Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

El enriquecimiento de las VE micobacterianas ayuda a delinear su contenido, descifrar sus facciones y fechas, diseñando formas de construir y generar VE recombinantes que exploten principalmente las vacunas candidatas. Seis series se generan a partir de diferentes ubicaciones de la superficie bacteriana. No tienen marcadores conservados.

Por lo tanto, cualquier enfoque basado en la afinidad puede enriquecer solo un subconjunto de los EV. Por el contrario, nuestro método captura todas las VE de micobacterias generadas. El encargado de demostrar el procedimiento será Mohd Ilyas, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.

Para comenzar, agregue un mililitro de caldo de glicerol de Mycobacterium smegmatis de tipo salvaje o recombinante a un tubo de centrífuga de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de caldo 7H9 precalentado. Cierre la tapa y agite el tubo antes de incubar el cultivo durante la noche a 37 grados Celsius entre 200 y 220 RPM. Al día siguiente, cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance aproximadamente uno, centrifugar el cultivo a 3.200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante en un recipiente de desecho líquido.

Agregue un mililitro de medios Sautons precalentados y vuelva a suspender suavemente para obtener una suspensión uniforme. Aumente el volumen a 10 mililitros con medios Sautons. Vuelva a centrifugar y deseche el sobrenadante.

Después del lavado, vuelva a suspender las células bacterianas. en 20 mililitros de medios Sautons precalentados y mida la densidad óptica a 600 nanómetros. Inocular el volumen requerido de suspensión bacteriana en un matraz Erlenmeyer de uno a dos litros que contenga 330 mililitros de medios Sautons e incubar a 37 grados Celsius a 200 RPM hasta que la densidad óptica alcance 0,3.

Al día siguiente, lavar las células una vez como se demostró anteriormente y resuspender el pellet en 330 mililitros de Sautons conteniendo 1/10 Tween 80. Distribuya 50 mililitros de la suspensión celular en seis matraces de un litro, cada uno de los cuales contiene 280 mililitros de Sautons precalentados que contienen 1/10 Tween 80. Incubar los cultivos a 37 grados centígrados a 200 RPM hasta que la densidad óptica alcance de dos a 2,5.

Agregue dos litros de cultivos de etapa exponencial media a seis botellas de 400 mililitros y centrifugue a 8.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante y los matraces o vasos de precipitados preenfriados en autoclave y almacene una alícuota del gránulo para procedimientos analíticos. El gránulo es coloreado si los EV son recombinantes para mCherry y marrón si son de tipo salvaje o recombinante para proteínas no fluorescentes.

Filtre el sobrenadante de cultivo a través de un filtro de eliminación de 0,45 micras, seguido de una filtración a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar todos los rastros de bacterias. A continuación, prelavar los concentradores de membrana de 30 kilodalton con 15 mililitros de agua bidestilada a 4.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar con 15 mililitros de medios Sautons fríos prefiltrados utilizando las mismas condiciones para eliminar todos los restos de productos químicos.

Después del lavado, añadir 15 mililitros de sobrenadante cultivado filtrado en un concentrador y concentrar a 4.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el concentrado a un tubo de centrífuga Oak Ridge frío de 40 mililitros o a un tubo de centrífuga Falcon fresco de 50 mililitros. Una vez que se concentran los dos litros completos de filtrado de cultivo, transfiera el concentrado a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros doblemente destilado, lavado y preenfriado y sométalo a una centrifugación de dos pasos.

Primero a 4.000 G, y luego a 15.000 G. Transfiera el concentrado centrifugado a un tubo de ultracentrífuga preenfriado de 38,5 mililitros y centrifugue a 100.000 G durante cuatro horas a cuatro grados Celsius. Recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga Falcon fresco de 50 mililitros preenfriado. invierta el tubo de ultracentrífuga sobre un papel absorbente nuevo y sin pelusa para eliminar los restos del sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 600 microlitros de tampón HEPES.

Coloque el gránulo resuspendido en el fondo de un tubo de ultracentrífuga de polipropileno UltraClear preenfriado de 13 mililitros y mézclelo suavemente con cuatro mililitros de solución inerte de yodixanol con gradiente de densidad del 60 %. A continuación, superponga con un mililitro cada uno de 40%, 30%, 20% y 10% de yodixanol. Llene el tubo agregando cuatro mililitros de yodixanol al 6% en la parte superior.

Después de pesar cuidadosamente el tubo en un vaso de precipitados de vidrio o en un soporte, transfiéralo suavemente a los cubos oscilantes y luego al rotor de los cubos oscilantes para la ultracentrifugación a 141.000 G durante 16 horas a cuatro grados centígrados. Después de la ultracentrifugación, retire con cuidado el tubo y recoja una fracción de un mililitro en tubos de microcentrífuga esterilizados en autoclave. El análisis TEM mostró que los VE micobacterianos son circulares y el análisis de seguimiento nanométrico confirmó que los VE de diferentes tamaños con diámetros que oscilan entre 20 y 250 nanómetros.

Cuando el extremo N-terminal de mCherry se fusionó traduccionalmente con el extremo C-terminal de CFP-29, una porción de mEV enriquecidos de Msm se volvió rosada, lo que indica la capacidad de cf-29 para transportar una proteína extraña de interés. A continuación, se utilizó CFP-29 para evaluar la entrega de EsxA en los vehículos eléctricos de Msm. El EsxA de Mtb se observó en los vehículos eléctricos de Msm en bajas cantidades.

CFP-29 EsxA 3X FLAG fue más estable y se acumuló en niveles más altos en mEV. El enriquecimiento de los VE a partir de micobacterias cultivadas en condiciones fisiológicas diferentes proporciona información sobre sus contenidos alterados y funciones modificadas que dictan la infectividad sostenida, la patogénesis y la propagación del patógeno.