Fabricación de micropartículas poliméricas pulsátiles que encapsulan el antígeno de la rabia

La importancia de este enfoque es que podría usarse para administrar vacunas de dosis múltiples en una sola inyección, lo que podría salvar millones de vidas, particularmente en países de ingresos bajos y medianos donde los recién nacidos no están inmunizados debido a problemas de acceso. Este método de fabricación permite que la vacuna contra la rabia conserve su forma nativa de inmunidad cuando se encapsula en micropartículas cuya liberación imita los calendarios de vacunación actuales con una sola inyección. La rabia es una enfermedad mortal, que requiere hasta cinco inyecciones repetidas de vacunas en algunos casos para prevenir la muerte.

Sin embargo, administrar el régimen completo de la vacuna en una sola visita puede mejorar la adherencia y salvar vidas. Esta técnica representa una tecnología de plataforma capaz de ofrecer diversas terapias o profilácticos para diversas enfermedades. Para comenzar, trate la superficie del molde maestro impreso en 3D colocándolo en una cámara de vacío que contenga un portaobjetos de vidrio con 40 microlitros de triclorosilano en la superficie.

Inicie el vacío durante una hora. Mezcle la base del prepolímero PDMS y el agente de curado en una proporción de masa de 9:1 en un recipiente de plástico. Luego, transfiera la solución a un tubo de 50 mililitros y centrifugar 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, asegúrese de que la solución sea clara. Una vez que se complete el tratamiento de la superficie, coloque el molde maestro en un plato de papel de aluminio y vierta el PDMS sin curar en el molde, asegurándose de que las características estén completamente sumergidas. Coloque el plato de papel de aluminio en una cámara de vacío y tire de la aspiradora durante una hora para eliminar cualquier burbuja de aire.

Después de retirar el plato de papel de aluminio, coloque espaciadores de 800 micrómetros en cada extremo del molde maestro y superponga un portaobjetos de vidrio limpio sobre el molde maestro, evitando burbujas. Use clips aglutinantes para sujetar el molde sobre los espaciadores de 800 micras. Curar el prepolímero en el horno a 120 grados centígrados durante cuatro horas.

Una vez que esté curado, suelte con cuidado los clips aglutinantes. Use una cuchilla de afeitar para separar el molde maestro del molde PDMS curado. Para preparar la película de PLGA, coloque 450 miligramos de PLGA en una lámina de polímero antiadherente dentro de una cuña de anillo.

Luego, superponga una segunda lámina de polímero antiadherente en el PLGA y use una abrazadera C de 101.6 milímetros para comprimir la pila entre dos bloques de aluminio hasta que quede apretada con los dedos. Coloque el conjunto con sujeción en C en un horno de vacío. Después de 30 minutos en el horno, apriete la abrazadera y vuelva a colocarla durante otros 30 minutos.

Luego, transfiera el ensamblaje a un desecador durante cuatro horas para que se enfríe. Una vez enfriada, afloje la abrazadera, retire la película de PLGA de las láminas de polímero antiadherente y colóquela en una placa de Petri etiquetada. Guarde la placa de Petri dentro de un desecador para su uso posterior.

Para generar partículas de PLGA, trate la superficie del molde PDMS como se demostró anteriormente. Usando pinzas o un bisturí, corte la película PLGA de 250 micras para que sea aproximadamente del tamaño de la matriz de partículas y colóquela en el molde PDMS tratado. Superponga un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio en la película PLGA sobre el molde PDMS y asegúrelos colocando una abrazadera de resorte sobre la matriz y la película PLGA.

Mantenga el conjunto del molde sujetado en el horno de vacío durante una hora, luego enfríelo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Una vez enfriado, aplique suavemente la presión con una cuchilla de afeitar para separar el molde PDMS de la matriz de partículas PLGA y almacene las partículas de PLGA en un desecador para su uso posterior. Para llenar las partículas con antígeno concentrado de la vacuna antirrábica, prepare el dispensador piezoeléctrico y coloque el portaobjetos que contiene las partículas de PLGA en el área de dispensación.

Cargue el antígeno concentrado en la placa, luego ingrese los parámetros de configuración del objetivo y haga clic en Ejecutar. El robot piezoeléctrico llenará las partículas. Una vez completado, use un estereoscopio para verificar que las partículas se hayan llenado.

Para sellar la partícula llena, coloque un bloque de acero inoxidable en una placa caliente y dos portaobjetos de microscopio paralelos en el bloque de acero inoxidable. Después de nivelar el bloque de acero inoxidable, encienda la placa caliente y ajuste la temperatura a 205 grados centígrados. Una vez que se alcance la temperatura de superficie deseada del acero inoxidable, suspenda las partículas de PLGA llenas en los dos portaobjetos de vidrio e inicie inmediatamente un temporizador durante 18 segundos.

Después de retirar la matriz de partículas sellada de la placa caliente, suspenda en dos portaobjetos de vidrio en el banco de laboratorio y enfríela durante un minuto. Para cosechar partículas selladas, sostenga la hoja de bisturí en un ángulo de 45 grados con respecto al portaobjetos y aplique presión a la base de las partículas para separarlas del portaobjetos. Usando un bisturí, mueva las partículas recolectadas en un tubo de unión a proteínas bajas en 0,5 mililitros.

Agregue 250 microlitros de PBS que contengan albúmina sérica bovina y glucosa para mantener la estabilidad de la vacuna contra la rabia Coloque la muestra bajo el estereoscopio y aplaste las partículas usando una clavija en un par de pinzas de punta fina. Durante el llenado de partículas, se requiere suficiente tiempo de secado para la evaporación completa del disolvente o del agua. Después del secado, un depósito de soluto permanece en la parte inferior del núcleo de partículas.

La morfología ideal de las partículas se observó entre los tiempos de techo de 18 y 24 segundos para este PLGA, ya que las partículas que contenían carga estaban completamente selladas en esos momentos sin perder estructura de partículas. Las partículas eran lo suficientemente pequeñas como para caber fácilmente en una aguja de calibre 19 cuando se empaquetaban y sellaban adecuadamente. Además, 10 partículas fluyeron consistentemente a través de una aguja de calibre 19 al inyectarlas en una solución viscosa, como carboximetilcelulosa al 2%.

La micrografía electrónica de transmisión indicó variantes de rabia intactas en la muestra concentrada de antígeno, y estas fueron aproximadamente 4,4 veces más concentradas que la solución de material de partida. Después del sellado, aproximadamente el 69% del antígeno permanece encapsulado en su forma bioactiva, lo que sugiere que el estrés por calor causa una pérdida significativa durante el sellado, pero la mayor parte del antígeno viral permanece intacto. El llenado de micropartículas es uno de los pasos más críticos.

Si las partículas no se llenan correctamente, es poco probable que las partículas se sellen correctamente. Para comprender la estabilidad, sería necesario el desarrollo adicional de formulaciones, incluidos excipientes y otros materiales biológicamente relevantes en el núcleo de partículas.