Name: Implantación de minibomba osmótica para aumentar la concentración de glucosa en líquido cefalorraquídeo de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprende a implantar minibombas osmóticas en ratones para elevar glucosa en líquido cefalorraquídeo sin alterar glucosa sanguínea. Este método permite estudiar efectos cerebrales específicos y disfunción cognitiva.

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Los Institutos Nacionales de Salud otorgan DK124619 a KHC.
Fondos iniciales y premio de investigación piloto, Departamento de Medicina, Universidad de Rochester, NY, a KHC.
Premio de Investigación Piloto del Instituto Del Monte para la Neurociencia, Universidad de Rochester, a KHC.
Premio de Investigación Universitaria, Oficina del Vicepresidente de Investigación, Universidad de Rochester, NY, a KHC.
MUR diseñó y realizó el método, analizó los resultados, preparó gráficos y figuras, y escribió y editó el manuscrito. KHC concibió y supervisó el estudio, analizó los resultados y escribió y editó el manuscrito. KHC es el garante de este trabajo. Todos los autores aprobaron la versión final del manuscrito.

Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester y se realizaron de acuerdo con las pautas del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos para el cuidado humanitario y el uso de animales de experimentación. Se obtuvieron comercialmente ratones machos C57BL / 6J de seis semanas de edad utilizados para este estudio. Todos los animales fueron alojados en grupo (5 ratones por jaula) en una habitación con un ciclo día/noche de 12 h y se les dio acceso a alimentos y agua ad libitum. Después de que a los ratones se les implantó una cánula para infundir glucosa en el ventrículo lateral, se alojaron solo para evitar cualquier daño a los implantes de otros ratones.
1. Montaje de minibombas osmóticas
<ol><li>Prepare el líquido cefalorraquídeo artificial (LCR) de acuerdo con el siguiente protocolo. Disuelva NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl 2,2H 2 O (0,206 g) y MgCl 2,6H 2 O (0,163 g) en 500 ml de agua estéril para preparar la solución A. Disuelva Na 2 HPO 4.7H 2 O (0,214 g) y NaH 2 PO4. H2O(0,027 g) en 500 mL de agua estéril para preparar la solución B. Luego, mezcle la solución A y B en una proporción de 1: 1 para preparar el aCSF. NOTA: Esta formulación de aCSF no contiene glucosa.</li>
	<li>Para preparar la solución de glucosa al 50%, agregue 50 g de glucosa a 50 ml de aCSF en un vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en una placa caliente y lleve la temperatura de la suspensión a 60 °C. Mezcle la suspensión con un agitador magnético hasta que la glucosa se disuelva por completo.</li>
	<li>Agregue aCSF al vaso de precipitados para que el volumen final sea de 100 ml. Pase la solución a través del filtro de poros de 0,22 μm para esterilizarla.</li>
	<li>Prepare una solución salina al 0,9% (NaCl) y pase la solución a través del filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Coloque todos los componentes de la minibomba y el kit de infusión en una bandeja estéril y corte el tubo del kit de infusión cerebral a 1 pulgada de largo con una tijera estéril. Sostenga el tubo con un hemostático estéril y empújelo en la parte superior de un extremo de la cánula. Conecte el otro extremo del tubo a la parte superior del modulador de flujo. Cubra ambos extremos del tubo con una pequeña cantidad de pegamento para una conexión más fuerte.</li>
	<li>Coloque una aguja de 27 G en una jeringa de 1 ml y llénela con aCSF o la solución de glucosa. Inserte la aguja de 27 G en un pequeño trozo de tubo. Luego, conecte el tubo al extremo abierto del modulador de flujo y llénelo con la solución correspondiente hasta que las gotas de la solución comiencen a salir de la cánula. Retire cualquier burbuja de aire atrapada en el tubo.</li>
	<li>Para llenar la minibomba, sostenga la bomba en posición vertical e inserte la aguja de la jeringa en la bomba. Llénelo con la solución correspondiente hasta que comience a formarse una gota de la solución en la apertura de la minibomba.</li>
	<li>Inserte lentamente el modulador de flujo en la bomba mientras se asegura de no introducir burbujas de aire en el conjunto.</li>
	<li>Después de ensamblar las minibombas osmóticas, transfiéralas a un tubo cónico de 50 ml. Llene el tubo con la solución salina estéril para que las bombas queden completamente sumergidas, mientras se asegura de que la cánula permanezca fuera de la solución salina. Cuatro de estas bombas ensambladas se pueden colocar en un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Coloque la tapa suelta en cada tubo e incube las bombas a 37 °C para cebar durante al menos 48 h.</li>
</ol>2. Cirugía para implantar bombas osmóticas
<ol><li>Procedimiento prequirúrgico<ol><li>Esterilice los instrumentos quirúrgicos en un autoclave y déjelos enfriar durante al menos 30 minutos antes de usarlos. Las condiciones del autoclave implican esterilización por vapor a 121 °C durante 30 min.</li>
		<li>Desinfecte el área de la cirugía con etanol al 70%. Limpie las perillas, las barras para los oídos y la superficie del marco estereotáxico. NOTA: La cirugía debe realizarse en un ambiente aséptico, teniendo en cuenta evitar tocar superficies no estériles mientras se realiza la cirugía. Reemplace los guantes si hay sospecha de contaminación.</li>
		<li>Coloque el ratón en una cámara de anestesia para anestesiarlo con isoflurano al 3% mezclado en aire durante 3-5 min. Luego, retire el ratón de la cámara y colóquelo en una cortina estéril. Mantener la anestesia a través de un cono nasal en 1.5% -2%.</li>
		<li>Pellizque la pata trasera del ratón para observar cualquier reflejo y verificar la profundidad de la anestesia.</li>
		<li>Inyecte 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea para analgesia.</li>
		<li>Use cortapelos limpios para sujetar el área de la cirugía en la cabeza del ratón. Frote el cuero cabelludo primero con solución de povidona yodada y luego con hisopos de alcohol a fondo durante al menos 2 minutos. Repita este proceso al menos tres veces.</li>
		<li>Aplique un lubricante ocular para evitar que los ojos se sequen durante la cirugía.</li>
	</ol></li>
	<li>Cirugía<ol><li>Coloque el ratón sobre el marco estereotáxico y ajuste la cabeza en la barra incisiva. Cubra la nariz con el cono de la nariz. Aplique cortinas estériles para asegurar el área quirúrgica.</li>
		<li>Cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz. Continúe manteniendo la anestesia al 1,5% -2% de isoflurano.</li>
		<li>Coloque una almohadilla térmica debajo del ratón para mantener la temperatura corporal.</li>
		<li>Póngase guantes estériles nuevos y, con un bisturí, haga una incisión en la línea media (~ 10-15 mm de largo) en el cuero cabelludo. Exponga la superficie del cráneo con una espátula mientras usa puntas de algodón para limpiar cualquier sangrado. NOTA: Use un cauterizador si sangra profusamente, lo cual es raro.</li>
		<li>Frote con una punta de algodón sumergida en peróxido de hidrógeno al 3% para exponer las suturas craneales.</li>
		<li>Tome nota de bregma y lambda para navegar por las coordenadas del cráneo. Establezca todas las coordenadas en cero en bregma. NOTA: Estas coordenadas se obtuvieron de un atlas cerebral de ratón14. La distancia bregma-lambda de referencia en el atlas es de 4,21 mm. Para corregir las diferencias basadas en la edad y el sexo en el tamaño del cráneo, se midió la distancia bregma-lambda para cada ratón y luego se dividió por 4,21 mm para obtener un factor de multiplicación. Por ejemplo, si la distancia entre bregma y lambda era de 4,65 mm, la división por 4,21 mm daba un factor de multiplicación de 1,10. Todas las coordenadas obtenidas del atlas se multiplicaron con este factor para medir las coordenadas reales que se utilizaron para perforar el agujero. En el ejemplo anterior, las coordenadas resultantes anterior-posterior (AP) y medial-lateral (ML) serían 0,55 y 1,1 mm, respectivamente (es decir, 1,1 x 0,5 o 1 mm).</li>
		<li>Use un taladro eléctrico para hacer un agujero en estas coordenadas: 0,5 mm posterior a bregma y 1 mm lateral a la línea media hacia la derecha. NOTA: Mientras perfora el orificio en el cráneo, tenga cuidado de no romper la duramadre. Asegúrese de que la broca sea estéril. Se puede colocar con otros instrumentos en la misma bolsa de autoclave para su esterilización.</li>
		<li>Inserte un hemostático debajo de la piel incisa y empújelo hasta el lugar donde se implantará la minibomba osmótica. Abra y cierre suavemente el hemostático para hacer un bolsillo para la minibomba.</li>
		<li>Use un hemostático estéril para recoger una minibomba osmótica cebada de la punta del modulador de flujo. Empuje la bomba a través de la piel incisa en el bolsillo. NOTA: Tenga cuidado de no dejar que la bomba y la cánula toquen ninguna superficie no estéril.</li>
		<li>Aplique un poco de pegamento en la parte inferior de la cánula y fíjelo en el soporte de la cánula. Baje la cánula lentamente a través del orificio perforado 2 mm ventral hasta la superficie del cráneo. Déjelo allí durante al menos 5 minutos para permitir que el pegamento se solidifique.</li>
		<li>Antes de insertar la cánula en el cerebro, asegúrese de que la cánula no esté obstruida y que la solución fluya correctamente. NOTA: A veces, la glucosa puede depositarse en la punta de la cánula debido a un caudal muy bajo, bloqueando el flujo.</li>
		<li>Con la ayuda de una tijera, recorte la parte superior de la cánula asegurándose de que no se desprenda de la superficie del cráneo.</li>
		<li>Cubra la cánula con una capa de cemento dental para un soporte adicional.</li>
		<li>Use suturas de nylon (tamaño 5-0 y 30 pulgadas de largo) para cerrar la herida y aplique antibióticos tópicos en la herida para prevenir infecciones.</li>
		<li>Apague el isoflurano y deje que el animal se recupere de la anestesia. Luego, transfiera al animal a una nueva jaula limpia.</li>
	</ol></li>
	<li>Atención postoperatoria<ol><li>Después de la cirugía, controle al ratón durante al menos 1 semana.</li>
		<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea, una vez cada 24 horas durante tres días después de la cirugía.</li>
		<li>Deje que la herida sane completamente antes de retirar las suturas 7-10 días después de la cirugía. NOTA: Se observó que los ratones con niveles altos de glucosa en LCR tardaron más en sanar. Recortar las uñas en las patas traseras del ratón minimiza la posibilidad de lesiones en el sitio de la incisión debido al comportamiento de rascado de los ratones.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sustitución de las minibombas
NOTA: Dado que las minibombas utilizadas en este estudio duran solo 4 semanas, el reemplazo de minibombas también se probó para extender la duración de la infusión de glucosa, ya que puede ser necesario en el caso de estudios a largo plazo. Esto implicó los siguientes pasos.
<ol><li>Prepare a los ratones para la cirugía como se detalla anteriormente.</li>
	<li>Haga una pequeña incisión vertical de 1 cm en la piel ligeramente por encima de la bomba.</li>
	<li>Inserte un hemostático debajo de la piel incisa y saque la bomba.</li>
	<li>Retire la bomba del tubo y conecte una nueva bomba cebada al tubo.</li>
	<li>Inserte la bomba de nuevo dentro y cose la piel.</li>
	<li>Siga las mismas instrucciones de cuidado después de la cirugía que se describieron anteriormente.</li>
</ol>4. Procedimiento de recogida de la peste porcina clásica
<ol><li>Preparación<ol><li>Tire de capilares de vidrio de 1 mm de diámetro con una máquina extractora de micropipetas para obtener puntas de 0,5 mm de diámetro. Los ajustes son: calor = 800, tracción = 15, velocidad = 5 y tiempo = 200 unidades. Coloque los capilares extraídos en una caja estéril hasta que los use.</li>
		<li>Acople una aguja de 27 G a una jeringa de 1 ml. Inserte el capilar tirado en la aguja y use una pequeña cinta adhesiva para asegurar la conexión.</li>
		<li>Fije firmemente la jeringa en un soporte capilar de un micromanipulador.</li>
		<li>A continuación, prepare el ratón para la cirugía, como se describe en el procedimiento previo a la cirugía anterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimiento quirúrgico<ol><li>Coloque el ratón sobre el marco estereotáxico. Después de fijar la cabeza en el marco, como se describió anteriormente, gire las perillas para inclinar la cabeza de modo que la nariz quede hacia abajo. Aplique cortinas estériles para asegurar el área quirúrgica.</li>
		<li>Haga una pequeña incisión en la superficie dorsal, comenzando desde el plano intraaural hasta el lado caudal. NOTA: Tenga cuidado de no dañar el tubo mientras hace la incisión.</li>
		<li>Retire el soporte del cuerpo del ratón y deje que el ratón descanse verticalmente para que el cuello quede completamente extendido dorsalmente.</li>
		<li>Con la ayuda de pinzas romas curvas, divida suavemente los músculos posteriores del cuello desde la línea media para crear una pequeña ventana. Luego, use un aplicador de punta de algodón húmedo para desplazar suavemente los músculos del cuello desde la línea media hasta la periferia.</li>
		<li>Observe si la cisterna magna está expuesta, que aparece como una ventana triangular con una membrana de duramadre transparente.</li>
		<li>Coloque el conjunto del micromanipulador en el marco estereotáxico junto al ratón mientras se asegura de que la punta capilar no toque ninguna superficie.</li>
		<li>Rompa suavemente la punta capilar sin alterar la configuración.</li>
		<li>Mientras mira dentro de la lupa (aumento de 2.25x), gire las perillas correspondientes en el micromanipulador para alinear lentamente y mover la punta capilar hacia la cisterna magna.</li>
		<li>Se siente cierta resistencia una vez que la punta capilar toca la membrana de la cisterna magna. Muy lentamente empuje la punta contra la membrana con la ayuda de las perillas. NOTA: Tenga cuidado de no dañar ningún vaso sanguíneo en la membrana. Este paso es muy importante para evitar cualquier contaminación de la sangre en el LCR.</li>
		<li>Perfore muy suavemente la membrana. El LCR comenzará a fluir hacia el capilar de inmediato debido a la presión negativa en el capilar.</li>
		<li>Deje la configuración durante unos minutos hasta que se recojan ~ 10 μL de LCR en el capilar.</li>
		<li>Luego, extraiga lentamente el capilar de la cisterna magna y presione suavemente un aplicador de punta de algodón estéril contra la abertura de la cisterna magna para detener la fuga de LCR.</li>
		<li>Retire con cuidado el capilar de la jeringa y conéctelo a un dispensador de bulbo de microtapa. Presione la bombilla para transferir el LCR a un tubo de microcentrífuga estéril.</li>
		<li>Coloque un soporte debajo del mouse y gire las perillas estereotáxicas para nivelar la cabeza.</li>
		<li>Cierre la herida con suturas de nylon.</li>
		<li>Inyecte 300 μL de solución salina estéril por vía subcutánea antes de retirar el ratón del aparato.</li>
		<li>Dar cuidado postoperatorio a los animales como se describió anteriormente, hasta que sea el momento de retirar las suturas-~7-10 días después de la cirugía.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ensayo de glucosa
<ol><li>Siga el protocolo descrito en el kit de ensayo colorimétrico de glucosa.</li>
	<li>Diluir la solución madre reguladora de fosfato de sodio suministrada en el kit hasta una concentración de 50 mM en agua ultrapura.</li>
	<li>Prepare estándares de glucosa en rangos de 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25 y 50 mg / dL de la solución madre de 1,000 mg / dL proporcionada en el kit en solución tampón diluida.</li>
	<li>Prepare una dilución de 7 veces de muestras de LCR en el tampón. Por ejemplo, si el volumen total de LCR recogido es de 10 μL, entonces el volumen diluido de siete veces será de 70 μL.</li>
	<li>Pipetear 15 μL de patrones de glucosa y LCR diluido por duplicados en una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Pipetear 85 μL de tampón diluido en cada uno de los pocillos con patrones y LCR.</li>
	<li>Agregue 6 ml de tampón diluido al vial de mezcla de enzimas calorimétricas de glucosa y vórtice durante unos segundos para mezclar bien.</li>
	<li>Agregue 100 μL de la preparación de la mezcla enzimática a cada pocillo para comenzar la reacción.</li>
	<li>Selle la placa con una hoja de cubierta y golpee suavemente la placa para mezclar los reactivos.</li>
	<li>Colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante 10 min. Los viales con niveles altos de glucosa comienzan a volverse violetas inmediatamente.</li>
	<li>Después de 10 minutos, retire la tapa y mida la absorbancia a 500-520 nm con un lector de placas.</li>
	<li>Calcular la concentración de glucosa en las muestras de LCR interpolando sus valores de la curva estándar.</li>
</ol>6. Análisis de glucosa en sangre
<ol><li>Haga un pequeño corte lateral a la cola del ratón con una cuchilla de afeitar y use una gota de sangre para medir la glucosa en sangre con un glucómetro, de acuerdo con las instrucciones manuales.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Este artículo informa un protocolo detallado para aumentar la glucosa en LCR en ratones mediante el uso de minibombas osmóticas conectadas a una cánula implantada en el ventrículo lateral. La infusión crónica de glucosa en el cerebro del ratón a través de este procedimiento será útil para delinear los efectos de la hiperglicerrafia a largo plazo en la cognición, el metabolismo sistémico de la glucosa y el equilibrio energético y para comprender mejor la patogénesis de las complicaciones de la diabetes.
<p class="jove...

Tanto la diabetes tipo 1 como la diabetes tipo 2 afectan la función cerebral 1,2,3. Por ejemplo, la diabetes aumenta el riesgo de deterioro cognitivo y trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer 3,4. Además, las personas con diabetes tienen una detección defectuosa de glucosa en el cerebro 5,6. Este defecto contribuye a la patogénesis de la hipoglucemia asociada al desconocimiento y a una respuesta contrarreguladora insuficiente a la hipoglucemia7,8, que puede ser fatal si no se trata inmediatamente.
Teniendo en cuenta que la diabetes aumenta los niveles de glucosa en la sangre, así como en el líquido cefalorraquídeo (LCR)9, es importante determinar si uno o ambos de estos factores contribuyen a la función cerebral deteriorada. Si la diabetes causa daño cerebral por la glucosa alta en LCR sola o en combinación con otros factores como la deficiencia de insulina o la resistencia a la insulina también es una pregunta abierta. Los modelos animales de diabetes tipo 1 y tipo 2 muestran deterioro cognitivo y neurodegeneración, además de un balance energético afectado y un metabolismo periférico de la glucosa10,11,12,13. Sin embargo, a partir de estos modelos, no es factible desacoplar los efectos selectivos de los niveles altos de glucosa en LCR versus los niveles de glucosa en sangre en la mediación de las complicaciones de la diabetes en la función cerebral.
Este protocolo describe métodos para desarrollar un modelo de ratón de hiperglicerrafia para probar los efectos de los niveles crónicamente altos de glucosa en LCR sobre la función cerebral, el equilibrio energético y la homeostasis de la glucosa. El modelo de ratón desarrollado a través de esta técnica presenta una herramienta para estudios que investigan el papel etiológico de la homeostasis desregulada de la glucosa en la función neuronal y conductual.
Por lo tanto, el enfoque propuesto será útil para comprender los efectos directos de los niveles elevados de glucosa en LCR en diversas condiciones fisiopatológicas.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m filtro de jeringa</td><td>Soluciones de membrana</td><td>SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 mL estéril Jeringa (punta Luer-lok)</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa TB</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>100 mL Vaso de precipitados de vidrio</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol (Koptec)</td><td>DLI</td><td>UN170</td><td>Utilice una dilución al 70% para limpiar el área de la cirugía</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>N/A Indicador</td><td></td></tr><tr><td>de alineamiento</td><td>KOPF</td><td>1905</td><td></td></tr><tr><td>Kit de infusión cerebral Alzet</td><td>DURECT</td><td>Kit # 3; 0008851</td><td>Corte el tubo del kit a 1 pulgada de longitud</td></tr><tr><td>Bomba osmótica Alzet</td><td>DURECT</td><td>2004</td><td>Caudal 0,25 & L/h</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Betadine solution</td><td>Avrio Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 . 2H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de cánula</td><td>KOPF</td><td>1966</td><td></td></tr><tr><td>Visor de centrado</td><td>KOPF</td><td>1915</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental líquido</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental en polvo</td><td>Lang Dental</td><td>REF1220-C</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taladro eléctrico</td><td>KOPF</td><td>1911</td><td>Al perforar un orificio, evite la ruptura de la duramadre</td></tr><tr><td>Lubricante ocular (Optixcare)</td><td>CLC Medica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas de vidrio (Germinator 500)</td><td>VWR</td><td>101326-488</td><td>Coloque los instrumentos en agua estéril para que se enfríen antes de la cirugía</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de glucosa</td><td>Cayman chemical</td><td>10009582</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009-500ml</td><td>Aplique H2O2 al 3% en la superficie del cráneo para hacer visibles las suturas craneales.</td></tr><tr><td>Cortapelos</td><td>WAHL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>almohadilla térmica</td><td>Heatpax</td><td>19520483</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Fluriso)</td><td>Zoetis</td><td>NDC1385-046-60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>0395-500g</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>WPI</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de escritorio de aumento</td><td>Brightech</td>Espátula metálica <td>LightView Pro Flex 2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 . 6H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador (diestro)</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador con pantalla digital</td><td>KOPF</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 . 7H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5Kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 . H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Johnson & Johnson</td><td>N/A</td><td>Aplicar ungüento tópico para prevenir la infección</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>DM-999</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofeno) 50mg/ml</td><td>Zoetis</td><td>N/A</td><td>5 mg/kg, subcutáneo, para analgesia</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de alineación estereotáxica</td><td>KOPF</td><td>1900</td><td></td></tr><tr><td>Aguja estéril de calibre 27</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estériles de punta de algodón (Solon)</td><td>AMD Medicom</td><td>56200</td><td></td></tr><tr><td>Suturas estériles de nailon (5.0)</td><td>Oasis</td><td>MV-661</td><td>Utilice una sutura no absorbente para cerrar la herida</td></tr><tr><td>Tijeras afiladas estériles&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas quirúrgicas estériles</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos (Nitrilo)</td><td>Ammex</td><td>N/A</td><td>Cambie los guantes si hay suspicacia de contaminación</td></tr><tr><td></td><td>Bandeja N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

implantación de minibomba osmótica para aumentar la concentración de glucosa en líquido cefalorraquídeo de ratón

Osmotic Minipump Implantation for Increasing Glucose Concentration in Mouse Cerebrospinal Fluid

La diabetes aumenta el riesgo de deterioro cognitivo y afecta la función cerebral. Si esta relación entre la glucosa alta y los déficits cognitivos es causal sigue siendo difícil de alcanzar. Además, tampoco está claro si estos déficits están mediados por un aumento en los niveles de glucosa en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y / o la sangre. Hay muy pocos estudios que investiguen los efectos directos de los niveles altos de glucosa en el LCR en la función del sistema nervioso central (SNC), especialmente en el aprendizaje y la memoria, ya que los modelos actuales de diabetes no están lo suficientemente desarrollados para abordar tales preguntas de investigación. Este artículo describe un método para aumentar crónicamente los niveles de glucosa en LCR durante 4 semanas mediante la infusión continua de glucosa en el ventrículo lateral utilizando minibombas osmóticas en ratones. El protocolo se validó midiendo los niveles de glucosa en LCR. Este protocolo aumentó los niveles de glucosa en LCR a ~ 328 mg / dL después de la infusión de una solución de glucosa al 50% a una velocidad de flujo de 0.25 μL / h, en comparación con una concentración de glucosa en LCR de ~ 56 mg / dL en ratones que recibieron líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). Además, este protocolo no afectó los niveles de glucosa en sangre. Por lo tanto, este método se puede utilizar para determinar los efectos directos de la glucosa alta en LCR en la función cerebral o una vía neuronal específica independientemente de los cambios en los niveles de glucosa en sangre. En general, el enfoque descrito aquí facilitará el desarrollo de modelos animales para probar el papel de la glucosa alta en el LCR en la mediación de las características de la enfermedad de Alzheimer y / u otros trastornos neurodegenerativos asociados con la diabetes.

A los ratones machos se les implantó una cánula ensamblada en una minibomba osmótica (Figura 1) para infundir crónicamente aCSF o una solución de glucosa al 50% en sus ventrículos laterales (Figura 2). El LCR se recolectó 10 días después de la cirugía (Figura 3) para validar la eficacia de este procedimiento. Los resultados mostraron un aumento en los niveles de glucosa en LCR (media: 327,7 mg / dL) en ratones infundidos con 50% de ...

Este artículo describe un protocolo detallado para aumentar la concentración de glucosa en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de ratones. Este enfoque puede ser útil para estudiar los efectos de la glucosa alta en LCR en la neurodegeneración, la cognición y el metabolismo periférico de la glucosa en ratones.

Implantación de minibomba osmótica para aumentar la concentración de glucosa en líquido cefalorraquídeo de ratón

Diabetes increases the risk of cognitive decline and impairs brain function. Whether or not this relationship between high glucose and cognitive deficits ...

Esta técnica aumenta los niveles de glucosa en líquido cefalorraquídeo o LCR en ratones sin afectar su concentración de glucosa en sangre. Esto ayuda a investigar los efectos directos de los altos niveles de glucosa en LCR en la función cerebral del animal. Esta técnica puede establecer modelos animales para explorar el papel teológico de la glucosa más alta en el LCR en la disfunción cognitiva.Dando lugar al descubrimiento de nuevas dianas moleculares para mejorar la función cognitiva. El método también ayudará a determinar si los niveles altos de glucosa en LCR son suficientes para mediar fenotipos de trastornos neurodegenerativos en ratones. Se debe prestar atención al ensamblaje y cebado adecuados de la configuración de la cánula y la inserción de la cánula en el cerebro en las coordenadas correctas.Para comenzar la cirugía para la implantación de minibomba osmótica, coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáxico. Coloque la cabeza del animal en la barra incisiva. Cubra la nariz con el cono de la nariz para mantener la anestesia y conecte el flujo de isofluorano al cono de la nariz a una velocidad de 1.5 a 2%Coloque una almohadilla térmica debajo del mouse para mantener la temperatura corporal.Después de desinfectar el área quirúrgica y hacer una incisión, exponga la superficie del cráneo con una espátula y limpie la sangre, si la hay, con puntas de algodón. Use un cauterizador si sangra profusamente. Frote con una punta de algodón sumergida en peróxido de hidrógeno al 3% para exponer las suturas craneales.Trabajando bajo un microscopio, tome nota de bregma y lambda para navegar por las coordenadas del cráneo. Establezca todas las coordenadas en cero en bregma. Usando un taladro eléctrico con cuidado y sin romper la duramadre, haga un agujero en las coordenadas 0,5 milímetros posterior a bregma y 1 milímetro lateral a la línea media hacia la derecha.Inserte un hemostático y ábralo y ciérrelo suavemente para hacer un bolsillo para la mini bomba. Sosteniendo la bomba desde la punta del modulador de flujo, empuje a través de la piel incisa hacia el bolsillo creado. Aplique un poco de pegamento en la parte inferior de la cánula y fíjelo en el soporte de la cánula.Asegúrese de que la cánula no esté obstruida y que la solución fluya correctamente. Luego baje la cánula lentamente a través del orificio perforado, dos milímetros ventral a la superficie del cráneo. Déjelo allí durante al menos cinco minutos para permitir que el pegamento se solidifique.Con la ayuda de tijeras, recorte la parte superior de la cánula asegurándose de que no se desprenda de la superficie del cráneo. Cubra la cánula con una capa de cemento dental para un soporte adicional. Para la recolección de líquido cefalorraquídeo o LCR, coloque el ratón debidamente anestesiado en el marco estereotáxico.Después de fijar la cabeza en el marco como se demostró anteriormente, gire las perillas para inclinar la cabeza de modo que la nariz mire hacia abajo. Después de desinfectar el área quirúrgica y hacer una incisión, retire el soporte del cuerpo del ratón y deje que el ratón descanse verticalmente para que el cuello esté completamente extendido dorsalmente. Usando pinzas romas curvas, divide suavemente los músculos posteriores del cuello desde la línea media para crear una pequeña ventana.Luego use un aplicador de punta de algodón húmedo para desplazar suavemente los músculos del cuello desde la línea media hasta la periferia. Observe si la cisterna magna está expuesta como una ventana triangular con una membrana de duramadre transparente. Coloque el conjunto del micromanipulador en el marco estereotáxico junto al ratón mientras se asegura de que la punta capilar no toque ninguna superficie.Rompa suavemente la punta capilar sin alterar la configuración. Gire las perillas correspondientes en el micromanipulador para alinearlo lentamente y mover la punta capilar hacia la cisterna magna. Se siente cierta resistencia una vez que la punta capilar toca la membrana de la cisterna magna.Muy lentamente empuje la punta contra la membrana con la ayuda de las perillas teniendo cuidado de no dañar ningún vaso sanguíneo en la membrana. A medida que se perfora la membrana, el LCR fluye hacia el capilar de inmediato debido a la presión capilar negativa. Deje la configuración durante unos minutos hasta que aproximadamente 10 microlitros de LCR se acumulen en el capilar.Retire con cuidado el capilar de la jeringa y conéctelo a un dispensador de bulbo de microtapa. Presione la bombilla para transferir el LCR a un tubo estéril de microcentrífuga. Coloque el soporte debajo del ratón y gire las perillas estereotáxicas para nivelar la cabeza.Cierre la herida con suturas de nylon. Inyecte 300 microlitros de solución salina estéril por vía subcutánea antes de retirar el ratón del aparato. Dar cuidados postoperatorios a los animales hasta que sea el momento de retirar las suturas, alrededor de 7 a 10 días después de la cirugía.El LCR recolectado 10 días después de la cirugía mostró un aumento de aproximadamente seis veces en el nivel de glucosa en ratones, infundidos con 50% de glucosa en comparación con los ratones infundidos con LCR. Sin embargo, los niveles de glucosa en sangre no fueron diferentes entre los grupos. Mientras baja la cánula en el cerebro, retraigala hacia atrás y verifique si el LCR sale del agujero.También es vital identificar correctamente la cisterna magna y prevenir la contaminación del LCR con sangre. Esta técnica también se puede utilizar para administrar cualquier medicamento que no pueda cruzar la barrera hematoencefálica para probar su efecto sobre la función cerebral. Hay un número muy limitado de modelos animales de diabetes, y alteran la homeostasis de la glucosa en el entorno periférico.Este modelo, sin embargo, ayuda a investigar los cambios específicos del cerebro en la regulación de la glucosa en la función neuronal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Como la investigación neurociencia se vuelve más sofisticada, la investigación de las estructuras del cerebro y los circuitos requiere mejorar los niveles de precisión y alta resolución. Hemos desarrollado un método para la preparación e implantación de un sistema de infusión crónica en el cerebro utiliza una micro cánula de borosilicato con un diámetro de la punta de 50 micras.

La construcción y la implantación de un Sistema de microinfusión para la entrega sostenida de agentes neuroactivos.

Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios.

A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

En este video, demostramos el montaje de un sistema de infusión cerebral con bomba micro-osmótica seguido de su implantación quirúrgica en el cráneo del ratón. Este sistema permite la administración continua de fármacos potenciales y facilita el estudio de sus efectos en el cerebro y el tejido cerebral.

Sistema de infusión continua de fármacos en modelos de ratón: un procedimiento quirúrgico para implantar un sistema de infusión de bomba microosmótica en el cerebro de ratón para la administración continua de fármacos

Este video demuestra el efecto de la infusión continua de medicamentos en el cerebro del ratón sobre los niveles de glucosa en la sangre. El metabolismo de la glucosa se evalúa mediante la recolección de sangre de la cola de un ratón en ayunas y la medición de los niveles de glucosa antes y después de la administración oral de glucosa. La tolerancia a la insulina se evalúa inyectando insulina en el ratón, con niveles de glucosa registrados a intervalos específicos.

Evaluación del efecto de la infusión continua de fármacos en el cerebro de ratón sobre los niveles periféricos de glucosa

Fuente: Wang, X. et. al., Administración de fármacos basada en bombas osmóticas para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el método para administrar medicamentos neuroterapéuticos utilizando una bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado. La liberación controlada del fármaco promueve la remielinización mediante la activación de las células productoras de mielina en el cuerpo calloso.

 Administración de fármacos neuroterapéuticos basados en bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado

La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Con el fin de estudiar la reorganización del cerebro en condiciones patológicas, utilizamos bombas miniosmóticas para la entrega directa de proteínas al cerebro, eludiendo la barrera hematoencefálica. A continuación, se inyectan trazadores del tracto para estudiar las alteraciones en la conectividad cerebral bajo la influencia de la proteína.

Implantación de miniosmótica Bombas y Entrega de Trazadores del Tracto para estudiar la reorganización del cerebro en condiciones fisiopatológicas

Este protocolo estudia el papel de la quimiocina ligando de (motivo C-C) 5 (CCL5) en el hipotálamo mediante la entrega de un antagonista, CCL5 Met, en el cerebro de ratón utilizando un sistema de infusión de cerebro de bomba micro-osmótico. Esta inhibición transitoria de la actividad CCL5 interrumpido insulina hipotalámica señalización, conduce a la intolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina sistémica periférica.

Estudio de la señal de insulina hipotalámica a la intolerancia de la glucosa periférica con un sistema de infusión continua de medicamentos en el cerebro de ratón

La administración crónica de isoproterenol a través de una bomba osmótica implantada se ha utilizado ampliamente para imitar la insuficiencia cardíaca avanzada en ratones. Aquí, describimos métodos detallados en la implantación quirúrgica de minibombas para la administración continua de isoproterenol durante 3 semanas, así como, evaluación ecocardiográfica para la creación exitosa del modelo.

Implantación de una minibomba de isoproterenol para inducir insuficiencia cardíaca en ratones

Proporcionamos un protocolo para generar un modelo farmacológico de ratón de distonía DYT/PARK-ATP1A3 mediante la implantación de cánulas en ganglios basales y cerebelo conectados a bombas osmóticas. Describimos la inducción de movimientos similares a la distonía a través de la aplicación de un desafío motor y la caracterización del fenotipo a través de sistemas de puntuación conductual.

Implantación de bombas osmóticas e inducción del estrés para establecer un modelo sintomático de ratón farmacológico para la distonía DYT/PARK-ATP1A3

La desmielinización tiene lugar en múltiples enfermedades del sistema nervioso central. Es necesaria una técnica confiable de administración de medicamentos in vivo para remielinizar las pruebas de drogas. Este protocolo describe un método basado en bomba osmótica que permite la administración de fármacos a largo plazo directamente en el parénquima cerebral y mejora la biodisponibilidad del fármaco, con una amplia aplicación en la investigación de la remielinización.

Administración de fármacos basada en bomba osmótica para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central

Aprende a implantar minibombas osmóticas en ratones para elevar glucosa en líquido cefalorraquídeo sin alterar glucosa sanguínea. Este método permite estudiar efectos cerebrales específicos y disfunción cognitiva.

Implantación de minibomba osmótica para aumentar la concentración de glucosa en líquido cefalorraquídeo de ratón

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