Explantes cocleares neonatales enteros como modelo in vitro
28 de julio de 2023
El protocolo actual actualiza los protocolos anteriores e incorpora enfoques relativamente sencillos para el cultivo de explantes cocleares de alta calidad. Esto proporciona una adquisición de datos fiable e imágenes de alta resolución en células vivas y fijas. Este protocolo apoya la tendencia actual de estudiar las células del oído interno.
Este protocolo incorpora un enfoque sencillo para agilizar los pasos de cultivo, obtener explantes de alta calidad y contribuirá a explorar y desvelar los mecanismos moleculares de las células cocleares. La principal ventaja de esta técnica es el mínimo manejo directo de los órganos mediante la coordinación de los pasos de disección, el recubrimiento adecuado de la superficie de polímero, el volumen medio optimizado y el tiempo de fijación de los explantes. Esta técnica representa un enfoque in vitro popular para estudiar la pérdida auditiva neurosensorial.
Esto se puede utilizar para establecer modelos ototóxicos, realizar análisis estructurales, evaluar vías de señalización y realizar estudios de detección de fármacos. En principio, este método se puede aplicar a diferentes explantes de tejidos. También se puede emplear en la investigación del oído interno para obtener información sobre las etapas de desarrollo embrionario.
Para comenzar, coloque la cabeza de la rata decapitada en la almohadilla estéril. Use tijeras y fórceps para quitar la mandíbula, luego levante la piel y retírela del cráneo. Coloque las pinzas en las cavidades orbitarias para sujetar el cráneo.
Con una hoja de bisturí afilada, corte con cuidado el cráneo a lo largo de la sutura sagital y luego el área de la sutura coronal sin dañar la cóclea. Ahora, retira el cerebro de las dos mitades del cráneo. Bajo el microscopio, localice la cóclea en el hueso temporal y afloje el tejido circundante entre la cóclea y el hueso temporal.
A continuación, coloque las pinzas en el canal semicircular superior. Separe suavemente el hueso temporal de la cóclea y sostenga la cóclea unida al vestíbulo con el hueso temporal. Inserte las puntas de las pinzas en la región del ápice, que es visible como una línea blanca, y retire la cápsula coclear cartilaginosa pieza por pieza para exponer el conducto coclear.
Coloque las pinzas debajo de la cóclea y sepárelas del órgano vestibular y del hueso temporal. Transfiera la cóclea a un plato nuevo de 60 milímetros que contenga PBS helado. Para aislar los órganos del explante de Corti, sostenga el órgano en la base y el conducto coclear en la región del gancho basal, y desenrolle suavemente el conducto coclear del modiolo sin desgarrarlo.
A continuación, sujete el conducto coclear por la base y retire el ligamento espiral y la estría vascular. Para aislar los explantes cocleares, use fórceps para separar el ganglio espiral de la lámina espiral ósea y desenrolle el modiolo durante el desprendimiento. Con unas pinzas, agarre la región del gancho y retire el ligamento espiral con la estría vascular.
Además, retire la membrana de Reissner pieza por pieza. Para transferir los explantes cocleares, sumerja una espátula de laboratorio en el plato que contiene el explante. Levante el explante con las células ciliadas hacia arriba junto con unos microlitros de PBS agitando una espátula.
Coloque el explante en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos agitando suavemente la espátula en el medio. Deje que el explante se deslice dentro de la cámara. Con una pipeta de 100 microlitros, retire 80 microlitros de medio y deséchelo.
Compruebe la visibilidad de las células ciliadas y las células de las neuronas ganglionares espirales bajo el microscopio. Si es necesario, use fórceps para separar el tejido superpuesto. Retire el medio restante del pozo.
El explante ahora quedará más plano en la superficie de la cámara. Después de 10 segundos, pipetee una o dos gotas del medio justo al lado del explante, y el medio restante a cierta distancia para evitar el desprendimiento del explante. Asegúrese de que los explantes no se muevan mientras agrega el medio.
Incuba la cámara durante dos horas para unir los órganos firmemente al fondo de la cámara. Después de la incubación, aspire el medio. Y con una pipeta de 100 o 200 microlitros, agregue con cuidado 300 microlitros de medio completo fresco y precalentado.
Las imágenes microscópicas confocales del disco giratorio mostraron que el órgano de rata de los explantes de Corti mantuvo su estructura y longitud total tanto en condiciones normales como estresadas. Además, un microscopio confocal de barrido demostró que las células ciliadas supervivientes de los explantes de los órganos de los ratones junto con las células ciliadas que sufrían apoptosis. El protocolo permitió la monitorización de los procesadores biológicos en células cocleares vivas utilizando sondas permeables a las células adecuadas y un microscopio confocal de disco giratorio.
El cultivo de estos explantes cocleares mejora el análisis de la interacción entre las células ciliadas y las células ganglionares espirales. Las células ciliadas de los implantes cocleares se detectaron con el marcador de células ciliadas, MYO7A. Del mismo modo, se identificaron cuerpos de células ganglionares espirales sanos y dañados y neuritas utilizando el marcador neuronal, Tuj 1.
En la descripción ampliada, los cuerpos celulares de las células ciliadas marcadas con el anticuerpo MYO7A eran visibles. Se identificaron estereocilios de células ciliadas externas e imágenes deconvoneadas de estereocilios individuales de células ciliadas internas marcadas con faloidina. Se debe tener cuidado durante los procedimientos bajo el microscopio, especialmente al separar el ganglio espiral de la lámina espiral ósea.
Los explantes intactos deben transferirse y alinearse con cuidado. Este protocolo optimizó los estudios in vitro en explantes del oído interno. Los resultados de estos estudios, como las vías de señalización y la toxicidad de los fármacos, pueden guiar el diseño de estudios in vivo posteriores.
Descripción general
Este protocolo presenta un enfoque refinado para el cultivo de explantes cocleares destinado a estudiar las células del oído interno. La metodología mejora la calidad de los explantes, contribuyendo al entendimiento de los mecanismos celulares cocleares y de posibles respuestas ototóxicas. Las técnicas de imagen en vivo proporcionan información sobre las interacciones y viabilidad de las células cocleares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular coclear
- Investigación sobre la pérdida auditiva
Antecedentes
- Este protocolo actualiza los métodos previos para el cultivo de explantes cocleares.
- Las células del oído interno son fundamentales para estudiar la pérdida auditiva sensorioneural.
- La imagenología de alta resolución es esencial para evaluar la salud celular y la señalización.
- Los avances en las técnicas de cultivo minimizan el daño durante la disección.
Objetivo del estudio
- Optimizar el cultivo de explantes cocleares para obtener datos confiables.
- Facilitar la exploración de los mecanismos moleculares en las células cocleares.
- Apoyar el análisis estructural y el cribado de fármacos en modelos de pérdida auditiva.
Métodos Utilizados
- Este estudio emplea una plataforma estandarizada de cultivo de órganos.
- Los explantes cocleares de rata se aislaron cuidadosamente y se cultivaron en un ambiente controlado.
- Los pasos incluyen la disección, la transferencia a placas de cultivo y la fijación en condiciones de medio bajo.
- Los tiempos de incubación son críticos para la viabilidad y estabilidad del explante durante la observación.
- Se utilizaron técnicas de imagen de alta resolución, como la microscopía confocal con disco giratorio.
Resultados Principales
- Los explantes mantuvieron su estructura tanto en condiciones normales como en condiciones de estrés.
- Se identificaron células pilosas sobrevivientes junto con aquellas que estaban en proceso de apoptosis.
- Se observaron interacciones significativas entre las células pilosas y las células del ganglio espiral.
- Se utilizaron marcadores como MYO7A y Tuj 1 para evaluar la viabilidad celular y la diferenciación.
Conclusiones
- Este protocolo refinado permite un estudio mejorado de las interacciones celulares y los mecanismos dentro de la cóclea.
- Las metodologías empleadas destacan la importancia de una disección cuidadosa y de condiciones de cultivo adecuadas.
- Los conocimientos obtenidos de estos estudios pueden orientar futuras investigaciones in vivo sobre la pérdida auditiva y los mecanismos regenerativos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los explantes cocleares completos de neonatos proporcionan un modelo robusto in vitro para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la hipoacusia neurosensorial. Esta plataforma permite un análisis de alto contenido sobre la viabilidad de las células ciliadas y las neuronas, lo que respalda la confianza predictiva en la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas. El flujo de trabajo optimizado y la reproducibilidad del método lo posicionan como un recurso valioso para la selección de proyectos y la investigación traslacional en terapias para la pérdida auditiva.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de las interacciones entre células pilosas y neuronas del ganglio espiral en un sistema controlado.
- Apoya la desestimación mecanicista al permitir estudios de vías y toxicidad relacionados con la pérdida auditiva.
- Facilita la validación funcional del blanco mediante análisis cuantitativo de imágenes y marcadores moleculares.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una plataforma estandarizada de explantes para estudios reproductibles de cribado de ototoxicidad y fármacos.
- Ofrece resultados cuantitativos mediante imágenes confocales y marcadores específicos de células (por ejemplo, MYO7A, Tuj 1).
- Permite la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma en múltiples condiciones experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en la pérdida auditiva sensorioneural y la evaluación de ototoxicidad.
- Apoya la continuidad desde estudios mecanicistas in vitro hasta la validación in vivo de hipótesis terapéuticas.
- Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar datos predictivos sobre las respuestas celulares.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este modelo de explante conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, el análisis de vías y la evaluación de compuestos dentro de un flujo de trabajo unificado.
- Biología del Descubrimiento: Apoya estudios basados en hipótesis sobre la supervivencia celular coclear y los mecanismos de señalización.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles para la selección de compuestos y toxicidad.
- Análisis: Permite imágenes de alta resolución y cuantificación basada en marcadores de viabilidad celular y apoptosis.
- Investigación Traducional: Ofrece un sistema relevante para enfermedades con continuidad preclínica en la investigación sobre pérdida auditiva.
- Reutilización Empresarial: Adaptable para diversos diseños experimentales y tipos de tejido en la investigación auditiva.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos terapéuticos.
- Valor operativo: Optimiza la preparación de explantes, estandariza las condiciones de cultivo y mejora la reproducibilidad.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en programas tempranos de pérdida auditiva.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos dirigidos a la patología coclear.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microdisección e imagen confocal para la preparación y análisis óptimos de los explantes.
- Exige acceso a sistemas de cultivo multipocillo y marcadores moleculares validados para la identificación celular.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de disección, cultivo y adquisición de imágenes.
- Es adaptable a diversos modelos de roedores y potencialmente a otros explantes de tejido con modificaciones del protocolo.
- Es fundamental un manejo cuidadoso para mantener la integridad del explante y garantizar resultados cuantitativos confiables.
