Name: Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a preparar y evaluar una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina mediante emulsificación de baja energía. Este método mejora la respuesta inmune y la protección in vivo.

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Esta investigación fue apoyada por el No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China, el No. 32070924 y 32000651 del NSFC, y el No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing.

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses en este trabajo.

IsdB, una proteína de superficie bacteriana anclada a la pared celular y regulada por hierro, juega un papel importante en el proceso de obtención de hierro hemo15. Hla, toxina alfa, es una de las toxinas bacterianas más efectivas conocidas en MRSA, y puede formar poros en células eucariotas e interferir con la adhesión y las células epiteliales16. En nuestro estudio, se construyó una nueva proteína de antígeno MRSA (HI) de recombinación y se expresó con t...

El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es un patógeno oportunista con una de las tasas de infección más altas en una unidad de cuidados intensivos (UCI) salas1, departamentos de cardiología y departamentos de quemaduras en todo el mundo. El SARM exhibe altas tasas de infección, mortalidad y amplia resistencia a los medicamentos, presentando grandes dificultades en el tratamiento clínico2. En la Lista de prioridad mundial de bacterias resistentes a los antibióticos publicada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2017, MRSA se incluyó en la categoría3 más crítica. Por lo tanto, se necesita urgentemente una vacuna contra la infección por SARM.
El adyuvante de aluminio se ha utilizado durante mucho tiempo, y el mecanismo auxiliar adyuvante es relativamente claro, seguro, efectivo y bien tolerado4. Los adyuvantes de aluminio son actualmente un tipo de adyuvante ampliamente utilizado. En general, se cree que los antígenos adsorbidos en partículas de sal de aluminio pueden mejorar la estabilidad y mejorar la capacidad del sitio de inyección para absorber antígenos, proporcionando una buena absorción y liberación lenta5. Actualmente, la principal desventaja de los adyuvantes de aluminio es que carecen de un efecto adyuvante o exhiben solo un efecto adyuvante débil en algunos antígenos candidatos a vacuna6. Además, los adyuvantes de aluminio inducen reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE5. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos adyuvantes para estimular una respuesta inmune más fuerte.
Los adyuvantes de nanoemulsión son sistemas de dispersión coloidal compuestos de aceite, agua, tensioactivos y cosurfactantes7. Además, los adyuvantes son termodinámicamente estables e isótropos, pueden ser esterilizados en autoclave o estabilizados por centrifugación de alta velocidad, y pueden formarse espontáneamente en condiciones de preparación suaves. Varios adyuvantes de emulsión (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) están actualmente en el mercado o en la etapa de investigación clínica, pero sus tamaños de partícula son superiores a 160 nm8. Por lo tanto, las ventajas de las preparaciones medicinales a nanoescala (1-100 nm) (es decir, área de superficie específica grande, tamaño de partícula pequeño, efecto de superficie, energía superficial alta, efecto de tamaño pequeño y efecto túnel macrocuántico) no pueden explotarse plenamente. En el presente protocolo, se ha informado que un nuevo adyuvante basado en tecnología de nanoemulsión con un tamaño de diámetro de 1-100 nm exhibe una buena actividad adyuvante9. Probamos la proteína HI del antígeno de la vacuna de la subunidad de recombinación (mutante de α-hemolisina [Hla] y la proteína de fusión de fragmentos activos de la subunidad N2 del factor de determinación de la superficie de iones Fe [IsdB]); Se establecieron una serie de procedimientos para examinar las propiedades físicas y la estabilidad, evaluar su respuesta específica de anticuerpos después de la administración intramuscular y probar el efecto protector de la vacuna utilizando un modelo de infección sistémica de ratón.

<table><tbody><tr><td>5424-Centrífuga pequeña de alta velocidadFA-45-24-11</td><td>Eppendorf, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>5424000495</tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Corning Incorporated, EE. UU.</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AFM Dimension FastScan</td><td>BRUKER, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>null</tr><tr><td>Lámpara de alcohol</td><td>Shenzhen Yibaxun Technology Co., China</td><td>YBS-AA-11408</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c ratones&nbsp;</td><td>Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China</td><td>BCIP/NBT</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0 Lector de microplacas</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, EE. UU</td><td></td>. NULL <td></td></tr><tr><td>BL21 Célula competente</td><td>Merck millipore, Alemania</td><td>70232-3CN</td><td></td></tr><tr><td>BSA-100G</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>B2064-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>Eppendorf, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>Coomassie azul brillante G-250 solución de tinción</td><td>MIKX, China</td><td>DB236</td><td></td></tr><tr><td>Solución de decoloración</td><td>BOSTER, China</td><td>AR0163-2</td><td></td></tr><tr><td>Cultivador de temperatura estacionaria de electrocalentamiento HH-B11-420</td><td>Shanghai Yuejin Fábrica de dispositivos médicos, China</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis</td><td>Fábrica de instrumentos Beijing Liuyi, China</td><td>DYCZ-25D Imagen</td><td></td></tr> de <tr><td>gel</td><td>Tanon, EE. UU</td>. Resina <td>nula</td><td></td></tr><tr><td>de glutatión-sepharose GST</td><td>Mei5bio, China</td> resina <td></td>de <td>cromatografía de afinidad</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante HI</td><td>Tercera Universidad Médica Militar,China</td><td>110-27-0</td><td></td></tr><tr><td>HRP -Cabra anti-ratón IgG</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03001</td><td></td></tr><tr><td>HRP- Cabra anti-ratón IgG1</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03002R</td><td></td></tr><tr><td>HRP- Cabra anti-ratón IgG2a</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03003R</td><td></td></tr><tr><td>HRP- Cabra anti-ratón IgG2b</td><td>Biodragon, China</td><td>BF03004R</td><td></td></tr><tr><td>Bucle de inoculación</td><td>Haimen Feiyue Co., LTD, China</td><td>YR-JZH-1UL</td><td></td></tr><tr><td>Clones de IsdB y Hla</td><td>Shanghai Jereh Biotechnology Co,China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nulo Nuez moscada de isopropilo (adyuvante farmacéutico)</td><td>SEPPIC, Francia</td><td>nulo</td><td></td></tr><tr><td>isopropil- &beta;-D-1-mercaptogalactopiranósido</td><td>fdbio,China</td><td>FD3278-1</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo medio de cultivo</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td><td>02-136</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de fisioterapia Lnfrared</td><td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co., China</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de baja temperatura</td><td>Eppendorf, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>null</tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., Reino Unido</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>MH (A) medio</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, China</td><td>02-051</td><td></td></tr><tr><td>MH (B) medio</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, China</td><td>02-052</td><td></td></tr><tr><td>Micro lavadora de placas 405 LSRS</td><td>Bio Tek Instruments, Inc Highland&nbsp; Parque, EE</td><td></td><td></td>. UU.</tr><tr><td>null Mini-TBC Instrumento de transferencia de película compacta</td><td>BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, China</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Embalaje MMC</td><td>TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> 0022818 <tr><td>MRSA252</td><td>EE. UU., ATCC</td><td>nulo</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro ultravioleta Nanodrop</td><td>Thermo Scientific, EE</td><td></td><td></td>. UU</tr>. <tr><td>null Nueva proteína FlashTM cualquier KD PÁGINA Kit de gel de electroforesis de proteínas</td><td>DAKEWE, China</td><td>8012011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>biosharp, PCR</td><td>nulo</td><td></td>de China</tr><tr><td>,</td><td>termociclador amplificador,</td> plásmido recombinante de gen objetivo pGEX <td>nulo</td><td></td>de EE. UU.</tr><tr><td></td><td>Shanghai Jereh Biotechnology Co, China</td><td>B3528G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>G-CLONE, China</td><td>Pipeta CS1231-25g</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>3120000844</tr><tr><td>aceite de ricino polioxietilado (adyuvante farmacéutico)</td><td>Aladdin, China</td><td>K400327-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio de anticuerpos primarios</td><td>Hecho en casa:De ratones inmunizados con sueros positivos</td><td>nulos</td><td>Consulte la Referencia 11 para obtener más detalles</td></tr><tr>.<td>Propilenglicol (adyuvante farmacéutico)</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>P4347-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteínas</td><td>Thermo Scientufuc, EE. UU.</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>MEMBRANA DE TRANSFERENCIA DE PVDF</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL, Japón</td><td>JSM-IT800</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Merck, Alemania</td><td>Tc-P8411</td><td></td></tr><tr><td>Talos L120C TEM</td><td>Thermo Fisher, EE. UU</td>. <td>nula</td><td></td></tr><tr><td>solución de color TMB</td><td>TIAN GEN, China</td><td>PA107-01</td><td></td></tr><tr><td>Kits de tortuga</td><td>Xiamen Bioendo Technology Co., LTD</td><td>ES80545</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Macklin, China</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por staphylococcus aureus resistente a la meticilina (sarm)

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

Las vacunas adyuvantes de nanoemulsión han atraído una gran atención debido a su pequeño tamaño de partícula, alta estabilidad térmica y capacidad para inducir respuestas inmunes válidas. Sin embargo, establecer una serie de protocolos integrales para evaluar la respuesta inmune de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión es vital. Por lo tanto, este artículo presenta un procedimiento riguroso para determinar las características fisicoquímicas de una vacuna (por microscopía electrónica de transmisión [TEM], microscopía de fuerza atómica [AFM] y dispersión dinámica de luz [DLS]), la estabilidad del antígeno y el sistema de la vacuna (mediante una prueba de centrífuga de alta velocidad, una prueba de estabilidad termodinámica, SDS-PAGE y western blot), y la respuesta inmune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando este enfoque, los investigadores pueden evaluar con precisión el efecto protector de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en un modelo letal MRSA252 ratón. Con estos protocolos, se puede identificar el adyuvante de vacuna de nanoemulsión más prometedor en términos de potencial adyuvante efectivo. Además, los métodos pueden ayudar a optimizar nuevas vacunas para el desarrollo futuro.

Se evaluó el protocolo para la preparación de la vacuna adyuvante de nanoemulsión y las pruebas in vitro e in vivo de esta vacuna. Se utilizaron TEM, AFM y DLS para determinar las características importantes del potencial zeta y el tamaño de partícula en la superficie de esta muestra (Figura 1). SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y sobrenadante no se degradó significativamente después de la centrifugación, lo que indicó que l...

El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

El protocolo demostrado subrayó el enfoque experimental directo y efectivo y los pasos detallados para los efectos de la respuesta inmune de los nuevos adyuvantes virales. Este protocolo proporciona a la investigación no solo un método de evaluación básicamente inmune para la vacuna adyuvante, sino que también puede determinar su estabilidad masiva. Para comenzar, tome la solución de trabajo de 10 miligramos por mililitro de la proteína antígeno MRSA HI, y a ella, agregue secuencialmente los tres excipientes, miristato de isopropilo, aceite de ricino de polioxietileno y propilenglicol, manteniendo una relación de masa de uno es a seis es a tres.Revuelva bien la mezcla, luego agregue gradualmente agua pura esterilizada para alcanzar un volumen del sistema de 10 mililitros. Para preparar la vacuna de nanoemulsión por el método de emulsificación de baja energía, revuélvala a 500 rotaciones por minuto y 25 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos. Posteriormente, la vacuna de nanoemulsión que contiene un miligramo por mililitro de proteína se obtiene como un líquido transparente transparente.Para el recubrimiento de antígeno del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o placa ELISA, diluya el antígeno de la proteína HI a 10 microgramos por mililitro con solución de recubrimiento y agregue 100 microlitros del antígeno diluido por pocillo en la placa ELISA. Incubar el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo.Selle los pocillos con 300 microlitros de la solución de sellado por pocillo durante dos horas a 37 grados centígrados, luego diluya tres microlitros del suero de ratones de cada grupo experimental 100 veces agregando 297 microlitros de PBST y vortice el suero diluido. Agregue 100 microlitros de suero diluido por pocillo en la placa ELISA recubierta para cada muestra de suero. Del mismo modo, diluya los sueros de control positivo y negativo 100 veces con PBST agregando cuatro microlitros de suero de control positivo o negativo a 396 microlitros de PBST, seguido de una mezcla de vórtice.Para realizar la dilución de doble proporción, agregue 200 microlitros del suero experimental previamente diluido a la primera fila de la placa ELISA recubierta, luego agregue 100 microlitros de PBST a todos los pocillos, excepto los de las filas uno y 12. A continuación, ajuste la pistola de pipetas a 100 microlitros y transfiera 100 microlitros de suero de la primera fila a la segunda fila que contiene PBST. Mezcle el contenido de la segunda fila 10 veces con la pipeta.Del mismo modo, realizar una es a dos diluciones sucesivas del suero hasta la fila 11. Una vez hecho esto, deseche 100 microlitros de líquido de la fila 11. Agregue 100 microlitros de suero negativo y positivo diluido a cada pocillo correspondiente en la fila 12 siguiendo la plantilla de muestra.Selle la placa ELISA con una envoltura de plástico e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras tanto, diluya el anticuerpo secundario anti-ratón IgG HRP 10, 000 veces agregando PBST. Después de la incubación de una hora, lave la placa ELISA con 300 microlitros de PBST por pocillo para limpiar los anticuerpos no unidos, luego agregue 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante 40 minutos.Lave la placa con 300 microlitros de PBST por pocillo, luego agregue 100 microlitros de solución de desarrollo de color TMB a cada pocillo. Coloque las placas a 37 grados centígrados y lejos de la luz durante 10 minutos. Después de lo cual, termine la reacción inmediatamente con 50 microlitros de dos molares de ácido sulfúrico.Detecte la densidad óptica o los valores de OD a 415 nanómetros utilizando un marcador enzimático dentro de los 15 minutos posteriores a la terminación. Las características físicas de la nueva vacuna de nanoemulsión se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión y microscopía de fuerza atómica. Se utilizó la dispersión dinámica de la luz para determinar la distribución del tamaño de partícula y el potencial zeta de la muestra.SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y el sobrenadante no difirió significativamente después de la centrifugación, lo que indica que la vacuna estaba estructuralmente intacta, específica e inmunogénica. La vacuna adyuvante de nanoemulsión aumentó significativamente los títulos totales de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG2a de los ratones. La inmunogenicidad de la vacuna proteica mejoró significativamente.Los valores séricos de IgG2b OD a 450 nanómetros fueron más altos cuando se utilizó PBS a una dilución de uno es a 5, 000. El modelo letal de ratones MRSA 252 reflejó que la vacuna de nanoemulsión mostró un buen efecto protector e inhibió eficazmente la infección bacteriana con MRS A 252, mejorando la tasa de supervivencia de los ratones infectados. La preparación de la nanoemulsión y la adición de suero a la planta son los más importantes.Además, cuando se detecta el título de anticuerpos, se debe prestar atención a corregir a una salida más amplia y líquida. Además de los adyuvantes, este método también se puede utilizar para la evolución inmune de otras matrices matemáticas, como plásticos o sistemas de entrega.

evaluating-immune-response-nanoemulsion-adjuvant-vaccine-against

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica de homogeneización eficiente para generar una emulsión adyuvante de antígeno para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un modelo murino. La emulsión contiene un autoantígeno, la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), en la fase acuosa, rodeada por una fase oleosa continua que comprende una bacteria patógena inactivada. La emulsión asegura una liberación sostenida de antígenos para una respuesta inmunitaria prolongada.

Preparación de una emulsión antigénica adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune

Este video muestra un método para evaluar la respuesta inmune de anticuerpos a una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en ratones pre-inmunizados. La inmunización mejora la respuesta de los anticuerpos, como se confirma mediante la determinación de los títulos de anticuerpos IgG.

Medición de los niveles de inmunoglobulina G frente a una vacuna de prueba en un suero de ratón

Este video muestra la producción de vacunas tumorales con nanoemulsión. Los depósitos estables de los depósitos de petróleo que transportan péptidos sintéticos y adyuvantes se producen mediante nanoemulsión de baja energía, lo que ofrece una gran promesa para la inmunoterapia tumoral.

Preparación de una vacuna adyuvante en nanoemulsión

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.

Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Presentamos cuatro métodos para evaluar las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas utilizando técnicas in vitro . Estos métodos se pueden adaptar para estudiar las interacciones de diferentes nanopartículas y superficies nanoestructuradas con una amplia gama de especies microbianas.

Evaluación de las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas in vitro

En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico (AR) encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígeno. Al agregar el AR aprobado por la FDA a la nanoemulsión, se promovió la sIgA específica del antígeno en la vagina y el intestino delgado después de la inyección intramuscular de la nanoemulsión.

Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

Protocolos para la utilización de abrir las biopelículas de flujo del sistema de reactores de flujo por goteo y la rotación de los reactores de disco se presentan en detalle.

El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

Aprende a preparar y evaluar una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina mediante emulsificación de baja energía. Este método mejora la respuesta inmune y la protección in vivo.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

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