Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

Las técnicas aquí presentadas son útiles para investigar la comunidad de hongos endófitos asociados a diferentes órganos de la planta. El aislamiento de hongos endófitos permite su identificación, y es valioso en otras técnicas como la germinación simbiótica. Para comenzar, prepare placas de Petri de ocho a 10 centímetros de medio de cultivo PDA suplementadas con tres mililitros por litro de antibiótico.

Compruebe si hay contaminación incubando las placas de Petri del medio de cultivo a 36 grados centígrados durante 24 horas antes de su uso. Al día siguiente, infeste superficialmente los fragmentos de plantas micoheterótrofas sanas utilizando un procedimiento estándar y colóquelos en una placa de Petri estéril. Para evaluar la eficacia de la desinfestación superficial de las muestras, se deben inocular unas gotas de agua destilada utilizada durante el último lavado de las muestras en PDA.

A continuación, con un bisturí flameado y unas pinzas, corta las muestras en trozos de 0,2 centímetros de grosor. Seccionar las muestras para amplificar el área de superficie para estar en contacto con el medio. Coloque cinco fragmentos de los órganos subterráneos en la placa de PDA suplementada con antibióticos lo más lejos posible sin tocar los bordes del plato.

Selle las placas de Petri con film transparente y guárdelas en la oscuridad a 25 a 27 grados centígrados durante cinco días. Un día antes del subcultivo, prepare placas de Petri de cinco centímetros con cinco a siete gramos por litro de medio AA e incube las placas a 36 grados centígrados durante 24 horas. Para purificar los aislados de hongos, diferencie las colonias de placas PDA por color, patrón de crecimiento, textura y formato de margen.

Luego delimite los márgenes de la colonia en la parte inferior del plato. También identifique las colonias con un código. Usando la punta de un palillo de madera esterilizado en autoclave, recupere una pequeña cantidad de micelio de los márgenes de la colonia de hongos identificada y estrie la placa AA, produciendo tres estrías a un centímetro de distancia entre sí y de los bordes del plato.

Etiquete la placa AA con el código apropiado usando papel adhesivo y lápiz. Selle las placas antes de incubarlas en la oscuridad a 25 a 27 grados centígrados durante tres días. Después de la incubación, observe meticulosamente las placas para identificar hifas finas que forman colonias individuales.

Delimite el área de las colonias individuales utilizando un marcador permanente. Corte una porción del medio que contiene la colonia con un palillo de dientes esterilizado en autoclave y transfiera el volumen cortado al centro de una nueva placa de Petri PDA sin antibióticos. Después de etiquetar las placas de Petri con los códigos de los aislados, séllelas con film transparente y manténgalas en la oscuridad a 25 a 27 grados centígrados durante siete a 14 días.

Para comenzar la conservación de los aislados fúngicos con el método de Castellani, agregue 0,5 mililitros de agua destilada al tubo de microcentrífuga de dos mililitros esterilizado en autoclave. Con un palillo esterilizado en autoclave, corte un medio cuboide de 0,5 por 0,5 centímetros de los márgenes de micelio de aislados purificados ya cultivados. Coloque de cuatro a seis cuboides en los tubos de microcentrífuga con agua destilada.

Guarde los tubos en la oscuridad a 25 grados centígrados durante el tiempo que sea necesario. Cuando sea necesario, recupere un cuboide y colóquelo en el centro de una nueva antena PDA para cultivar un aislado almacenado. Comience el método de montaje de cardán colocando una gota de un tinte azul de toluidina en un portaobjetos de vidrio limpio.

Se pueden utilizar diferentes tinciones en dicha técnica. Con un palillo de dientes esterilizado en autoclave, retire con cuidado algunas hifas del aislado cultivado y colóquelas en la gota de mancha. Coloque una cubreobjetos y analícela bajo un microscopio óptico.

Para el método de montaje con cinta adhesiva, coloque una gota de un tinte azul de algodón de lactofenol en un portaobjetos de vidrio limpio. Corta una tira de cinta adhesiva transparente del tamaño que se ajuste bien al portaobjetos de vidrio y a la caída del tinte central. Dirija la superficie pegajosa de la tira adhesiva hacia la superficie del micelio e intente recolectar algunas hifas sin presionar ni recolectar demasiadas.

A continuación, pega la cinta al portaobjetos de vidrio, asegurándote de que la mancha esté en contacto con las hifas recogidas. Coloque una gota de agua sobre la cinta y coloque un cubreobjetos antes de analizar el portaobjetos bajo un microscopio óptico. El crecimiento de pequeños grupos de micelios de hongos filamentosos que emergen del interior de los fragmentos se observó después de cinco días de inoculación del fragmento de órgano de planta micoheterótrofo en el medio PDA.

Durante siete a 14 días de inoculación del aislado purificado, se observó el crecimiento centrífugo de la colonia de aislado fúngico puro en PDA, formando un único micelio circular. Las posibles contaminaciones fueron fácilmente identificadas, comprometiendo la homogeneidad de la colonia en cuanto a su aspecto de forma de crecimiento, color y producción de pigmentos en el medio. Una colonia aislada de las raíces fusiformes de la orquídea micoheterótrofa, Wullschlaegelia aphylla, fue opaca sin pigmentos ni exudados difusibles en el medio.

La colonia era de color blanquecino a gris en la parte superior y pardusca en la parte inferior. Los micelios eran aéreos y abundantes, y los márgenes eran irregulares y aéreos. La colonia tenía una textura aterciopelada y una topografía arrugada sin estructuras macroscópicas.

Las estructuras que no eran fácilmente visibles en el micelio no teñido se exhibieron después de teñir el micelio fúngico con azul de algodón de lactofenol y azul de toluidina-O, facilitando su identificación. Los métodos de aislamiento fúngico presentados aquí también se pueden aplicar a plantas verdes para identificar los endófitos fúngicos. Los hongos aislados se pueden utilizar en ensayos de germinación simbiótica.