Name: Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprende ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en células de mamíferos bajo hipoxia. Este protocolo utiliza espectrometría de masas y trazadores isotópicos estables para evaluar la actividad de la succinato deshidrogenasa y la adaptación metabólica.

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Las figuras producidas en este manuscrito fueron creadas con BioRender.com. Agradecemos a Amy Walker por proporcionar comentarios sobre este artículo. J.B.S. fue apoyado por la Fundación Worcester para la Beca de Investigación Biomédica.

Rastreo de isótopos estables y análisis de LC-MS para medir las actividades de DHODH y SDH

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Los autores no tienen conflictos de intereses que informar.

Como la investigación emergente demuestra que las mitocondrias de los mamíferos pueden funcionar sin consumir oxígeno molecular, es de suma importancia para los investigadores emplear ensayos ortogonales, más allá de las mediciones de OCR, para cuantificar con precisión la función mitocondrial. Aquí, compilamos una serie de ensayos que se pueden usar para evaluar directamente las actividades del complejo I, complejo II, complejo V y DHODH midiendo el equilibrio mitocondrial NAD + / NADH, la utilización de aceptores de electrones terminales adaptativos, la producción de ATP, biosíntesis de pirimidina de novo y ROS derivadas de mitocondrias. En particular, estos ensayos miden más directamente la función mitocondrial que las mediciones de OCR. Además, estos ensayos proporcionan a los investigadores formas manejables de cuantificar la función mitocondrial durante la hipoxia, para la cual las mediciones de OCR son en gran medida irrelevantes debido a que el fumarato se utiliza como el aceptor terminal de electrones preferido. Finalmente, los métodos basados en la proliferación descritos aquí son más rentables que los experimentos clásicos de respirometría , proporcionando así una forma ampliamente accesible de estudiar la función mitocondrial en sistemas de mamíferos.
Existen consideraciones clave al utilizar estos ensayos para medir la función mitocondrial en células cultivadas. En cuanto a los ensayos de proliferación, es importante ajustar el número de células sembradas para la tasa de duplicación de cada línea celular. Las células deben sembrarse al menos al 10% de confluencia y con suficiente espacio para permitir tres o cuatro duplicaciones para que se puedan cuantificar las diferencias en la proliferación. Otra consideración para cada ensayo es la concentración de las moléculas pequeñas utilizadas como controles para las actividades de cada complejo ETC. Como diferentes líneas celulares pueden exhibir diferentes sensibilidades a estos inhibidores, es fundamental probar la dosis de estas pequeñas moléculas para identificar la concentración óptima.
Una limitación universal de los ensayos que estudian la función mitocondrial in vitro, incluidas las mediciones de OCR y todos los ensayos descritos aquí, es la composición metabólica del medio de cultivo. El medio de cultivo celular estándar tiende a sesgar los sistemas en niveles superficialmente altos de función mitocondrial. Por ejemplo, los niveles suprafisiológicos de glutamina aumentan su anaplerosis del ciclo25 de TCA, que alimenta la síntesis de NADH mitocondrial y, en consecuencia, aumenta la fosforilación oxidativa. Del mismo modo, la presión parcial de oxígeno oscila entre 3 mmHg y 100 mmHg (aproximadamente 0,1% -13%O2) en tejidos de mamíferos, pero es atmosférica (140 mmHg, aproximadamente 21%) in vitro26,27. Este exceso deO2 maximiza la capacidad respiratoria mitocondrial y la producción de superóxido28. Recientemente, se han hecho esfuerzos para diseñar medios de cultivo para que sean más fisiológicos29,30. En particular, el cultivo de células en medios similares al plasma humano disminuye la respiración mitocondrial en algunas líneas celulares cancerosas30, las ROS mitocondriales en las células T 31 y las adaptaciones mitocondriales a la terapéutica del cáncer32. Por lo tanto, es fundamental tener en cuenta la composición de los medios de cultivo que se utilizan y comprender cómo pueden afectar la función mitocondrial.
Otra limitación importante y universal en la interpretación de la función mitocondrial es el potencial de diferencias en el número de mitocondrias. Por lo tanto, es fundamental medir el contenido mitocondrial a través de la cuantificación del ADNmt33, la medición de la masa mitocondrial con colorantes insensibles al potencial de membrana34 o la transferencia occidental de marcadores mitocondriales. Este es un control crítico para que una disminución en el número de mitocondrias no se confunda con una disminución en la función mitocondrial.
También existen limitaciones específicas y solución de problemas que se aplican a los ensayos descritos aquí. En primer lugar, dado que las células diferenciadas no proliferan, los ensayos basados en la proliferación no serán útiles para evaluar la función mitocondrial en este contexto. Una limitación clave del protocolo de rastreo de 13C 4-aspartato para medir la actividad de DHODH es que la absorción de aspartato en las células puede ser extremadamente ineficiente35. Para superar esta limitación potencial, los investigadores pueden sobreexpresar el transportador de aspartato, SLC1A3, para facilitar la captación de 13C 4-aspartato35.
Una limitación del protocolo que utiliza el rastreo de5-glutamina 13C para medir la actividad de SDH es que este ensayo requiere que las células utilicen la vía de carboxilación reductiva para enriquecer los isotopólogos M + 3 con el fin de medir la actividad inversa. Algunas líneas celulares son incapaces de reducir el flujo de carboxilación debido a la baja expresión de citrato liasa de ATP36, la estabilización insuficiente de HIF37 o una relación α-KG:citrato demasiado baja38. Para superar esta limitación, se podría utilizar elrastreo de13 C 4-aspartato para medir las actividades de avance e inversión de los DSS7. En este ensayo, la actividad directa SDH se puede medir por la relación de fumarato M+2:succinato M+2 y la reacción inversa por succinato M+4:fumarato M+4. En particular, este rastreo elude la mayoría de las enzimas en la vía reductiva de carboxilación.
Una limitación del ensayo de actividad compleja I utilizando la reducción DCPIP como lectura es que las mitocondrias no están estructuralmente intactas. El proceso de congelación-descongelación de las mitocondrias para permitir su absorción de NADH para el ensayo ciertamente puede empañar la integridad estructural de la membrana mitocondrial39. Este ensayo debe realizarse en paralelo con ensayos como el ensayo de proliferación del complejo I para garantizar que los cambios en la actividad del complejo I observados también sean ciertos con las células intactas.
En estudios futuros, algunas de estas técnicas pueden adaptarse para medir las funciones mitocondriales in vivo utilizando organismos modelo como ratones y Caenorhabditis elegans. Los métodos actuales utilizados para medir la función mitocondrial in vivo se centran en el OCR a nivel orgánico, específicamente la tasa de intercambio respiratorio cuando se utilizan modelos de ratón. Una limitación clara de este método es que el oxígeno cumple muchas funciones bioquímicas y de señalización más allá de su papel como aceptor terminal de electrones ubicuo en el CTE mitocondrial. Por ejemplo, el oxígeno es "consumido" por la actividad catalítica de las enzimas de la familia de la dioxigenasa. Aunque estas enzimas contribuyen a la tasa de consumo de oxígeno celular, no participan, regulan ni reflejan la función mitocondrial. Los experimentos clásicos de respirometría in vitro típicamente controlan el "OCR no mitocondrial", mientras que los experimentos de relación de intercambio respiratorio (RER) del organismo no pueden controlar esto, lo que limita la interpretación del RER como una métrica para la función mitocondrial in vivo. Sin embargo, es factible adaptar los protocolos para medir la actividad de DHODH a través del trazado de 13 C 4-aspartato, la actividad del complejo II a través del rastreo de 5-glutamina 13 C, la actividad del complejo I en mitocondrias purificadas de tejidos y ROS mitocondriales utilizando compuestos amigables con LC-MS como MitoB para medir la función mitocondrial in vivo . Estos ensayos directos para interrogar las funciones mitocondriales, en combinación con los experimentos clásicos de respirometría, proporcionan a los investigadores una evaluación más completa y precisa de la función mitocondrial en células y tejidos de mamíferos.

La función mitocondrial es una métrica crítica de la salud celular, ya que sostiene funciones biosintéticas, bioenergéticas y de señalización clave en células de mamíferos1. La gran mayoría de las funciones mitocondriales requieren flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones (ETC), y las interrupciones en el flujo de electrones en el ETC causan enfermedad mitocondrial grave2. El ETC se compone de una serie de reacciones de reducción y oxidación (redox) que están incrustadas en la membrana mitocondrial interna, y estas reacciones de transferencia de electrones liberan energía libre que puede aprovecharse para apoyar la síntesis de ATP, procesos fisiológicos como la termogénesis, vías biosintéticas como la biosíntesis de novo pirimidina y el equilibrio del estado redox de cofactores como NADH. Los complejos ETC I y III producen especies reactivas de oxígeno (ROS)3,4,5, que, a su vez, regulan vías clave de señalización como HIF, PI3K, NRF2, NFκB y MAPK 6. En consecuencia, las métricas del flujo de electrones en el ETC se utilizan clásicamente como un proxy para la función mitocondrial en las células de mamíferos.
Los experimentos de respirometría se emplean con frecuencia para medir la función mitocondrial en células de mamíferos. Dado que elO2 es el aceptor terminal de electrones más ubicuo para el ETC de mamíferos, su reducción se utiliza como un proxy para la función mitocondrial. Sin embargo, la evidencia emergente demuestra que las mitocondrias de mamíferos pueden emplear fumarato como aceptor de electrones para mantener las funciones mitocondriales que dependen del CTE, incluida la biosíntesis de pirimidina de novo 7, la oxidaciónde NADH7 y la desintoxicación del sulfuro de hidrógeno8. Por lo tanto, en ciertos contextos, especialmente en ambientes hipóxicos, las mediciones de la tasa de consumo deO2 (OCR) no proporcionan una indicación precisa o exacta de la función mitocondrial.
Aquí, describimos una serie de ensayos que se pueden emplear para medir la función mitocondrial independientemente del OCR. Proporcionamos ensayos para medir directamente la oxidación compleja de NADH mediada por I, la biosíntesis de novo pirimidina mediada por dihidroorotato deshidrogenasa, la síntesis de ATP dependiente del complejo V, la direccionalidad neta del complejo succinato deshidrogenasa (SDH) y las ROS derivadas de mitocondrias. Estos ensayos están destinados a realizarse en células de mamíferos cultivadas, aunque muchos pueden adaptarse para estudiar las funciones mitocondriales in vivo. En particular, los ensayos descritos en este protocolo son mediciones más directas de las funciones mitocondriales que el OCR. Además, permiten la medición de la función mitocondrial en hipoxia, un contexto en el que el OCR no es una medida indicativa. Tomados en conjunto, estos ensayos, en combinación con experimentos clásicos de respirometría, proporcionarán a los investigadores una evaluación más completa de la función mitocondrial en células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Tubo de 1,5 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 2,0 mL</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Cell Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-glutamina</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 150 mm</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- diclorofenolinadofenol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella 500 mL, 0.22 y micro; m, PES 9 Diámetro de membrana de 9 mm</td><td>Tratamiento</td> celular <td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Elevador de células, doble extremo plano y angosto Tratamiento de</td><td>células</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Trampa fría</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor completo de la proteasa Tabletas</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Coulter Tazas de Mostrador</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubiquinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin glucosa</td><td>Gibco 11966025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal inactivado por calor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td>Hidróxido</tr><tr><td>de amonio al 35% de</td> <td>grado HPLCThermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td> de grado HPLC <td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo de grado</td><td>HPLC Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico de grado HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td> de grado HPLC <td></td> 563935 <td></td></tr><tr><td>MeOH Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>de grado HPLC</td><td></td>900688</tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>línea celular de osteosarcome humano 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de isotono</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Trituradora de tejidos, tamaño 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Medios DMEM sin piruvatos</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Espectrómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver Incubadora</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrivap Refrigerada Concentradora de vacío de sobremesa</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; m 150 x 2,1 mm columna analítica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC kit de protección</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sodio, Pellets</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidroperóxido de terc-butilo</td><td>Sigma-Aldrich 458139</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter Recuento y tamaño de partículas analizador</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

El flujo de electrones en la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC) apoya funciones biosintéticas, bioenergéticas y de señalización multifacéticas en células de mamíferos. Como el oxígeno (O2) es el aceptor terminal de electrones más ubicuo para el CTE de mamíferos, la tasa de consumo deO2 se usa con frecuencia como un proxy para la función mitocondrial. Sin embargo, la investigación emergente demuestra que este parámetro no siempre es indicativo de la función mitocondrial, ya que el fumarato puede emplearse como un aceptor de electrones alternativo para mantener las funciones mitocondriales en la hipoxia. Este artículo recopila una serie de protocolos que permiten a los investigadores medir la función mitocondrial independientemente de la tasa de consumo deO2. Estos ensayos son particularmente útiles cuando se estudia la función mitocondrial en ambientes hipóxicos. Específicamente, describimos métodos para medir la producción de ATP mitocondrial, la biosíntesis de novo pirimidina, la oxidación de NADH por el complejo I y la producción de superóxido. En combinación con experimentos clásicos de respirometría , estos ensayos ortogonales y económicos proporcionarán a los investigadores una evaluación más completa de la función mitocondrial en su sistema de interés.

Las actividades de DHODH, complejo I y complejo V pueden evaluarse mediante ensayos de proliferación. Tras la privación de uridina del medio de cultivo, las células se vuelven más dependientes de la vía de novo para la biosíntesis de pirimidina. Por lo tanto, cuando las células fueron desafiadas a proliferar en un medio libre de uridina, fueron más sensibles a la inhibición de la actividad de DHODH por brequinar que las células cultivadas en un medio que contiene uridina (Figura 6A). Del mismo modo, la privación de piruvato del medio de cultivo hace que las células sean más dependientes de la actividad del complejo I para la proliferación. Por lo tanto, cuando las células fueron desafiadas a proliferar en un medio libre de piruvato, fueron más sensibles a la inhibición de la actividad del complejo I por rotenona que las células cultivadas en un medio que contiene piruvato (Figura 6B). La actividad del complejo V se puede evaluar desafiando a las células a proliferar en un medio que contenga galactosa en lugar de glucosa. Como la galactosa produce cero ATP neto en la glucólisis, las células que crecen en este combustible dependen más de la síntesis de ATP mitocondrial a través de la actividad del complejo V. Por lo tanto, las células que proliferan en un medio que contiene galactosa fueron más sensibles a la inhibición del complejo V por oligomicina que las células que proliferan en un medio que contiene glucosa (Figura 6C).
La actividad de SDH puede medirse utilizando el rastreo de13 C 5-glutamina y monitorizando su incorporación en isótopologos defumarato y succinato. En condiciones tratadas con vehículo, el complejo SDH favoreció la actividad hacia adelante, y la incorporación de 13 C 4-succinato en 13 C4-fumarato fue mayor que la incorporación de 13 C 3-fumarato en 13C 3-succinato (Figura 7). En condiciones tratadas con antimicina, el complejo SDH favoreció la actividad inversa, y la incorporación de 13 C 3-fumarato en 13 C3-succinato fue mayor que la incorporación de 13 C 4-succinato en 13C 4-fumarato (Figura 7).
La producción de superóxido dentro de las mitocondrias se puede medir utilizando el reportero fluorescente MitoSox, que genera 2-hidroxi-mitoetidio al reaccionar con el superóxido. En este estudio, las células tratadas con MitoSox en presencia de peróxido de hidrógeno de terbutilo tenían niveles más altos de 2-hidroxi-mitoetidio de una manera que fue suprimida por la adición de NAC, un antioxidante que apaga las ROS celulares (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Figura 1: Base mecanicista para el ensayo de proliferación compleja V. Oxidación de glucosa y galactosa vía glucólisis. La glucosa produce dos ATP netos de la glucólisis, mientras que la galactosa produce ATP neto cero porque se requiere la síntesis de UTP para la UDP-galactosa. Por lo tanto, las células cultivadas en galactosa son más dependientes de la síntesis de ATP mitocondrial debido a la falta de ATP producido por la glucólisis. Abreviaturas: GALK = galactokinase; GALT = galactosa-1-fosfato uridiltransferasa; PGM1 = fosfoglucomutasa 1; GPI = glucosa-6-fosfato isomerasa, UGP = UDP-glucosa pirofosforilasa; GALE = UDP-galactosa-4-epimerasa; NDK = nucleótido difosfato quinasa; UMPK = uridina monofosfato quinasa; HK = hexoquinasa; PFK = fosfofructoquinasa; ALDO = aldolasa; ITP = triosafosfato isomerasa; GAPDH = gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; PGK = fosfoglicerato quinasa; PGM = fosfoglucomutasa; ENO = enolasa; PK = piruvato quinasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Figura 2: Base mecanicista para el ensayo complejo de proliferación I. Esquema de las vías metabólicas que se alteran tras la inhibición de la actividad del complejo I. En medios con alto contenido de piruvato, la inhibición del complejo I se deriva a través de la oxidación de NADH mediada por LDH. En medios de bajo piruvato, esta adaptación es menos factible, lo que hace que las células dependan más de la actividad del complejo I para reoxidar NADH. Abreviaturas: LDH = lactato deshidrogenasa; Ciclo de TCA = ciclo de ácido tricarboxílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Figura 3: Esquema de la reacción de DHODH tras el trazado de 13Cde 4-aspartato. Brequinar inhibe la oxidación del dihidroorotato a orotado, evitando así la síntesis posterior de UMP. 13El4-aspartato C se incorpora a 13C3-UMP a través de la actividad DHODH. Abreviaturas: OMM = membrana mitocondrial externa; IMM = membrana mitocondrial interna; DHODH = dihidroorotato deshidrogenasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Figura 4: Medición de la actividad directa e inversa del complejo II a través del trazado de5-glutamina 13C. Para medir la actividad directa del complejo II (izquierda), se monitoriza la incorporación de 13 C 5-glutamina en 13 C 4-succinato y 13C 4-fumarato. Para medir la actividad inversa del complejo II (derecha), se monitoriza la incorporación de 13 C 5-glutamina en 13 C 3-succinato y 13C 3-fumarato. Abreviaturas: SDH = succinato deshidrogenasa; CytC = citocromo C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Figura 5: Reacción de MitoSox Red con superóxido. La reacción de MitoSox con superóxidos mitocondriales para formar 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Figura 6: Ensayos basados en la proliferación para medir la función mitocondrial (A) Proliferación de células de osteosarcoma 143B tratadas con brequinar 5 uM, un inhibidor de DHODH, en medio con uridina de ±100 ug/mL. Los datos son medias ± SEM; N = 3 por condición. (B) Proliferación de células de osteosarcoma 143B tratadas con rotenona 2 uM, un inhibidor del complejo I, en medio con piruvato de ±5 mM. Los datos son medias ± SEM; N = 3 por condición. (C) Proliferación de células de osteosarcoma 143B tratadas con oligomicina 5 uM, un inhibidor del complejo V, en medio con 10 mM de glucosa o 10 mM de galactosa como única fuente central de carbono. Los datos son medias ± SEM; N = 3 por condición. * indica p &lt; 0.05 usando una prueba ANOVA unidireccional en Graphpad Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Figura 7: Rastreo de 13C5-glutamina para medir la actividad del complejo II. Oxidación de succinato y reducción de fumarato (SDH inversa) en células Caki1 y DLD1 tratadas con DMSO y 500 nM antimicina A. Los datos representan la media ± SEM; N = 3 por condición. indica p &lt; 0,05 utilizando una prueba t no pareada en GraphPad Prism. Abreviaturas: SDH = oxidación de succinato; SDH inversa = reducción del fumarato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Figura 8: Ensayo MitoSox basado en LCMS para detectar superóxido. Cromatograma iónico extraído de 2-OH-Mito E2+ aislado de células Caki1 tratadas con MitoSox durante 30 min en presencia de tBuOOH ± NAC. Abreviaturas: LCMS = cromatografía líquida-espectrometría de masas; NAC = N-acetilcisteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Composición de reactivos, tampones y medios utilizados en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Nuestra investigación se centra en cómo las mitocondrias detectan y se adaptan a los factores estresantes metabólicos. Un factor estresante metabólico clave es la hipoxia, que ocurre cuando las células carecen de oxígeno. Estamos desarrollando mejores ensayos para estudiar la función mitocondrial en ambientes con poco oxígeno.Se empleó espectrometría de masas de mayor resolución para estudiar los niveles de metabolitos celulares y tisulares. Utilizamos estudios de rastreo de isótopos estables para rastrear el destino de metabolitos específicos y descubrir nuevas vías metabólicas relevantes para la fisiología de mamíferos sanos y enfermos. El grupo ha descubierto que las mitocondrias de los mamíferos pueden mantener funciones críticas en ambientes con poco oxígeno.Mecánicamente, emplean fumarato como un cetro electrónico alternativo para la cadena de transporte de electrones. Este protocolo recopila varios ensayos que los investigadores pueden usar para evaluar mejor la función mitocondrial en células de mamíferos. Es importante destacar que estos protocolos se pueden utilizar para estudiar la función mitocondrial en hipoxia, ya que los experimentos clásicos de respirometría no serán suficientes.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

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Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

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