21. Los enlaces C-D en macromoléculas recién sintetizadas, incluidos lípidos, proteínas, ADN/ARN y carbohidratos, se pueden detectar en la región silenciosa celular del espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Con dos pulsos láser sincronizados, los enlaces C-D de lípidos y proteínas recién sintetizados se pueden mostrar en células individuales a través de imágenes hiperespectrales (HSI) sin extraerlos ni marcarlos con agentes citotóxicos. Además, la microscopía SRS tiene la capacidad de construir modelos tridimensionales (3D) de regiones seleccionadas de interés en muestras biológicas mediante la captura y combinación de un conjunto de imágenes transversales22,26. Con imágenes hiperespectrales y volumétricas en 3D, DO-SRS puede obtener distribuciones espaciales de macromoléculas recién sintetizadas en células individuales, junto con el tipo de orgánulos que facilitan el proceso de promoción del crecimiento del cáncer bajo la regulación AAA22. Además, utilizando 2PEF, podemos obtener señales de autofluorescencia de flavina y nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) con alta resolución, profundidad de penetración profunda y daño de bajo nivel en muestras biológicas21,23,24. Las señales de autofluorescencia de flavina y NADH se han utilizado para caracterizar la homeostasis redox y la peroxidación lipídica en células cancerosas22,26. Como tal, el acoplamiento de DO-SRS y 2PEF no solo proporciona un análisis subcelular de la dinámica metabólica regulada por AAA en células cancerosas con alta distribución espacial, información de especificidad química y preparación mínima de muestras, sino que el método también reduce la necesidad de extraer o marcar moléculas endógenas con reactivos tóxicos. En este protocolo, primero presentamos los procedimientos de preparación deD2Oy aminoácidos, así como el cultivo de células cancerosas. A continuación, se muestran los protocolos de imagen DO-SRS y 2PEF. Finalmente, presentamos los resultados representativos de las imágenes SRS y 2PEF, que demuestran los cambios metabólicos regulados por AAA de lípidos y proteínas, y los cambios en la relación redox en las células cancerosas. En la Figura 1 se destaca una ilustración detallada del proceso.

<table><tbody><tr><td>Pipetas serológicas de 10 mL&nbsp;</td><td>Avantor (by VWR)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16 % de formaldehído, sin metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906</td></tr><tr><td>placa</td> <td>de 24 pocillosFisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de 25 mm, 2 &mu; m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003</td></tr><tr><td>460 nm Cubo de filtro</td><td>Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>Adaptadores de CA de la fuente de alimentación para LD OBIS 6 Laser Remote</td><td>Olympus</td><td></td><td>Suministro de energía al láser</td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>Terminador BNC de 50 ohmios&nbsp;</td><td>Mini Circuitos</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cable BNC</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>Cable Coaxial, BNC Macho/Macho</td></tr><tr><td>Banda Ancha Espejo</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Condensador</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de Vidrio</td><td>Corning</td><td>2850-25</td><td>Fuente</td></tr> de <tr><td>alimentación de CC</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Montaje dicroico</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de cultivo celular de sulfóxido de dimetilo</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf</td></tr><tr><td>El águila modificada de Dulbecco' s Medio sin metionina, treonina y piruvato de sodio</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Con bicarbonato de sodio y sin metionina, treonina y piruvato de sodio&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s</td><td>Medium Corning</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ ImageJ</td><td>Versión 1.53t 24 de agosto de 2022</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Agua pesada (óxido de deuterio)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Hela Cells</td><td></td><td>ATCC CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Hemocymeter</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de alto diámetro exterior</td><td>Tecnología de croma</td><td>ET890/220m</td><td>Filtre el haz de Stokes y transmita el haz de la bomba</td></tr><tr><td>HyClone Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Trypsina 0.25% (1x) Solución</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Sistema Láser SRS Integrado</td><td>Física Aplicada & Electrónica, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD proporciona un pulso de salida a 1031 nm con un ancho de pulso de 6 ps y una tasa de repetición de 80 MHz, que sirve como haz de Stokes. El haz de frecuencia duplicada a 532 nm se utiliza para sembrar sincrónicamente un oscilador paramétrico óptico (OPO) de picosegundos para producir un tren de pulsos de modo bloqueado con un ancho de pulso de cinco ~ 6 ps (el haz loco del OPO está bloqueado con un filtro interferométrico). La longitud de onda de salida del OPO es sintonizable desde 720 &ndash; 950 nm, que sirve como haz de bombeo. La intensidad del haz de Stokes de 1031 nm es modulada sinusoidalmente por un EOM incorporado a 8 MHz con una profundidad de modulación de más del 90%. El haz de la bomba se superpone espacialmente con el haz de Stokes mediante el uso de un espejo dicroico dentro de picoEMERALD. La superposición temporal entre la bomba y los pulsos de Stokes se logra con una etapa de retardo incorporada y se optimiza mediante la señal SRS de D2O puro en el microscopio.</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser invertido</td><td>Olympus FV1200MPE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH Caja de control</td><td>Olympus</td><td></td><td>Controle el microscopio de barrido láser</td></tr><tr><td>Montaje de espejo cinemático</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 Ajustadores hexagonales de perfil bajo</td></tr><tr><td>L-fenalinina</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-triptófano</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr> <tr><td>Lock-In</td><td>Amplifier Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>Divisor de haz dicroico de paso largo</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>láser de 980 nm BrightLine divisor de haz dicroico plano láser de un solo borde</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Versión: R2022b</td><td></td></tr><tr><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-003</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003</td></tr><tr><td>Microscopía Software de Imagen</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[foco]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>Condensador de aceite NA</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>6-U130</td><td></td></tr><tr><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser Esmalte de uñas</td><td>Wet n Wild</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>Origen</td><td>OriginLab</td><td>Origen 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco)</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>Termofischer de penicilina/estreptomicina</td><td>- Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Conjunto de periscopio</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>Incluye las unidades superior e inferior, &Oslash; Poste de 1" y horquilla de apriete.</td></tr><tr><td>picoEmerald System</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ <tr><td>Caja blindada con conectores BNC</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>Caja de aluminio con cubierta, BNC Detector</td></tr><tr><td>de fotodiodos de silicio</td> hembra/hembra Serie <td>N/A</td><td>DYI construidos</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> en casa <tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr> <tr><td>Espectroscopía Raman Espontánea</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/</td></tr> <tr><td>Microscopía de Dispersión Raman Estimulada</td><td>Home Built</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Touch&nbsp; Controlador de panel</td><td>Olympus</td><td></td><td>Controle la dirección X-Y del microscopio de escaneo láser</td></tr><tr><td>Azul de tripán 0,4% (0,85% NaCl)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Kaverme - Amazon</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>Microscopía de fluorescencia de excitación de fotones</td><td>construida en casa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Papel de pesaje&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper</td></tr><tr><td>Zurich LabOneQ Software</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>Controle el amplificador de bloqueo de Zúrich</td></tr></tbody></table>

imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Los aminoácidos aromáticos esenciales (AAA) son componentes básicos para sintetizar nuevas biomasas en las células y mantener las funciones biológicas normales. Por ejemplo, un suministro abundante de AAA es importante para que las células cancerosas mantengan su rápido crecimiento y división. Con esto, existe una creciente demanda de un enfoque de imagen altamente específico y no invasivo con una preparación mínima de la muestra para visualizar directamente cómo las células aprovechan los AAA para su metabolismo in situ. Aquí, desarrollamos una plataforma de imágenes ópticas que combina el sondeo de óxido de deuterio (D2O) con la dispersión Raman estimulada (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescencia de excitación de dos fotones (2PEF) en un solo microscopio para visualizar directamente las actividades metabólicas de las células HeLa bajo regulación AAA. En conjunto, la plataforma DO-SRS proporciona una alta resolución espacial y especificidad de proteínas y lípidos recién sintetizados en unidades celulares HeLa individuales. Además, la modalidad 2PEF puede detectar señales de autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina de forma libre de marcas. El sistema de imágenes descrito aquí es compatible con modelos in vitro e in vivo , lo que es flexible para varios experimentos. El flujo de trabajo general de este protocolo incluye el cultivo celular, la preparación de los medios de cultivo, la sincronización celular, la fijación celular y la obtención de imágenes de muestras con las modalidades DO-SRS y 2PEF.

La adición de un exceso de AAA a concentraciones de 15x a los medios de cultivo celular que contienen D2O al 50% produjo distintas bandas C-D Raman de lípidos y proteínas recién sintetizados en células HeLa (Figura 2B). Los experimentos anteriores se realizaron con diferentes niveles de concentración, como 2x y 5x, y aunque no se presentan los datos, la concentración de 15x produjo las bandas C-D Raman más distintivas de lípidos y proteínas recién sintetizados. Específicamente, al...

Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).

Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Presentamos una nueva técnica de imagen con capacidad sin marcas, alta especificidad química y resolución subcelular. Nuestra metodología puede responder a preguntas sobre la disfunción metabólica en el envejecimiento y enfermedades como el cáncer La obtención de imágenes Raman, junto con la fluorescencia de dos fotones y la generación de segundos armónicos, ofrece una tecnología de imagen no destructiva y sin etiquetas que requiere una preparación mínima de la muestra y logra una alta resolución subcelular sin dañar la muestra celular. Varias modalidades de imágenes se operan como parte de nuestra plataforma.Las personas deben seguir nuestro protocolo lo mejor que puedan, teniendo en cuenta que nuestro sistema está construido en casa. A lo largo del camino, deben desarrollar su propia práctica para garantizar el éxito. En dos tubos separados, comience midiendo y mezclando 10 miligramos de polvo de DMEM con 4,7 mililitros de agua destilada doble en un tubo cónico de 15 ml.Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Para ambos tubos, agregue 4,7 ml de óxido de deuterio, 0,5 ml de FBS y 0,1 ml de penicilina y estreptomicina antes de vórtice e invertir el tubo. A continuación, agregue el exceso de fenilalanina a un tubo y el exceso de triptófano en polvo al segundo tubo y mezcle nuevamente.Agregue metionina y treonina a 30 y 95 mg por ml, respectivamente, a ambos tubos, seguido de vórtice e inversión del tubo. A continuación, filtre los medios preparados con un filtro de jeringa de 25 milímetros con filtros de 0,22 micrómetros. Selle todos los medios contenidos en tubos cónicos con Parafilm.Almacene los medios preparados a cuatro grados centígrados. Mantener las células sanadoras en un matraz de cultivo utilizando DMEM estándar suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina. Subcultive las células sanadoras en una proporción dividida de uno a 10 hasta alcanzar el 80% o más de viabilidad celular.Antes de sembrar las células, sumerja los cubreobjetos redondos de 12 mm de diámetro de poli-D-lisina esterilizados, recubiertos de laminina, en etanol al 70%. Seque los cubreobjetos con toallitas sin pelusa y colóquelos limpios en los pocillos apropiados de la placa. Lavar las células una vez con PBS sin iones de magnesio y calcio.Añadir 0,25% de tripsina para disociar las células de adherencia del matraz e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres minutos. A continuación, añada DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina a las células. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.Recoger las células por centrifugación a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender las células en DMEM suplementadas con 0,5% de FBS y 1% de penicilina y estreptomicina. Cuente las células teñidas con azul de tripano con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico y siembre a una densidad de dos veces 10 a la quinta célula por pocillo de una placa de 24 pocillos.Distribuya las células uniformemente agitando suavemente la placa. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de ocho horas, reemplace el medio de cultivo antiguo con un 50 % de óxido de deuterio y un exceso de fenilalanina o un 50 % de óxido de deuterio y un exceso de triptófano.Regrese las células a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 36 horas. Ahora prepare portaobjetos de microscopio con espacios de imagen de nueve mm de diámetro. Coloque 15 microlitros de PBS, suplementados con iones de calcio y magnesio y enjuague las células con la misma solución.Añadir 0,5 ml de solución de paraformaldehído sin metanol al 4% y dejar la placa bajo la cubierta de bioseguridad durante 15 minutos. Aspire la solución de paraformaldehído y enjuáguela con PBS, suplementado con hierro de calcio y magnesio dos veces. Agregue un ml de PBS, suplementado con iones de calcio y magnesio a cada pocillo.Utilice pinzas estériles para quitar los cubreobjetos de cada pocillo con cuidado. Inviértalos y coloque el lado contenedor de la célula en los espacios de imagen en contacto con el PBS. Selle la capa exterior del cubreobjetos con el espaciador de imágenes con esmalte de uñas transparente.Cargue la muestra biológica en el portamuestras directamente debajo de la lente del objetivo. A continuación, haga clic en el icono de la cámara en el software para encender la cámara de vídeo y ajustar el plano de enfoque para identificar una región de interés con el objetivo de 50X. Cambie a la lente del objetivo de 100X.Haga clic en el icono de parada para apagar la cámara de vídeo. A continuación, seleccione una rejilla de 1.800 líneas por mm y ajuste el rango de adquisición de 400 a 3.150 centímetros inverso. Por último, establezca el tiempo de adquisición en 90 segundos, la acumulación en tres y el binning en cuatro para obtener el menor ruido y el espectro más preciso.Haga clic en iniciar para calentar el láser. Comience presionando el interruptor principal de la caja de control IX3CBH a On, seguido del interruptor principal del controlador del panel táctil. Luego encienda el interruptor principal del adaptador de CA de la fuente de alimentación para LDOBIS6 control remoto láser conectado al peine del combinador láser principal FV31S.Encienda también el adaptador de CA de la fuente de alimentación remota láser LDOBIS6 conectada al peine del combinador láser secundario FV31S. Después de eso, presione los interruptores principales del detector de fotodiodos SI y encienda el amplificador de bloqueo. Ajuste el láser IR a 1031 nanómetros Ajuste el sistema pico esmeralda a una longitud de onda sintonizable entre 720 y 990 nm.Monte la muestra en el aceite y coloque una gota de agua grande en el portaobjetos del microscopio donde se fija la muestra. Seleccione el tamaño de escaneo como 512 por 512 píxeles. Adquiera y guarde las imágenes como un Olimpo.Archivo gráfico OIR. Después de configurar la señal en 862.0, adquiera una imagen de fondo y guárdela. Ajuste el tiempo de permanencia a ocho microsegundos por píxel y el tamaño de píxel a 512 por 512 píxeles.Ajuste el parámetro de potencia del obturador láser a 150 milivatios Para la reconstrucción de imágenes en 3D, ajuste la pérdida Raman estimulada a 2.850 cm inverso. Una vez que se hayan identificado las células individuales deseadas, registre el láser para escanear desde el plano de enfoque superior para detectar las capas superior e inferior de esas células. Se utilizó óxido de deuterio, sondeado, estimulado por dispersión Raman para visualizar la distribución espacial de las señales de CD en células individuales.Las células control mostraron bandas moderadas de CD, lípidos y proteínas. Sin embargo, el viaje de 15 x v y 15 x mostró prohibiciones de lípidos y proteínas de CD más fuertes. El análisis cuantitativo indicó que el exceso de aminoácidos aromáticos puede aumentar la síntesis de lípidos en un 10 a 17%, pero regular a la baja la síntesis de proteínas en un 10%.Se muestra la proyección de volumen de gotas lipídicas Raman 3D estimuladas en células sanadoras bajo control y condiciones de exceso de aminoácidos aromáticos. Los análisis cuantitativos de las gotas de lípidos en 3D mostraron un aumento en los recuentos, pero una reducción en el tamaño de las células tratadas con aminoácidos aromáticos en comparación con el control. Los parámetros de imagen para las imágenes fluorescentes Raman y de dos fotones deben optimizarse de una muestra a la siguiente para garantizar la mejor calidad de imagen.Las personas pueden acoplar nuestro sistema con la generación de segundos armónicos para estudiar la estructura del colágeno, que dilucida los cambios metabólicos tempranos en el envejecimiento y las enfermedades, y comprender la progresión de la neurodegeneración o el cáncer. Nuestra tecnología es la primera de este tipo en visualizar la síntesis de lípidos y proteínas en sistemas biológicos con alta resolución subcelular. La tecnología también se puede trasladar a la clínica para la detección no invasiva de enfermedades.

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Bioengineering

Bioingeniería

13 C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.

Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Este protocolo describe imágenes de fluorescencia y análisis de las coenzimas metabólicas endógenas, nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD). Las imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD proporcionan un método no destructivo sin etiquetas para evaluar el metabolismo celular.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar el metabolismo celular

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza la hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH), también conocida como FOL fototérmico de infrarrojo medio (MIP-FISH), para identificar células individuales y comprender su metabolismo. Esta metodología se puede aplicar ampliamente para diversas aplicaciones, incluido el mapeo del metabolismo celular con resolución de una sola célula.

Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

Este protocolo integra un sistema de biorreactor hecho a medida con espectroscopia de RMN de ¹³C hiperpolarizada para medir el metabolismo del piruvato en tiempo real en células vivas, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética para estudios metabólicos y aplicaciones de detección de fármacos.

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizada (TC).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Aprende una técnica de imagen bioortogonal sin etiquetas para visualizar el metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos con alta especificidad química y resolución subcelular.

Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

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