Name: Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a preparar perlas de látex para ensayos inmunológicos utilizando anticuerpos IgY de yema de huevo. Este protocolo estandarizado mejora la sensibilidad en la detección de antígenos mediante citometría de flujo.

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Agradecemos a la FIOCRUZ (Programa de excelencia en pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA), al Programa de Posgrado en Biotecnología (PPGBIOTEC de la Universidade Federal do Amazonas - UFAM), a la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) y a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) por la concesión de las becas. La Figura 2 y la Figura 4 se crearon con biorender.com.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.
1. Extracción de IgY de yemas de huevo
<ol><li>Higienización de los óvulos<ol><li>Sumerja los huevos (recién puestos o hasta 4 días después de la puesta, del linaje Gallus gallus Dekalb White) en una solución diluida al 0,2% de hipoclorito de sodio, enjuague rápidamente con agua corriente y limpie suavemente para su uso posterior o inmediato. NOTA: Si no se utiliza inmediatamente, manténgalo a 4 °C durante un máximo de 15 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Separación de las yemas<ol><li>Rompe el huevo con cuidado, y separa la yema de la clara con ayuda de un separador de yemas.</li>
		<li>Retira el exceso de blanco con ayuda de papel de filtro. Perfore la yema y recoja su interior en un tubo cónico de 50 ml. Conservar la yema a -20 °C durante al menos 24 h antes de su uso. NOTA: Durante estos experimentos (datos no mostrados), se observó que el uso de yemas que no habían sido congeladas previamente dificultaba el aislamiento de inmunoglobulinas de la porción lipídica de las yemas.</li>
	</ol></li>
	<li>Acidificación de las yemas<ol><li>Descongelar la yema almacenada y diluirla en una proporción de 1:10 en PBS de 1 mM. Ajustar el pH de la solución a 5 con 1 N HCl, e incubar la solución a 4 °C durante 6-24 h.</li>
		<li>Centrifugar la solución a 3.000 × g durante 40 min, recuperar el sobrenadante y filtrarlo con un filtro de celulosa de 0,7 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitación de lípidos con ácido caprílico<ol><li>Reajustar el pH de los sobrenadantes a 5 y añadir el ácido caprílico (≥concentración inicial del 98%) hasta una concentración final del 8,7% con agitación constante durante 30 min a 4 °C. NOTA: El volumen del sobrenadante puede variar en función de la masa lipídica precipitada en el paso 1.3.2. Así, por ejemplo, se deben añadir 3,107 mL de ácido caprílico a 35 mL del sobrenadante obtenido tras la filtración.</li>
		<li>Centrifugar las muestras durante 15 min a 18.600 × g, y separar el sobrenadante del material precipitado.</li>
		<li>Vuelva a ajustar el pH de la solución a 7,4 utilizando NaOH 1 M, cuantifique los anticuerpos utilizando el ensayo de Bradford8 y almacene los anticuerpos a -20 °C hasta el momento de su uso. NOTA: Los anticuerpos se obtuvieron a una concentración de 1 μg/μL, la cual se verificó mediante un gel SDS-PAGE al 12%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Curva de saturación de anticuerpos IgY frente a perlas de látex
<ol><li>Acoplamiento de las perlas a los anticuerpos IgY<ol><li>Añadir 21 μL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, concentración inicial de 367 mM) y 21 μL de N-hidroxisuccinimida (NHS, concentración inicial de 50 mM) a 21 μL de perlas de látex (4% p/v), y ajustar a un volumen final de 2,1 mL con PBS filtrado de 10 mM. NOTA: El rango de pH de la solución de PBS debe estar entre 7.2 y 7.4, ya que en este trabajo se observó un cambio negativo en el acoplamiento y otros pasos al usar una solución fuera de este rango.</li>
		<li>Incubar a 22 °C con agitación rápida durante 3 h.</li>
		<li>Añadir 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg y 0 μg del anticuerpo de captura IgY-PfHRP2 previamente extraído (ver paso 1.4.3) a diferentes microtubos que contengan 100 μl de la solución descrita en el paso 2.1.1 (0,04% de concentración final de perlas), e incubar en las mismas condiciones descritas en el paso 2.1.2 durante 16 h.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 857 × g a 15 °C durante 5 min, desechar los sobrenadantes y lavar las perlas de látex dos veces con 500 μL de PBS filtrado de 10 mM (0,008% de concentración final de perlas) mediante ciclos de centrifugación y resuspensión. NOTA: No exceda los 857 × g, ya que en este trabajo, se observó que más allá de esta velocidad las cuentas sufren deformaciones que alteran negativamente el resultado de la prueba.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueo de las cuentas<ol><li>Resuspender las muestras en 1 ml de tampón de bloqueo (0,004% de concentración final de perlas) (10 mM de PBS filtrado + albúmina sérica bovina, BSA, 5%) e incubar en las mismas condiciones descritas en el paso 2.1.2 durante 2 h.</li>
		<li>Después del bloqueo, lavar como se describe en el paso 2.1.4 y volver a suspender en un tampón PBS de 10 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación con anticuerpos secundarios anti-pollo marcados con Alexa Fluor 488<ol><li>Añadir 100 μL de anticuerpo fluorescente anti-pollo (2 mg/mL) diluido a 1:2.000 en 10 mM de PBS + 0,5% de BSA a cada microtubo, como se describe en el paso 2.1.3.</li>
		<li>Incubar las muestras como se describe en el paso 2.1.2, esta vez en la oscuridad, durante 30 min.</li>
		<li>Lave las perlas como en el paso 2.1.4 y vuelva a suspenderlas con 250 μL de 10 mM de PBS filtrado de 10 mM (0,016% de concentración final de perlas). Realice la lectura del citómetro de flujo como se describe en la sección 5. NOTA: A partir de los datos de porcentaje de fluorescencia obtenidos, obsérvese el punto inicial de formación de la meseta (1 μg, como se observa en este estudio). Recomendamos utilizar el segundo punto de la meseta (2 μg, como se observa aquí) para los siguientes pasos (Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig01.jpg"> Figura 1: Gráfico del análisis de citometría de flujo para determinar el punto de saturación del acoplamiento del anticuerpo IgY-PfHRP2 a las perlas de látex. El eje x representa la concentración de anticuerpos y el eje Y representa el porcentaje de fluorescencia obtenido. Prueba de Kruskal-Wallis, p &lt; 0,0033. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65123/65123fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Ensayo de citometría de flujo basado en perlas de látex para la detección de antígenos
<ol><li>Después de determinar el punto de saturación de los anticuerpos IgY frente a las perlas de látex, vuelva a realizar el proceso de activación de las perlas, de acuerdo con el paso 2.1.1.<ol><li>Acoplar las perlas a la concentración de saturación observada (como se describe en el paso 2.1.3) e incubar de acuerdo con el paso 2.1.2. NOTA: En los ensayos realizados con el anticuerpo IgY-Pf HRP2, la condición de saturación fue de 2 μg por cada 1 μL de perlas de látex.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloquee y lave las cuentas de acuerdo con el paso 2.2.</li>
	<li>Incubación con el antígeno<ol><li>Para determinar el límite de detección, distribuya el equivalente a 100 μL de la preparación de gránulos bloqueados en tubos que contengan diferentes cantidades de la proteína recombinante Pf HRP2 (1 μg/mL) (r PfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg y 0 μg) diluidos en 10 mM de PBS + 0,5% de BSA por triplicado. NOTA: Esta proteína recombinante fue desarrollada en el trabajo de Sousa et al.9.</li>
		<li>Incubar las soluciones de perlas con la proteína rPfHRP2 como se describe en el paso 2.1.2 durante 1 h.</li>
		<li>Realice los lavados como se describe en el paso 2.1.4 y deseche el sobrenadante después de la centrifugación.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación con el anticuerpo primario<ol><li>Añadir 2 μg de anticuerpo IgG de ratón contra la proteína rPfHRP2 diluido en 10 mM de PBS + 0,5% de BSA hasta un volumen final de 100 μL en cada muestra. Incubar las muestras como se describe en el paso 2.1.2 y desechar el sobrenadante después de la última centrifugación. NOTA: Este anticuerpo fue desarrollado en el trabajo de Sousa et al.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación con el anticuerpo secundario<ol><li>Añadir 100 μL de anticuerpo fluorescente anti-ratón (2 mg/mL) diluido a 1:2.000 en 10 mM de PBS + 0,5% de BSA a cada muestra. Incubar como se describe en el paso 2.1.2 y volver a suspender en 250 μL (0,016% de concentración final de perlas) de PBS filtrado de 10 mM. Realice la lectura de acuerdo con la sección 5.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lectura del citómetro de flujo de las muestras
<ol><li>Ajuste de citometría: Alineación de los parámetros ópticos del citómetro acoplado a un ordenador<ol><li>Encienda la computadora y el citómetro de flujo, y espere unos minutos para que el equipo se conecte a la computadora.</li>
		<li>Haga clic en el software de citometría instalado en la computadora e inicie sesión en él. En el espacio de trabajo de software, seleccione Citómetro | Puesta en marcha | Modo limpio | Líquidos SIT. NOTA: Las burbujas de aire y las obstrucciones deben eliminarse durante el proceso de inicio del citómetro antes de la adquisición de la muestra.</li>
	</ol></li>
	<li>Control de calidad<ol><li>Utilice el reactivo de control de calidad para comprobar los voltajes de los tubos fotomultiplicadores y evaluar la sensibilidad del citómetro.</li>
		<li>Coloque el reactivo de configuración del citómetro y las perlas de seguimiento en un tubo de poliestireno con tapa de 12 mm x 75 mm.</li>
		<li>Mezcle suavemente el tubo mediante vórtice.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de las perlas de suspensión<ol><li>Para definir la línea de base, agregue 0,5 ml de diluyente (10 mM de PBS filtrado, pH 7) y tres gotas de perlas al tubo de poliestireno tapado de 12 mm x 75 mm. Agite el tubo suavemente antes de usarlo.</li>
		<li>En el espacio de trabajo del software del citómetro, seleccione Citómetro | CST y espere a que el citómetro se desconecte de la interfaz del software del citómetro y se conecte a la interfaz CS&amp;T. Observe el siguiente mensaje en la barra de estado del software del citómetro en la parte inferior de la pantalla: Citómetro desconectado.</li>
		<li>Utilice el tubo de poliestireno con tapa de 12 mm x 75 mm que contiene el reactivo de control de calidad y conéctelo a la sonda del citómetro de flujo.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificación de la configuración del citómetro<ol><li>En la ventana Resumen del sistema , compruebe que la configuración del citómetro es adecuada para el experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración para una comprobación de rendimiento<ol><li>Seleccione el ID de las cuentas de configuración correspondiente al lote de cuentas de investigación de CS&amp;T.</li>
	</ol></li>
	<li>Comprobación del rendimiento<ol><li>Conecte el tubo a la sonda del citómetro de flujo y haga clic en la ventana Control de configuración . Seleccione Comprobar rendimiento y haga clic en Ejecutar.</li>
		<li>Una vez completada la comprobación de rendimiento, espere a que se abra un cuadro de diálogo. Realice una de las siguientes acciones:<ol><li>Para ver el informe de rendimiento del citómetro , haga clic en Ver informe.</li>
			<li>Para completar la comprobación de rendimiento y volver a la vista de configuración del espacio de trabajo, haga clic en Finalizar.</li>
			<li>Observe el resultado final del análisis morfométrico y de sensibilidad a la fluorescencia que aparece en Resumen del sistema | Resultado de rendimiento del citómetro con el estado PASSED.</li>
			<li>Retire el tubo del citómetro. Compruebe los resultados de rendimiento del citómetro que se muestran en la ventana Resumen del sistema .</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Análisis de muestras mediante citometría de flujo
<ol><li>Inicie sesión en el software del citómetro.<ol><li>En el espacio de trabajo del software del citómetro, seleccione Citómetro | Modo limpio | Líquidos SIT.</li>
		<li>Ajústese al espacio de trabajo del software.</li>
		<li>Definir la estrategia de compuerta en función de las características morfométricas y de fluorescencia de las partículas de control negativo (perlas sin fluorescencia).</li>
		<li>Para determinar la morfometría de la célula, elija Gráfico de diagrama de puntos para el análisis de los parámetros FSC-A utilizando SSC-A (Figura complementaria 1A).</li>
		<li>Determine celdas individuales por SSC usando el gráfico de diagrama de puntos para el análisis de SSC-H en el eje y y SSC-W en el eje x (Figura complementaria 1B), y determine celdas individuales por FSC usando el gráfico de diagrama de puntos para el análisis de FSC-H en el eje y y FSC-W en el eje x (Figura complementaria 1C). </li>
		<li>Para los análisis de fluorescencia, elija Diagramas de puntos FL1 utilizando FCS-A. Utilice un tubo de poliestireno con tapón de 12 mm x 75 mm que contenga muestras sin etiquetar y muestras previamente etiquetadas con Alexa Fluor 488 de un solo color (Figura complementaria 1D, E).</li>
	</ol></li>
	<li>Adquirir la muestra en citometría de flujo.<ol><li>Utilice un tubo de poliestireno tapado de 12 mm x 75 mm que contenga las muestras previamente etiquetadas. Mezcle el contenido del tubo con cuidado, conecte el tubo a la sonda del citómetro de flujo y haga clic con el botón izquierdo en Adquirir.</li>
		<li>Para configurar la potencia de los láseres, haga clic en Parámetros y, en las opciones a continuación, ajuste el voltaje del FSC a 182 V y el voltaje del SSC a 236 V. Para establecer el umbral, haga clic en Citómetro | Umbral, y en las opciones a continuación, ajuste el FSC a 500 V.</li>
		<li>Configure la puerta de análisis para caracterizar las partículas por tamaño y complejidad, así como para realizar análisis de una sola célula.</li>
		<li>Para eliminar la autofluorescencia, analice la muestra sin colorante que contiene solo las perlas de látex y ajuste los voltajes del detector: en las opciones a continuación, ajuste el voltaje del FL1 (FITC) a 332 V.</li>
		<li>Establezca la puerta de análisis de fluorescencia en formato cuadrangular a partir del punto negativo que se muestra en el gráfico de diagrama de puntos.</li>
		<li>Una vez ajustados los análisis morfométricos y fluorescentes, configure el dispositivo para 50.000 eventos: en Adquisición, haga clic en Grabar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).</li>
<li>de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li>
<li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+bead+array%3A+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li>
<li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li>
<li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li>
<li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA+Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).</li>
<li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li>
<li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).</li>
<li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li>
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<li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li>
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</ol>

Los autores declaran no tener posibles conflictos de intereses con respecto a la investigación, autoría y publicación de este artículo.

El método de precipitación del anticuerpo IgY mediante la reducción del pH seguido de la separación de lípidos mediante ácido caprílico es eficaz para aislar los anticuerpos totales sin pérdida de funcionalidad. El método aquí propuesto es más sencillo y económico que el reportado por Redwan et al.11, que también utilizaron precipitación por acidificación y ácido caprílico, pero con un protocolo más complejo y laborioso. Este método también presenta ventajas sobre las metodologías comúnmente utili...

Entre las técnicas de inmunoensayo destinadas al diagnóstico de enfermedades, el ensayo de perlas citométricas se ha convertido en un enfoque altamente sensible y fiable, ya que permite el análisis de miles de partículas en un solo ensayo1. Esta técnica, además de tener una alta productividad y permitir el uso de volúmenes más pequeños de muestras, también presenta una gran flexibilidad, ya que permite la detección de varias moléculas, como citoquinas, moléculas de adhesión, isotipos de anticuerpos y proteínas 2,3.
Para el desarrollo de estos ensayos se utilizan diferentes partículas, entre ellas las perlas de látex, que son un insumo efectivo y de bajo costo. Estos pueden presentar modificaciones en su superficie, como la presencia de grupos funcionales o proteínas que permiten el acoplamiento covalente o no covalente de ciertas moléculas 3,4,5.
Estos inmunoensayos utilizan componentes como antígenos y anticuerpos para realizar la detección de marcadores de enfermedades y, por lo general, requieren anticuerpos de mamíferos como ratones, conejos y cabras. Esto crea problemas relacionados con cuestiones éticas, ya que la inmunización de los mamíferos generalmente requiere de muchos animales para obtener un buen rendimiento, así como la frecuente realización de procedimientos que conducen al sufrimiento de los animales 6,7. Una alternativa a esto es el uso de anticuerpos IgY aislados de las yemas de huevo de pollos inmunizados, ya que en las yemas se pueden encontrar altas concentraciones de los anticuerpos específicos contra los antígenos inoculados; La producción de un pollo equivale a la producción de 4,3 conejos en el transcurso de un año 6,7.
Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar un método para evaluar los anticuerpos IgY obtenidos de yemas de huevo de gallina mediante citometría de flujo con perlas de látex. Para ello, proponemos un método de estandarización para un inmunoensayo citométrico de perlas en formato sándwich utilizando perlas de látex. Como modelo, utilizamos anticuerpos IgY dirigidos al antígeno de la proteína II rica en histidina de Plasmodium falciparum (IgY-PfHRP2). Describimos un método para extraer los anticuerpos, discutimos los pasos críticos para definir la concentración de acoplamiento de estos a las perlas de látex y presentamos una evaluación del límite de detección del antígeno. La alta precisión de la citometría de flujo, junto con el bajo costo de las perlas de látex, hacen que esta técnica sea aplicable para el análisis de herramientas de inmunoensayo, como anticuerpos y antígenos. Este método se puede utilizar para la detección de diversos objetivos.

<table><tbody><tr><td>Anti-Chicken IgY (H+L), altamente adsorbido cruzado, CF&nbsp; Anticuerpo 488A producido en el burro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IgG (H+L), F(ab&prime;)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600388</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biociencias</td><td>BF-FACSC2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva CS& Cuentas de investigación T (CS& T perlas de investigación)</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software 7.0</td><td>BD Biosciences</td><td>655677</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Ensayo de proteínas Colorante Reactivo Concentrado</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido caprílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3907</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z606936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro 37% ácido de grado molecular</td><td>NEON</td><td>02618 NEON</td><td></td></tr><tr><td>CML látex, 4% c/v</td><td>Invitrogen</td><td>C37253</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-HM8R</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimetilaminopropilo)-N&prime;-etilcarbodiimida clorhidrato en polvo (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750-1G</td><td></td></tr><tr><td>N-Hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1003335620</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Acs Cientifica</td><td>P.10.0594.024.00.27</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td>Acs Cientifica</td><td>R09211000</td><td></td></tr><tr><td>Termomezclador Calor/Frío</td><td>KASVI</td><td>K80-120R</td><td></td></tr></tbody></table>

estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Los inmunoensayos son pruebas importantes para la detección de numerosas dianas moleculares. Entre los métodos disponibles en la actualidad, el ensayo citométrico de perlas ha ganado protagonismo en las últimas décadas. Cada microesfera que es leída por el equipo representa un evento de análisis de la capacidad de interacción entre las moléculas bajo prueba. Miles de estos eventos se leen en un solo ensayo, lo que garantiza una alta precisión y reproducibilidad del ensayo. Esta metodología también se puede utilizar en la validación de nuevos insumos, como los anticuerpos IgY, para el diagnóstico de enfermedades. Estos anticuerpos se obtienen a través de la inmunización de pollos con el antígeno de interés y luego la extracción de la inmunoglobulina de la yema de los huevos de los animales; Por lo tanto, este es un método indoloro y altamente productivo para obtener los anticuerpos. Además de una metodología para la validación de alta precisión de la capacidad de reconocimiento de anticuerpos de este ensayo, este artículo también presenta un método para extraer estos anticuerpos, determinar las mejores condiciones de acoplamiento para los anticuerpos y las perlas de látex, y determinar la sensibilidad de la prueba.

La Figura 2 proporciona una representación gráfica del proceso de extracción de anticuerpos IgY mediante acidificación, seguido de la separación mediante ácido caprílico (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Figura 2: Representación esquemática de la etapa de extracción de anticuerpos IgY...

Este protocolo describe una metodología para la preparación de perlas de látex para ensayos con anticuerpos IgY para la detección de antígenos.

Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Entre las técnicas de inmunoensayo destinadas al diagnóstico de enfermedades, el ensayo de perlas citométricas se ha convertido en un enfoque altamente sensible y fiable, que analiza miles de partículas en un solo ensayo. La alta precisión de la citometría de flujo, junto con el bajo costo de las perlas de látex, hacen que nuestra técnica sea aplicable para el análisis de herramientas de inmunoensayos, como anticuerpos y antígenos. Los anticuerpos IgY tienen un bajo costo, y las ventajas éticas en su producción, y pueden ser utilizados como una herramienta de detección de enfermedades raras.Comience sumergiendo los huevos recién puestos o de cuatro días de edad, del linaje blanco Gallus gallus deckle, en una solución diluida al 0,2% de hipoclorito de sodio. Enjuáguelos rápidamente con agua corriente y límpielos suavemente. Rompe el huevo con cuidado, separa la yema de la clara con ayuda de un separador de yemas.Y retira el exceso de blanco con papel de filtro. Perfora la yema y recoge su interior en un tubo cónico de 50 mililitros. Guarde la yema a menos 20 grados centígrados durante al menos 24 horas antes de usarla.Después de descongelar la yema almacenada, dilúyala en una proporción de uno a 10 en un milimolar PBS. Ajuste el pH de la solución a cinco, con un ácido clorhídrico normal, e incube la solución a cuatro grados centígrados durante seis a 24 horas. Centrifugar la solución a 3000 G durante 40 minutos y filtrar el sobrenadante recuperado con un filtro de celulosa de 0,7 milímetros, antes de reajustar el pH del sobrenadante a cinco.Añadir ácido caprílico hasta una concentración final del 8,7% bajo agitación constante, durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar las muestras durante 15 minutos, separe el sobrenadante del material precipitado. Vuelva a ajustar el pH de la solución a 7,4 utilizando un hidróxido de sodio molar.Y cuantificar los anticuerpos mediante el ensayo de Bradford, antes de almacenarlos a menos 20 grados centígrados. Agregue 21 microlitros de EDC y 21 microlitros de NHS a 21 microlitros de perlas de látex. Y ajustar a un volumen final de 2,1 mililitros, con PBS filtrado de 10 milimolares.Incubar la solución a 22 grados centígrados, con agitación rápida, durante tres horas. Añadir el anticuerpo de captura previamente extraído, IgY PfHRP2, a diferentes microtubos que contengan 100 microlitros de esta solución. E incubar de nuevo durante 16 horas.Después de centrifugar las muestras y desechar los sobrenadantes, lavar las perlas de látex dos veces con 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, utilizando ciclos de centrifugación y resuspensión. Para el bloqueo de las perlas, resuspender las muestras en un mililitro de tampón de bloqueo, y seguir el mismo procedimiento mostrado anteriormente para incubarlo durante dos horas. Después de lavar las perlas con PBS, vuelva a suspenderlas en tampón PBS de 10 milimolares.Agregue 100 microlitros de anticuerpo fluorescente anti-pollo, diluido a uno a 2000 en una mezcla de 10 milimolares de PBS y BSA, a cada microtubo. Incubar las muestras en la oscuridad durante 30 minutos. Después de lavar las perlas, vuelva a suspenderlas con 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.Determine el límite de detección distribuyendo 100 microlitros de la preparación de perlas bloqueadas en tubos que contengan diferentes cantidades de la proteína recombinante diluida PfHRP2 por triplicado. Incubar las soluciones de perlas con la proteína a 22 grados centígrados, con agitación rápida, durante una hora. Lavar las perlas con 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, con centrifugación, como se demostró anteriormente.Después de descartar el sobrenadante, agregue dos microgramos de anticuerpo IgG de ratón contra la proteína recombinante, diluido en 10 milimolares PBS y BSA a cada muestra, y siga el mismo procedimiento para la incubación. A continuación, agregue 100 microlitros del anticuerpo fluorescente diluido contra el ratón a cada muestra. Después de la incubación, vuelva a suspender la muestra en 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.Encienda la computadora y el citómetro de flujo, y espere unos minutos para que el equipo se conecte a la computadora. Haga clic en el software de citometría instalado en la computadora e inicie sesión en él. En el espacio de trabajo del software, seleccione Citómetro, seguido de Inicio de fluidos, Modos de limpieza y Lavado SIT.Defina la estrategia de compuerta en función de las características morfométricas y de fluorescencia de la partícula de control negativo. Para determinar la morfometría de la celda, elija el gráfico de diagrama de puntos para el análisis de los parámetros de dispersión directa A utilizando la dispersión lateral A.Determine las celdas individuales por dispersión lateral utilizando el gráfico de diagrama de puntos para el análisis de la dispersión lateral W en el eje Y y la dispersión lateral H en el eje X. Y determine las celdas individuales por dispersión hacia adelante, utilizando un gráfico de diagrama de puntos, para el análisis de la dispersión hacia adelante W en el eje Y y la dispersión hacia adelante H en el eje X.Para el análisis de fluorescencia, elija gráficos de diagramas de puntos FL1 utilizando dispersión directa A. Utilice un tubo de poliestireno con tapón que contenga muestras sin etiquetar y muestras previamente etiquetadas con Alexa Fluor 488 de un solo color Y mezcle cuidadosamente el contenido del tubo. Conecte el tubo a la sonda del citómetro de flujo y haga clic con el botón izquierdo en Adquirir. Para configurar la potencia de los láseres, haga clic en Parámetros y, en las opciones a continuación, ajuste el voltaje de la dispersión directa a 182 voltios y el voltaje de la dispersión lateral a 236 voltios.Para establecer el umbral en el citómetro, haga clic en Umbral y, en las opciones a continuación, ajuste el FSC a 500 voltios. Configure la puerta de análisis para caracterizar las partículas por tamaño y complejidad, así como para realizar análisis de una sola célula. Elimine la autofluorescencia analizando la muestra sin colorante que contiene solo las perlas de látex y ajustando el voltaje del detector FL1 FITC a 332 voltios.Establezca la puerta de análisis de fluorescencia en formato cuadrangular, a partir del punto negativo que se muestra en el gráfico de diagrama de puntos. Una vez ajustados los análisis morfométricos y fluorescentes, configure el dispositivo para 50.000 eventos y haga clic en Grabar. Aquí se muestran los perfiles electroforéticos del anticuerpo IgY PfHRP2, debido a la separación mediante ácido caprílico.A partir de esta figura, se puede observar que los anticuerpos antes y después de la separación del ácido caprílico mostraron perfiles electroforéticos similares, con bandas características de 65 kilodaltons y 27 kilodaltons, que se refieren a las cadenas ligeras y pesadas de la IgY. Además de estos, también son visibles otras bandas, probablemente debido al precursor de la proteína vitelogenina II del fragmento terminal C de la yema de huevo. La evaluación de la concentración de saturación de anticuerpos en las perlas de látex es vital para desarrollar un inmunoensayo con las perlas.Aquí se muestra una curva del porcentaje de fluorescencia de diferentes concentraciones de anticuerpos, acoplada a cada microlitro de perlas de látex comerciales utilizadas. A medida que aumentaba la concentración, los valores porcentuales también aumentaban y se estabilizaban en dos microgramos de concentración de anticuerpos, estableciéndose como la concentración de acoplamiento óptima para el inmunoensayo de antígeno diana. El límite de detección se determinó evaluando el porcentaje de fluorescencia de la reactividad a la velocidad del látex frente a las diferentes concentraciones de la proteína rPfHRP2.A partir de un inmunoensayo sándwich, se observó que la fluorescencia aumentó de 0,01 microgramos de proteína PfHRP2 y se estabilizó en 0,1 microgramos. No hubo diferencias significativas en la fluorescencia a cero microgramos y 0,01 microgramos. Sin embargo, se observó una diferencia significativa en la fluorescencia a 0,01 microgramos, 0,1 microgramos y 10 microgramos.El paso de lavado de este protocolo es fundamental para evitar la pérdida de perlas. El calibre debe estar bien definido para que no haya errores en el resultado obtenido. Los pasos aquí descritos representan una estandarización importante, que es necesaria para garantizar la fiabilidad de las pruebas diagnósticas utilizando perlas de látex que se evalúan mediante citometría completa.Por lo tanto, esta metodología es una alternativa a los modelos clásicos de prueba sándwich. Este método se puede aplicar a diversos tipos de ensayos, y puede ser adecuado para hacer frente a varias moléculas a la superficie de las perlas, así como para la detección de diferentes analitos.

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Investigación

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Bioquímica

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Este video ilustra la reconstitución de células presentadoras de antígenos sintéticos a través de bicapas lipídicas soportadas por perlas y su aplicación en la evaluación de la salida sináptica generada por las células T activadas.

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Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

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El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).

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Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

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Aprende a preparar perlas de látex para ensayos inmunológicos utilizando anticuerpos IgY de yema de huevo. Este protocolo estandarizado mejora la sensibilidad en la detección de antígenos mediante citometría de flujo.

Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

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